İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kültürlenmiş hücrelerin ömrü boyunca hücreden hücreye temasın sürdürülmesi için nörosferleri verimli bir şekilde geçmektir. Bu teknik, insan nöral progenitör hücreleri için gerekli genişleme koşullarını yaratır. Bu, aynı hücrelerin iki T 1 75 şişesinin birleştirilmesi ve konik bir tüpe aktarılmasıyla elde edilir, bu da kürelerin bir Petri kabına aktarılmasına izin verir, ikinci bir adım olarak askıya alınmış nörokürelere yoğunlaştırılmış Petri kabı üzerinde yönetilebilir bir kütleye dönüştürülür, bu da bıçağın H NPC'leri küçük kümeler halinde kesmesine izin verir.

Daha sonra, hücreleri Petri kabından çıkarmak ve yeni şişelere doldurmak için pasajlı veya doğranmış nöroküreler yeniden askıya alınır. Doğrama tekniğinin, standart enzimatik yaklaşımla geçirilen hücrelere kıyasla uzun vadeli logaritmik büyüme oranlarını gösteren genleşme eğrilerine dayalı uzun vadeli bir büyüme stratejisi sağladığını gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin görsel gösterimi bir küre olarak kritik öneme sahiptir.

Yoğuşma adımlarının yazılı olarak tanımlanması zordur. Sürece yardımcı olacak birkaç püf noktası da vardır. Fazla ortam Petri kabından tamamen çıkarılmazsa, küreler daha küçük kümelere ayrılmak yerine ortamın içinde basitçe itilecektir.

Bu prosedüre, H NPC'lerin şişesinin ortam rengini ele alarak başlayın. Hücreleri gözlemlemek için şişeyi mikroskop altında tarayın. Mümkünse, birkaç kürenin boyutunu incelemek için bir radikal kullanın.

Birçok kürenin çapı 300 mikrometre veya daha büyükse, doğrama işlemine devam edin ve hücreleri her yedi ila 10 günde bir doğrayın. Ardından şişeyi tekrar kuluçka makinesine yerleştirin ve doğrayıcıyı kurun. Doğrayıcının güç anahtarını açın.

BSC'de doğrama kalınlığını 200 mikrometreye ve bıçak kuvvetini 180 dereceye veya saat dokuz konumuna ayarlayın. Ardından, otomatik hız düğmesinin mümkün olduğunca saat yönünün tersine döndürüldüğünü onaylayın. Ardından masa serbest bırakma düğmesini mümkün olduğunca sağa hareket ettirin ve plaka tutucunun sabit olduğunu onaylayın.

Kolu maksimum seviyesine kaldırmak için manuel kol manipülatörünü saat yönünde çevirin. Bundan sonra, steril bir çift kenarlı doğrama bıçağını aseptik olarak doğrayıcı kol cıvatasına aktarın. Bir çift forseps kullanarak, forseps kullanarak tokayı bıçağın üzerine yerleştirin.

Tokanın kavisli kısmı kolun üst kenarının üzerinde olmalıdır. Ardından, tokayı kolun üzerinde tutun ve somunu cıvatanın üzerine sabitleyin. Steril somun sürücüsü somunu çeyrek tur gevşek bırakırken.

Bu prosedürde, önerilen miktarda bakım ortamını yeni şişeye aktarın. Bundan sonra, hücreleri aseptik olarak inkübatörden BSC'ye aktarın. Şişeyi bir tüp rafına yaslayın ve kürelerin şişeye yerleşmesine izin verin.

Biri yerleşti. 12 mililitreye kadar süpernatan aspire edildi. 10 mililitrelik bir serolojik pipetle, şişenin yüzeyinden gevşek bir şekilde yapışan tüm küreleri durulayın.

Gerektiği kadar tekrarlayın ve kürelerin Rens arasına yerleşmesine izin verin. Ardından, önerilen şartlandırılmış ortam hacmini yeni şişeye aktarın. Ardından kalan tüm şartlandırılmış ortamı ve küreleri yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Kürelerin yerleşmesine izin verin ve kullanılmış şişeyi atın. Bundan sonra, hücreleri 15 mililitrelik konik tüpten mümkün olan en düşük hacimde 60 milimetrelik Petri kabına veya şim diskine yavaşça aktarın. Kalan şartlandırılmış ortamı, doğradıktan sonra hücreleri bulaşık sonrası durulamak için kullanılacağı için saklayın.

Ortamın ve çanak üzerindeki kürelerin kapladığı yüzey alanını en aza indirmeye çalışın. Ardından, süper natini 15 mililitrelik konik tüpe geri aktararak küre havuzunu yoğunlaştırmaya başlayın. Aerosol bariyer uçlu bir mikro pipetleyici ile medya hücresi havuzunun üstünden mümkün olduğunca fazla medyayı çıkarın.

Küreler olmadan ortamı çıkarmak mümkün olmayana kadar, havuzu dışarı yayın. Yüzey alanını artırmak için pipet ucunun yan tarafını kullanarak, Petri kabını hafifçe eğin ve tüm küreleri havuzun bir tarafına nazikçe kaydırmak için pipet ucunun yan tarafını kullanın. Tüm hücrelerin yeri değiştirildikten sonra, ortamın kürelerden ayrılmasını sağlamak için Petri kabını yavaşça ters yöne çevirin.

Daha sonra, temizlenmiş ortamı 15 mililitrelik konik tüpe geri aktarın. Tüm küreleri nazikçe Petri kabının ortasına geri kaydırmak için pipet ucunun yan tarafını kullanın. Yani havuzun çapı 0,5 ila 2,4 santimetredir.

Küre havuzunun derinliğini sığ tutmak önemlidir. Havuz çok derinse, doğrama sırasında küreler bir kenara itilecektir. Şimdi, Petri kabını plaka tutucuya aktarın ve plaka tutucu kancalarının altına sabitleyin.

Plaka tutucuyu sola kaydırmak için tabla serbest bırakma düğmesini kullanın, böylece bıçak kürelerden arındırılır ve dişliye kilitlenir. Ardından, manuel manipülatör düğmesini bıçak petri kabına düz bir şekilde oturana kadar saat yönünde çevirerek doğrayıcı kolunu indirin. Somunu sıkarken kol yuvasına bastırın.

Ardından sıfırlama düğmesine basın. Bir kez Petri kabını bir elinizle sabitlerken otomatik kol manipülatör düğmesini saat yönünde 90 derece veya saat 12 konumuna çevirin ve tüm küreler doğrandığında doğramaya başlayın. Plaka tutucuyu 90 derece döndürün.

Ardından cıvatayı gevşetin, kolu indirin ve somunu tekrar sıkın. Doğrama işlemini tekrarlayın. Bundan sonra aseptik olarak, Petri kabını plaka tutucusundan BSC'deki bir çalışma alanına aktarın.

Bir mililitre şartlandırılmış ortamı doğranmış kürelerin üzerine aktarın. Daha sonra doğranmış küreleri yavaşça yeniden askıya alın ve 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının ve doğranmış küreleri toplamak için gerektiği kadar tekrarlayın.

Şartlandırılmış ortamın ve doğranmış kürelerin hacmini ölçün. Tablo iki sütun E'de önerilen hacmi elde etmek için uygun miktarda bakım ortamı ekleyin.Bundan sonra, küre süspansiyonunu her yeni şişeye Eloqua, küre süspansiyonunu her seferinde yalnızca bir şişeye aktarın ve transferler arasındaki küreleri yeniden süspanse edin. Her şişedeki son hacim, tablo ikide önerilen hacme eşit olmalıdır Sütun F. Doğranmış h NPC'leri inkübatöre yerleştirin.

Bu şekil, 19. pasajda dondurulan, daha sonra doğrama yöntemiyle geçilen nörosferlere kıyasla enzimatik ayrışma kullanılarak çözülen ve yapışık bir tek tabaka olarak genişletilen H NPC'lerin öngörülen hücre sayılarını göstermektedir. İşte 10 x büyütmede önceden doğranmış ve doğranmış kürelerin temsili görüntüleri. Bu görüntü, bir gün boyunca kaplanan ve yuva ve ekspresyon için boyanan çözülme geçişi 29 H NPC'leri gösterirken, bu görüntü, büyüme faktörlerinin yokluğunda yedi gün boyunca kaplanan ve GFAP ve beta üç tübülin için boyanan çözülme geçişi 29 H NPC'yi göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin ve kültürün ömrü boyunca hücreden hücreye teması sürdüren HBC'leri geçmek için otomatik doğrama tekniğinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedür, pluripotent hücrelerden veya kardiyo kürelerden türetilen nöro kök hücreler gibi çok sayıda hücre tipine uyarlanabilir.