Name: ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Öğrenin, ChroP yaklaşımıyla kromatin immünopresipitasyonu ve kütle spektrometrisi kullanarak fonksiyonel olarak farklı kromatin alanlarının proteomik bileşimini nasıl karakterize edeceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma aslında Mol Cell Proteomics yayınlandı. Soldi M. ve Kromatin Fonksiyonel Alanlar Bonaldi T. Proteomic İncelenmesi Farklı Heterokromatin Bileşenler MCP arasında Roman birlikteliğini ortaya çıkarır. 2013; 64-80: 12. © Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için American Society. Biz yazının eleştirel okuma için Roberta Noberini (Teknoloji ve Ieo İtalyan Enstitüsü, İtalya) teşekkür ederim. TB iş Giovanni Armenise-Harvard Vakfı Kariyer Geliştirme Programı, Kanser Araştırma ve İtalyan Sağlık Bakanlığı için İtalyan Derneği hibe tarafından desteklenmektedir. MS çalışma Firc burs ile desteklenmiştir.

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+a+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21, 381-395 (2011).</li>
<li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications%3A+lessons+from+professional+pocket+pickers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Spotswood, H. T., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increasingly+complex+code%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">An increasingly complex code.</a> J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).</li>
<li>Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+for+the+analysis+of+chromatin+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics.</a> Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).</li>
<li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics%3A+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).</li>
<li>Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+histone+code+with+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry.</a> Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).</li>
<li>Taverna, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+combinatorial+linkage+between+methylation+and+acetylation+on+histone+H3+N+termini%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).</li>
<li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).</li>
<li>Villar-Garea, A., Imhof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The analysis of histone modifications.</a> Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142, 810-821 (2010).</li>
<li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+anchoring+of+TFIID+to+nucleosomes+by+trimethylation+of+histone+H3+lysine+4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4.</a> Cell. 131, 58-69 (2007).</li>
<li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interaction+proteomics+and+genome-wide+profiling+of+epigenetic+histone+marks+and+their+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers.</a> Cell. 142, 967-980 (2010).</li>
<li>Bartke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-interacting+proteins+regulated+by+DNA+and+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation.</a> Cell. 143, 470-484 (2010).</li>
<li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li>
<li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+investigation+of+chromatin+functional+domains+reveals+novel+synergisms+among+distinct+heterochromatin+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components.</a> Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
<li>Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications.</a> Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).</li>
<li>Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILAC-based+proteomic+analysis+to+dissect+the+%26%2334%3Bhistone+modification+signature%26%2334%3B+of+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">SILAC-based proteomic analysis to dissect the &#34;histone modification signature&#34; of human breast cancer cells.</a> Amino Acids. 41, 387-399 (2011).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal Chem. 75, 663-670 (2003).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).</li>
<li>Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+of+histones+H3.2+and+H3.3+in+Suz12-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+distinct%2C+dynamic+post-translational+modifications+at+Lys-27+and+Lys-36%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).</li>
<li>Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H3+lysine+9+creates+a+binding+site+for+HP1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins.</a> Nature. 410, 116-120 (2001).</li>
<li>Bannister, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+recognition+of+methylated+lysine+9+on+histone+H3+by+the+HP1+chromo+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain.</a> Nature. 410, 120-124 (2001).</li>
<li>Ram, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+patterning+of+chromatin+regulators+uncovered+by+genome-wide+location+analysis+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells.</a> Cell. 147, 1628-1639 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Beck, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+in+epigenetic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry in epigenetic research.</a> Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).</li>
<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+chromatin+states+for+systematic+annotation+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome.</a> Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).</li>
<li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).</li>
<li>Young, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+characterization+of+combinatorial+histone+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput characterization of combinatorial histone codes.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).</li>
<li>Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+characterization+of+human+histones+in+the+H2A+gene+family+by+top+down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yakın zamanda ChroP, kromatin protein bileşenlerinin büyük ölçekli karakterizasyon için nicel bir strateji tarif edilmiştir. ChroP epigenetik alanında kullanılan iki tamamlayıcı yaklaşımlar, Chip ve MS, güçlerini istifade ve kendi sınırlarını aşma birleştirir. Derin dizileme (ChIP-Seq) birleştiğinde ChIP birkaç nükleozomların 35 çözünürlükte histon modifikasyonları genom haritalama sağlar. Duyarlılık için avantajlı olsa da, antikor-bazlı deneyler benzer değişiklikler ayırt etme yeteneği ve histon kod 36<...

Kromatin bütün DNA dolayımlı süreçler için temel şablon olarak dahil olan bir yüksek dinamik bir nükleoprotein karmaşıktır. Nükleozom kromatin temel tekrarlanan birimi olan ve DNA 147 bp 1,2 sarılır etrafında her bir kanonik histon H2A, H2B, H3 ve H4, iki protein molekülü ihtiva eden bir oktamer çekirdek oluşur. Tüm çekirdek histon bir küresel etki ve nükleozom dışında çıkıntı esnek bir N-terminal &quot;kuyruk&quot; olarak yapılandırılmıştır. Kromatin yapısı ve dinamikleri düzenlenmesi için önemli mekanizmalardan biri esas olarak histon 3,4 N-uçlarının üzerinde meydana gelen kovalent bir post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) dayanmaktadır. Histon modifikasyonlar histon-DNA arasında veya nükleozom arasında temas değiştirerek, yüksek dereceli kromatin yapısını değiştirmeden ve böylece DNA-bağlayıcı proteinler (sis mekanizmaları) erişilebilirliğini kontrol edilmesi yoluyla işlev görebilir ya da dockin olarak hareket ederekdüzenleyici proteinler için, ya da tek bir birim ya da multimerik kompleksleri gömülü olarak g siteleri. Bu gibi düzenleyici proteinlerin farklı şekillerde işlev gösterebilir: doğrudan gen ifadesi (örneğin, TAF proteinleri) modüle edilmesiyle, ya da nükleozom konumlandırma (yani kromatin kompleksler yeniden) değiştirerek ya da başka bir histon artıkları (metil-transferaz ya da örneğin proteinler asetil-değiştirerek transferaz aktivitesi) (trans mekanizmaları) 5. Belirli kromatin loci farklı PTM desenler küme farklı sitelerde farklı modifikasyonlar yatan DNA&#39;nın fonksiyonel durumunu aracılık moleküler kodu üretmek için sinerji olabilir hipotezin hazırlanmasına neden olduğunu gözlem. &quot;Histon kodu hipotezi&quot; yıllarda büyük uzlaşma kazanmıştır ancak deneysel doğrulama teknik sınırlamalar 6,7 ile geri düzenlenen olmuştur. Kütle spektrometrisi (MS) bazlı bir proteomik olarak ortaya çıkmıştırgüçlü bir araç histon modifikasyonu desenleri haritasına ve kromatin-bağlayıcı proteinlerin 8 karakterize etmek. MS bir peptidin deneysel ve kuramsal kütle arasında belirli bir modifikasyonunu Δmass olarak tespit eder. Bireysel histonların seviyesinde, MS bunların 9-14 arasında yeni modifikasyon ve açığa etkileşimlere saptanmasını sağlayan, PTMS eşlemek için bir ilgili ve kapsamlı bir yöntem sağlar. Son yıllarda, bir dizi strateji sağlam mitotik kromozom 15, çözünür HPTM bağlayıcı proteinlerin 16-18 tanımlanmasında ve özel kromatin bölgelerin izolasyonu ve analiz karakterizasyonu dahil olmak üzere, kromatin proteomik bileşimini incelemek için geliştirilmiştir (örneğin telomer) 19,20. Ancak, histon PTMS, varyantları ve kromatin ile ilişkili proteinler arasındaki lokus spesifik sinerji soruşturma hala tamamlanmadı. Burada, biz (ChroP adında yeni bir yaklaşım, tarifBiz verimli, fonksiyonel olarak farklı kromatin alanları tanımlamak için gelişmiş olduğunu Chro matin P roteomics) 21. Bu yaklaşım, zenginleştirilmiş numunenin etkin MS-tabanlı proteomik analizi için Kromatin immüno-çökeltmesi (çip), epigenetik araştırmalarda kullanılan köklü bir protokol, uyum sağlar. Bu giriş ve MS ile ele alınan sorun olarak kullanılan kromatin türüne bağlı olarak, iki farklı protokol geliştirdik; özellikle: MNase ile sindirilmiş sabitlenmemiş yerli kromatin 1) yonga mono-nükleozom arındırmak ve ko-ilişkilendirme hPTMs (N-ChroP) incelemek için kullanılır; 2) sonikasyon ile parçalanır çapraz bağlantılı kromatin ChIP proteinleri (X-ChroP) bağlayıcı tüm eş zenginleştirmek kromatin karakterize etmek için bir SILAC bazlı interactomics stratejisi ile kombinasyon halinde kullanılır. Biz burada İmmünopresipitasyon adımlar için yem olarak H3K9me3 kullanarak, heterokromatine zenginleştirmek ve eğitim için N-ve X-ChroP kombinasyonunu göstermektedir. ChroP kullanılması uzatılabilirBöylece epigenetik çeşitli uygulamalara önünü, ayrı kromatin bölgeleri, ya da farklı bir işlevsel durumuna geçiş sırasında aynı bölge içinde kromatin bileşimindeki değişiklikleri ya çalışmak için.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Canlandırıcı</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Tıbbi</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz FBS Canlandırıcı</td><td></td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lizin 0 (12C6 14N2 L-lizin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginin 0 (12C6 14N4 L-arginin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lizin 8 (13C6 15N2 L-lizin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginin 10 (13C6 15N4 L-arginin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokokal Nükleaz</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Tam, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3 diyaliz borusu, 3.5K MWCO, 18mm düz genişlik, 50 ayak uzunluğu</td><td>Spectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H3 tri-metillenmiş K9-ChIP sınıfı</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histon H3 peptit tri-metil K9 & nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex% 4-12 & nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Bis-Tris Jel&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidal Mavi Boyama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Örnek Tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aceti anhidrit-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[başlık]</td></tr><tr><td>Formik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid & % 99 (HPLC), kristalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Sınıfı Modifiye Tripsin, Dondurulmuş 100 & mu; g (5 & kez; 20 & mu; g)</td> <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360 & mu; m x Kimlik 75 & mu; m, ipuçları ID 8 & mu; m kaplamasız Pk 5</td><td>Mikrokolon Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 ve mikro; m&nbsp; &nbsp; %15 C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Karbon ekstraksiyon diski, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Katyon ekstraksiyon diski</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

chrop yaklaşım kromatin odağı özgü proteomic manzaralar teşrih chip ve kütle spektrometre birleştirir

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Kromatin çeşitli DNA-bağımlı işlemlerini denetleyen DNA ve proteinlerden oluşan bir derece dinamik Nukleoprotein karmaşıktır. Belirli bölgelerdeki kromatin yapısı ve fonksiyonu transkripsiyon faktörleri ve DNA da dahil olmak üzere metilasyon histon post-translasyonel modifikasyonlar (hPTMs) ve türevleri, kromatin bağlayıcı proteinler, lokal zenginleşmesi ile düzenlenir. Farklı fonksiyonel bölgelerde kromatin kompozisyon proteomik karakterizasyonu kadar kütle spektrometresi (MS) tarafından daha sonraki derinlemesine analiz için uygun saflıkta ve miktarda bu tür etki zenginleştirmek için verimli protokollerin olmaması engel olmuştur. Biz burada, hazırlayıcı Kromatin immüno-çökeltme, özellikleri, hPTMs açısından, varyantları ve co-ilişkili olmayan proteinler ayrı histonic kromatin bölgeleri izole etmek için kullanılır ve bu arada ChroP (Chro kaska roteomics P) olarak adlandırılan, yeni tasarlanmış kromatin proteomik strateji tarif MS ile analiz edilmiştir. Biz he göstermekhiston H3 lizin 9 arasında tri-metilasyon varlığı ile işaretlenir transkripsiyonel sessiz heterokromatik bölgelerin zenginleştirme ve analizi için ChroP kurulmasına re. Elde edilen sonuçlar iyice heterokromatinin proteomesini karakterize ve kromatin farklı protein belirleyicileri etkileşim ve lokus spesifik yapısal ve işlevsel yapılandırmaları kurmak synergize nasıl anlamak için güçlü analitik strateji olarak bunu kanıtlamak içinde ChroP potansiyelini göstermektedir.

Kromatin immüno genomu boyunca bir protein veya bir histon modifikasyonunun lokalizasyonu profil için kullanılan güçlü bir tekniktir. Bir proteomik eşdeğer olarak, çip, ilgilenilen değiştirilmesi veya protein ile birlikte imüno &quot;yem&quot; olarak kullanılan nicel ve nitel olarak hPTMs, histon varyantları ve kromatin bağlayıcı proteinleri belirlemek için MS tabanlı proteomik izlemektedir. N-ChroP yaklaşımda, kromatin MNase (Şekil 1 B) ile sindirilmiş edildiği Şekil 1A, yerli Chip, be...

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Bu prosedürün genel amacı, farklı unsurların transkripsiyonel durumu belirlemek için nasıl sinerji oluşturduğunu anlamak amacıyla, fonksiyonel olarak farklı kromatin bölgelerinin proteomik kompozisyonunu karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle kültür hücrelerinden çekirdeklerin hazırlanması ve kromatinin enzimatik veya mekanik yollarla uygun uzunluktaki fragmanlara sindirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ya bir histon post-translasyonel modifikasyonuna ya da ilgilenilen bölgeyi spesifik olarak işaretlediği bilinen bir proteine karşı yem antikorlar kullanılarak immünopresipitasyon yoluyla, toplam kromatin içerisinden belirli bir fonksiyonel bölgenin saflaştırılmasıdır.Ardından, immünopurifiye edilmiş kromatin proteinleri SDS page ile ayrılarak kütle spektrometrisi öncesinde jel içi sindirime tabi tutulur. Bir sonraki adım, yüksek çözünürlüklü bir cihazda sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi analizidir. Son olarak, kütle spektrometrisi ham verileri ad hoc yazılımlar ile analiz edilir ve ardından, histon modifikasyonlarını ve zenginleşen ko-proteinleri belirlemek ve miktarlarını saptamak için spektrumların manuel incelemesi yapılır; bu işlem sırasıyla, çöktürülmüş materyald

the-chrop-approach-combines-chip-mass-spectrometry-to-dissect-locus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir...

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca...

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

Belirli genomik bölgelerle ilişkili moleküllerin tanımlanması, bu bölgelerin fonksiyonlarının düzenlenme mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Bu protokol, belirli bir genomik bölge ile ilişkili proteinlerin ve RNA'ların tanımlanması için tasarlanmış DNA bağlayıcı molekül aracılı kromatin immünopresipitasyonu (enChIP) gerçekleştirme prosedürlerini açıklar.

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Bu roman proteinler DNA etkileşim belirli hedef loci, çapraz kromatin sonraki proteomik analizleri için yakalanması fingerprinting dayanarak, tanımlamak için bir yöntemdir. Potansiyel proteinler, ne de hücre değişiklikleri hakkında hiçbir ön bilgi gerekli. Başlangıçta Maya için geliştirilen, teknoloji şimdi memeli hücreleri için adapte edilmiştir.

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

CUT&amp;RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&amp;RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Uzaysal analiz için euchromatin, heterokromatin ve RNAP II'nin tekrarlanabilir haritalanmasını sağlayan üç renkli kromatin tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) boyama ve analiz protokolü sunuyoruz. Bu protokol, kromatinle ilişkili hedefler dahil olmak üzere yoğun nükleer ortamlarda verimli çok renkli etiketleme sağlar ve güvenilir eşzamanlı tespiti sağlar.

Yoğun Nükleer Ortamda Kromatinin Araştırılması İçin Çok Etiketli Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskopi Protokolü

Öğrenin, ChroP yaklaşımıyla kromatin immünopresipitasyonu ve kütle spektrometrisi kullanarak fonksiyonel olarak farklı kromatin alanlarının proteomik bileşimini nasıl karakterize edeceğinizi.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Daha fazla video keşfet