Name: ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Öğrenin, ChroP yaklaşımıyla kromatin immünopresipitasyonu ve kütle spektrometrisi kullanarak fonksiyonel olarak farklı kromatin alanlarının proteomik bileşimini nasıl karakterize edeceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma aslında Mol Cell Proteomics yayınlandı. Soldi M. ve Kromatin Fonksiyonel Alanlar Bonaldi T. Proteomic İncelenmesi Farklı Heterokromatin Bileşenler MCP arasında Roman birlikteliğini ortaya çıkarır. 2013; 64-80: 12. © Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için American Society. Biz yazının eleştirel okuma için Roberta Noberini (Teknoloji ve Ieo İtalyan Enstitüsü, İtalya) teşekkür ederim. TB iş Giovanni Armenise-Harvard Vakfı Kariyer Geliştirme Programı, Kanser Araştırma ve İtalyan Sağlık Bakanlığı için İtalyan Derneği hibe tarafından desteklenmektedir. MS çalışma Firc burs ile desteklenmiştir.

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+a+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21, 381-395 (2011).</li>
<li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications%3A+lessons+from+professional+pocket+pickers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Spotswood, H. T., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increasingly+complex+code%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">An increasingly complex code.</a> J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).</li>
<li>Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+for+the+analysis+of+chromatin+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics.</a> Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).</li>
<li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics%3A+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).</li>
<li>Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+histone+code+with+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry.</a> Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).</li>
<li>Taverna, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+combinatorial+linkage+between+methylation+and+acetylation+on+histone+H3+N+termini%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).</li>
<li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).</li>
<li>Villar-Garea, A., Imhof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The analysis of histone modifications.</a> Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142, 810-821 (2010).</li>
<li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+anchoring+of+TFIID+to+nucleosomes+by+trimethylation+of+histone+H3+lysine+4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4.</a> Cell. 131, 58-69 (2007).</li>
<li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interaction+proteomics+and+genome-wide+profiling+of+epigenetic+histone+marks+and+their+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers.</a> Cell. 142, 967-980 (2010).</li>
<li>Bartke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-interacting+proteins+regulated+by+DNA+and+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation.</a> Cell. 143, 470-484 (2010).</li>
<li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li>
<li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+investigation+of+chromatin+functional+domains+reveals+novel+synergisms+among+distinct+heterochromatin+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components.</a> Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
<li>Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications.</a> Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).</li>
<li>Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILAC-based+proteomic+analysis+to+dissect+the+%26%2334%3Bhistone+modification+signature%26%2334%3B+of+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">SILAC-based proteomic analysis to dissect the &#34;histone modification signature&#34; of human breast cancer cells.</a> Amino Acids. 41, 387-399 (2011).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal Chem. 75, 663-670 (2003).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).</li>
<li>Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+of+histones+H3.2+and+H3.3+in+Suz12-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+distinct%2C+dynamic+post-translational+modifications+at+Lys-27+and+Lys-36%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).</li>
<li>Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H3+lysine+9+creates+a+binding+site+for+HP1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins.</a> Nature. 410, 116-120 (2001).</li>
<li>Bannister, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+recognition+of+methylated+lysine+9+on+histone+H3+by+the+HP1+chromo+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain.</a> Nature. 410, 120-124 (2001).</li>
<li>Ram, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+patterning+of+chromatin+regulators+uncovered+by+genome-wide+location+analysis+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells.</a> Cell. 147, 1628-1639 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Beck, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+in+epigenetic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry in epigenetic research.</a> Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).</li>
<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+chromatin+states+for+systematic+annotation+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome.</a> Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).</li>
<li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).</li>
<li>Young, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+characterization+of+combinatorial+histone+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput characterization of combinatorial histone codes.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).</li>
<li>Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+characterization+of+human+histones+in+the+H2A+gene+family+by+top+down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yakın zamanda ChroP, kromatin protein bileşenlerinin büyük ölçekli karakterizasyon için nicel bir strateji tarif edilmiştir. ChroP epigenetik alanında kullanılan iki tamamlayıcı yaklaşımlar, Chip ve MS, güçlerini istifade ve kendi sınırlarını aşma birleştirir. Derin dizileme (ChIP-Seq) birleştiğinde ChIP birkaç nükleozomların 35 çözünürlükte histon modifikasyonları genom haritalama sağlar. Duyarlılık için avantajlı olsa da, antikor-bazlı deneyler benzer değişiklikler ayırt etme yeteneği ve histon kod 36<...

Kromatin bütün DNA dolayımlı süreçler için temel şablon olarak dahil olan bir yüksek dinamik bir nükleoprotein karmaşıktır. Nükleozom kromatin temel tekrarlanan birimi olan ve DNA 147 bp 1,2 sarılır etrafında her bir kanonik histon H2A, H2B, H3 ve H4, iki protein molekülü ihtiva eden bir oktamer çekirdek oluşur. Tüm çekirdek histon bir küresel etki ve nükleozom dışında çıkıntı esnek bir N-terminal &quot;kuyruk&quot; olarak yapılandırılmıştır. Kromatin yapısı ve dinamikleri düzenlenmesi için önemli mekanizmalardan biri esas olarak histon 3,4 N-uçlarının üzerinde meydana gelen kovalent bir post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) dayanmaktadır. Histon modifikasyonlar histon-DNA arasında veya nükleozom arasında temas değiştirerek, yüksek dereceli kromatin yapısını değiştirmeden ve böylece DNA-bağlayıcı proteinler (sis mekanizmaları) erişilebilirliğini kontrol edilmesi yoluyla işlev görebilir ya da dockin olarak hareket ederekdüzenleyici proteinler için, ya da tek bir birim ya da multimerik kompleksleri gömülü olarak g siteleri. Bu gibi düzenleyici proteinlerin farklı şekillerde işlev gösterebilir: doğrudan gen ifadesi (örneğin, TAF proteinleri) modüle edilmesiyle, ya da nükleozom konumlandırma (yani kromatin kompleksler yeniden) değiştirerek ya da başka bir histon artıkları (metil-transferaz ya da örneğin proteinler asetil-değiştirerek transferaz aktivitesi) (trans mekanizmaları) 5. Belirli kromatin loci farklı PTM desenler küme farklı sitelerde farklı modifikasyonlar yatan DNA&#39;nın fonksiyonel durumunu aracılık moleküler kodu üretmek için sinerji olabilir hipotezin hazırlanmasına neden olduğunu gözlem. &quot;Histon kodu hipotezi&quot; yıllarda büyük uzlaşma kazanmıştır ancak deneysel doğrulama teknik sınırlamalar 6,7 ile geri düzenlenen olmuştur. Kütle spektrometrisi (MS) bazlı bir proteomik olarak ortaya çıkmıştırgüçlü bir araç histon modifikasyonu desenleri haritasına ve kromatin-bağlayıcı proteinlerin 8 karakterize etmek. MS bir peptidin deneysel ve kuramsal kütle arasında belirli bir modifikasyonunu Δmass olarak tespit eder. Bireysel histonların seviyesinde, MS bunların 9-14 arasında yeni modifikasyon ve açığa etkileşimlere saptanmasını sağlayan, PTMS eşlemek için bir ilgili ve kapsamlı bir yöntem sağlar. Son yıllarda, bir dizi strateji sağlam mitotik kromozom 15, çözünür HPTM bağlayıcı proteinlerin 16-18 tanımlanmasında ve özel kromatin bölgelerin izolasyonu ve analiz karakterizasyonu dahil olmak üzere, kromatin proteomik bileşimini incelemek için geliştirilmiştir (örneğin telomer) 19,20. Ancak, histon PTMS, varyantları ve kromatin ile ilişkili proteinler arasındaki lokus spesifik sinerji soruşturma hala tamamlanmadı. Burada, biz (ChroP adında yeni bir yaklaşım, tarifBiz verimli, fonksiyonel olarak farklı kromatin alanları tanımlamak için gelişmiş olduğunu Chro matin P roteomics) 21. Bu yaklaşım, zenginleştirilmiş numunenin etkin MS-tabanlı proteomik analizi için Kromatin immüno-çökeltmesi (çip), epigenetik araştırmalarda kullanılan köklü bir protokol, uyum sağlar. Bu giriş ve MS ile ele alınan sorun olarak kullanılan kromatin türüne bağlı olarak, iki farklı protokol geliştirdik; özellikle: MNase ile sindirilmiş sabitlenmemiş yerli kromatin 1) yonga mono-nükleozom arındırmak ve ko-ilişkilendirme hPTMs (N-ChroP) incelemek için kullanılır; 2) sonikasyon ile parçalanır çapraz bağlantılı kromatin ChIP proteinleri (X-ChroP) bağlayıcı tüm eş zenginleştirmek kromatin karakterize etmek için bir SILAC bazlı interactomics stratejisi ile kombinasyon halinde kullanılır. Biz burada İmmünopresipitasyon adımlar için yem olarak H3K9me3 kullanarak, heterokromatine zenginleştirmek ve eğitim için N-ve X-ChroP kombinasyonunu göstermektedir. ChroP kullanılması uzatılabilirBöylece epigenetik çeşitli uygulamalara önünü, ayrı kromatin bölgeleri, ya da farklı bir işlevsel durumuna geçiş sırasında aynı bölge içinde kromatin bileşimindeki değişiklikleri ya çalışmak için.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Canlandırıcı</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Tıbbi</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz FBS Canlandırıcı</td><td></td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lizin 0 (12C6 14N2 L-lizin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginin 0 (12C6 14N4 L-arginin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lizin 8 (13C6 15N2 L-lizin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginin 10 (13C6 15N4 L-arginin)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokokal Nükleaz</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Tam, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl Tabletleri</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3 diyaliz borusu, 3.5K MWCO, 18mm düz genişlik, 50 ayak uzunluğu</td><td>Spectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H3 tri-metillenmiş K9-ChIP sınıfı</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histon H3 peptit tri-metil K9 & nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex% 4-12 & nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Bis-Tris Jel&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidal Mavi Boyama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Örnek Tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aceti anhidrit-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[başlık]</td></tr><tr><td>Formik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid & % 99 (HPLC), kristalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Sınıfı Modifiye Tripsin, Dondurulmuş 100 & mu; g (5 & kez; 20 & mu; g)</td> <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360 & mu; m x Kimlik 75 & mu; m, ipuçları ID 8 & mu; m kaplamasız Pk 5</td><td>Mikrokolon Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 ve mikro; m&nbsp; &nbsp; %15 C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Karbon ekstraksiyon diski, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Katyon ekstraksiyon diski</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

chrop yaklaşım kromatin odağı özgü proteomic manzaralar teşrih chip ve kütle spektrometre birleştirir

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Kromatin çeşitli DNA-bağımlı işlemlerini denetleyen DNA ve proteinlerden oluşan bir derece dinamik Nukleoprotein karmaşıktır. Belirli bölgelerdeki kromatin yapısı ve fonksiyonu transkripsiyon faktörleri ve DNA da dahil olmak üzere metilasyon histon post-translasyonel modifikasyonlar (hPTMs) ve türevleri, kromatin bağlayıcı proteinler, lokal zenginleşmesi ile düzenlenir. Farklı fonksiyonel bölgelerde kromatin kompozisyon proteomik karakterizasyonu kadar kütle spektrometresi (MS) tarafından daha sonraki derinlemesine analiz için uygun saflıkta ve miktarda bu tür etki zenginleştirmek için verimli protokollerin olmaması engel olmuştur. Biz burada, hazırlayıcı Kromatin immüno-çökeltme, özellikleri, hPTMs açısından, varyantları ve co-ilişkili olmayan proteinler ayrı histonic kromatin bölgeleri izole etmek için kullanılır ve bu arada ChroP (Chro kaska roteomics P) olarak adlandırılan, yeni tasarlanmış kromatin proteomik strateji tarif MS ile analiz edilmiştir. Biz he göstermekhiston H3 lizin 9 arasında tri-metilasyon varlığı ile işaretlenir transkripsiyonel sessiz heterokromatik bölgelerin zenginleştirme ve analizi için ChroP kurulmasına re. Elde edilen sonuçlar iyice heterokromatinin proteomesini karakterize ve kromatin farklı protein belirleyicileri etkileşim ve lokus spesifik yapısal ve işlevsel yapılandırmaları kurmak synergize nasıl anlamak için güçlü analitik strateji olarak bunu kanıtlamak içinde ChroP potansiyelini göstermektedir.

Kromatin immüno genomu boyunca bir protein veya bir histon modifikasyonunun lokalizasyonu profil için kullanılan güçlü bir tekniktir. Bir proteomik eşdeğer olarak, çip, ilgilenilen değiştirilmesi veya protein ile birlikte imüno &quot;yem&quot; olarak kullanılan nicel ve nitel olarak hPTMs, histon varyantları ve kromatin bağlayıcı proteinleri belirlemek için MS tabanlı proteomik izlemektedir. N-ChroP yaklaşımda, kromatin MNase (Şekil 1 B) ile sindirilmiş edildiği Şekil 1A, yerli Chip, be...

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Bu prosedürün genel amacı, farklı unsurların transkripsiyonel durumu belirlemek için nasıl sinerji oluşturduğunu anlamak amacıyla, fonksiyonel olarak farklı kromatin bölgelerinin proteomik kompozisyonunu karakterize etmektir. Bu işlem, öncelikle kültür hücrelerinden çekirdeklerin hazırlanması ve kromatinin enzimatik veya mekanik yollarla uygun uzunluktaki fragmanlara sindirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ya bir histon post-translasyonel modifikasyonuna ya da ilgilenilen bölgeyi spesifik olarak işaretlediği bilinen bir proteine karşı yem antikorlar kullanılarak immünopresipitasyon yoluyla, toplam kromatin içerisinden belirli bir fonksiyonel bölgenin saflaştırılmasıdır.Ardından, immünopurifiye edilmiş kromatin proteinleri SDS page ile ayrılarak kütle spektrometrisi öncesinde jel içi sindirime tabi tutulur. Bir sonraki adım, yüksek çözünürlüklü bir cihazda sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi analizidir. Son olarak, kütle spektrometrisi ham verileri ad hoc yazılımlar ile analiz edilir ve ardından, histon modifikasyonlarını ve zenginleşen ko-proteinleri belirlemek ve miktarlarını saptamak için spektrumların manuel incelemesi yapılır; bu işlem sırasıyla, çöktürülmüş materyalde girdiye oranla göreceli bolluğun hesaplanmasına veya çözünür peptidin yeme karşı rakip olarak kullanıldığı SLAC oranı ve rekabet deneylerine dayanır. Bu yöntemle, histon modifikasyon örüntüsü ve varyansı ile bunların ulaştığı spesifik kromatin bölgeleri ve beraberinde recruit edilen nükleer etkileşimler arasındaki etkileşimler hakkında bilgi edinebiliriz; tüm bunlar uyumlu bir şekilde hareket eder.Gen ekspresyonu üzerinde düzenleyici etkisi olan spesifik bir kromatin manzarasını tanımlamak için CROP'un, çözünür etkileşimler veya histon modifikasyonları için in vitro taramaya dayalı olan pull-down gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı şudur: Histon peptitleri veya yeniden oluşturulmuş kromatin şablonlarının kullanılması, lokusa özgü kromatin kompozisyonunun daha doğal ve daha az yapay koşullar altında incelenmesi imkanını sağlar. CROP uygulaması, diğer model sistemlere veya zamana bağlı çalışmalara da genişletilebilir.Örneğin, belirli bir perturbasyona yanıt vererek global bir transkripsiyonel yanıt uyandıran bir hücre hattında crop kullanabiliriz. Bu prosedürü Monica Sodile göstereceğiz. N chip prosedürü için çekirdekler, işaretlenmemiş olanlardan hazırlanır.Her deney için 1 ila 2 × 10⁸ He A S3 hücresi kullanılır. Hücreleri toplamak için, 50 mL'lik tüplere 5 × 10⁷ hücre içeren dört adet alikot hazırlayın ve 4 °C'de, 340 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın, süpernatantı atın ve yeniden süspanse edin.Her bir hücre peletini sekiz mililitre lizis tamponu içerisinde süspande edin ve 15 mililitrelik tüplere aktarın. Döner bir çark üzerinde, dört derece Celsius'ta 10 dakika inkübe edin. Ardından, her bir hücresel lizatı dikkatlice bir sükroz yastığı üzerine dökün ve çekirdekleri sitoplazmadan ayırmak için salınımlı bir rotorda, dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca 3.270 ×g hızında santrifüjleyin.Süpernatantları atın ve nükleer peletleri buz üzerinde iki kez soğuk PBS ile yıkayın. İkinci yıkamadan sonra süpernatantı attıktan sonra çekirdekleri bir adet 50 mililitrelik tüpte toplayın.Nükleer peleti bir mililitre sindirim tamponunda yeniden süspande edin. Her örneği 500 mikrolitrelik iki alikota bölün ve buz üzerinde bekletin. Her alikota, mikroliter çekirdek başına 0,005 ünite enzime karşılık gelen beş mikrolitre MNA ekleyin.Nazikçe karıştırın ve 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için 1 mM EDTA ekleyin ve buz üzerinde bekletin. Sindirilmiş çekirdekleri 4 °C'de 7.800 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün.Süpernatantları iki tüpe aktarın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Bu, mononükleozomal bölgeleri içeren kromatinin ilk çözünür fraksiyonunu oluşturan S1 fraksiyonudur. Peletleri bir mililitre diyaliz tamponu içinde dikkatlice yeniden süspande edin ve ertesi güne kadar üç litre diyaliz tamponu içerisinde, sabit hafif karıştırma ile dört derece Celsius'ta gece boyunca diyalize edin. Diyalize edilmiş materyali toplayın ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca 7.800 kez G hızında santrifüjleyin.Süpernatantı yeni bir eppendorf tüpüne aktarın. Bu, M'nin sindirim düzeyine bağlı olarak nükleozomlar içeren S2 fraksiyonudur. İmmünopresipitasyon öncesinde 4 °C'de saklayın.MN a'nın sindirim kalitesini ve eksikliğini, bu örnekte gösterildiği gibi agaroz jel elektroforezi ve nükleozom merdiveninin görsel incelemesi ile kontrol edin; S1 fraksiyonu mononükleozomlar açısından oldukça zenginken, S2 fraksiyonu esas olarak kromatin immünopresipitasyonu için nükleozomlar içerir. İlk olarak, S1 fraksiyonuna bir hacim chip dilüsyon tamponu ekleyin. Ardından, ilgilenilen histone post-translasyonel modifikasyonuna veya proteine karşı olan antikoru ekleyin ve ertesi güne kadar 4 °C'de döner bir düzenek üzerinde gece boyunca inkübe edin.Protein G bağlı manyetik boncuklar kullanarak kromatini izole edin. S one kromatin örneğine 100 µL bloklanmış boncuk ekleyin ve 4 °C'de, döner bir çark üzerinde üç saat boyunca inkübe edin. Üç saat sonra.Bir dakika boyunca 340 ×g'de santrifüjleyin. Boncukları çöktürmek için einor tüplerini manyetik bir rafa yerleştirin. Bağlanmamış nükleozomları içeren akış sıvısı olan süpernatantı saklayın.Boncuklara yıkama tamponu ekleyin ve santrifüjden önce döner bir düzende dört derece santigrat sıcaklıkta beş dakika inkübe edin. Bu şekilde, artan tuz konsantrasyonları ile boncukları toplam dört kez yıkayın. Elüsyon için 75 milimolar sodyum klorür ile iki yıkama, ardından 125 milimolar ile bir yıkama ve son olarak 175 milimolar sodyum klorür ile bir yıkama gerçekleştirin.Amino çöktürülmüş kromatin. Boncukları, 50 millimolar dithiothreitol ile desteklenmiş 30 µL LDS Örnek tamponu içinde 70 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.Bu prosedüre başlamak için hücreleri formaldehit ile çapraz bağlayın; bahsi geçen proteinler daha sonra SDS page ile ayrıştırılacaktır. SLAC işaretli hücrelere %0,75 formaldehit ekleyin. Kısa bir süre karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.125 milimolar glisin ekleyerek ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe ederek formaldehidi etkisiz hale getirin. Ardından, hücreleri her alikotta yaklaşık 5 × 10⁷ hücre olacak şekilde iki ila dört alikota ayırın. Son yıkamadan sonra hücreleri üç kez buz gibi soğuk PBS ile durulayın.Süpernatantları atın ve pelletleri saklayın; her bir hücre pelletini 10 milliliters lize tamponunda yeniden süspanse edin. Dört derece Celsius'ta rotasyonla 10 dakika inkübe edin; dört derece Celsius'ta, 430 times G hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantları atın ve nükleer pelletleri saklayın.Çekirdek peletleri Res yıkama tamponu ile yıkadıktan sonra, her bir çekirdek peletini üç mililitre ChIP inkübasyon tamponu içinde süspanse edin ve kromatini fragmente etmek için buz üzerinde tutun; ardından soğutulmuş bir bio rupture cihazında 200 watt'ta sonikasyon uygulayın. Sonike edilmiş kromatinin %2'sini alın ve ChIP inkübasyon tamponu içinde, minimum bir saat boyunca 65 °C'de inkübe ederek çapraz bağlanmayı tersine çevirin.Bu, girdi materyalidir. Ardından, DNA bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak ekstre edilir ve çapraz bağlanan kromatini immünopresipite etmek için agaroz jel elektroforezi ile kromatin fragmantasyonu değerlendirilir. Hafif ve ağır işaretli sonikasyon uygulanmış kromatine seçilen antikor ekleyin.Hafif zincir kanalında, hem hafif hem de ağır numuneler için antikor alikotlarına ek olarak çözünür peptidin fazla katını üçer adet mikro santrifüj tüpüne ekleyin ve ertesi güne kadar 4 °C'de döner bir tekerlek üzerinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her kromatin numunesine 100 µL bloklanmış protein G bağlı manyetik boncuk ekleyin ve 4 °C'de döner bir tekerlek üzerinde üç saat boyunca inkübe edin. 34 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Boncukları çöktürmek için Eppendorf tüplerini manyetik rafa yerleştirin.Süpernatan, bağlanmamış nükleozomları içeren akış sıvısıdır ve sonraki kontroller için saklanır. Boncukları, artan tuz konsantrasyonlarına sahip yıkama tamponu ile dört kez yıkayın. 150 milimolar sodyum klorür ile iki yıkama, ardından 300 milimolar sodyum klorür ile iki yıkama yapın.İmmünopresipite edilen proteinleri elüye etmek ve çapraz bağları çözmek için boncukları 95 °C'de 25 dakika inkübe edin ve 30 µL SDS-PAGE yükleme örnek tamponu ekleyin. Son olarak, EIT'leri birleştirin ve kütle spektrometrisi öncesinde proteinleri SDS-PAGE ile ayırın.Bu prosedüre başlamak için NIP'den zenginleştirilen histonlar sindirilir. Kolloidal kumasi ile boyanmış %4 ila %12 BIS CITRIS akrilamid gradyan jelindeki çekirdek histon bantlarına karşılık gelen jel dilimleri kesilir ve ardından jel parçaları tamamen renksizleşene kadar %50 asetonitril ve deiyonize distile su ile dönüşümlü olarak, ardından jeli büzmek için %100 asetonitril ile renksizleştirilir. Bunları vakumlu bir santrifüjde kurutun.Jel parçalarına, 1 molar amonyum bikarbonat içinde 1/9 hacim oranında asetik anhidrit ve katalizör olarak 3 µL sodyum asetat ekleyin. Güçlü çalkalama ile 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Jel parçalarını %100 asetonitril ile büzün ve ardından bir vakum santrifüjünde yaklaşık beş dakika boyuncay dehidrate edin; sonrasında jel parçalarını buz gibi soğuk ile yeniden hidrate edin.50 milimolar amonyum bikarbonat içerisinde 100 nanogram per mikrolitre tripsin çözeltisiyle 37 derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Döteryumlanmış asetik anhidrit kullanılarak lizinlerin kimyasal modifikasyonu ve tripsin sindiriminin kombinasyonu, jel sindirim desenine benzer bir RC oluşturur; sindirilmiş çözünür peptidleri yeni bir ependorf tüpünde toplayın ve peptidleri yaklaşık bir saat boyunca kurutun. Liyofilize peptidleri %0,5 asetik asit ve %0,1 trifloroasetik asit içerisinde yeniden süspande edin; peptidleri ters faz C18 karbon kartuşu üzerinde tuzdan arındırıp konsantre edin ve el yapımı mikro kolonlarda iyon değişim kromatografisi uygulayın.Peptitlerin %50'sini C 18 karbon sandviç evre ucuna ve %50'sini SCX evre ucuna yükleyin. SCX uçlarındaki peptitleri %5 amonyum hidroksit ve %30 metanol ile, C 18 karbon uçlarındaki peptitleri ise %80 asetonitril ve %0,5 asetik asit ile elüe edin. Son olarak, elüe edilen peptitleri liyofilize edin ve doğal kromatin immünopresipitasyon ve kırpma yaklaşımındaki %0,1 formik asit içerisinde yeniden süspande edin. Toplu kromatin içinden belirli bir fonksiyonel alanı saflaştırmak için ilk adım olarak kromatin, MNA ile sindirilir.Soldaki panel, farklı zaman aralıklarında MNA ile kromatin sindirimi sonrası DNA'nın %1'lik agaroz jelde ayrıştırıldığı küçük ölçekli bir MNA testini göstermektedir. Sağda ise büyük ölçekli bir MNA sindirimi gösterilmiştir. DNA, 60 dakikalık MNA kromatin sindiriminin ardından ve mononükleozomları içeren S1 fraksiyonunun polınükleozomları içeren S2 fraksiyonundan ayrılmasından sonra %1'lik agaroz jelde ayrıştırılmıştır.Sindirilmiş ve mono nukleozomlar bakımından zenginleşmiş kromatin, spesifik bir histon translasyon sonrası modifikasyonunu tanıyan bir antikor ile inkübe edilir. Örneğin, sessiz kromatinin bir belirteci olan histon H3'ün dokuzuncu lizin kalıntısının trimetilasyonu (H3K9me3). İmmünopurifiye edilen proteinler ile kromatin girişi (input) daha sonra SDS-PAGE ile ayrılır ve kolloidal Coomassie boyaması, 17 kilodalton bandının civarında ve altında çekirdek histonları H3, H4, H2A ve H2B'yi gösterir; burada H3 ve H2B birlikte göç eder. Akış sıvısında (flow-through) ve girişte mevcut olan H3 üzerindeki trimetil lenzin dokuzuncu kalıntısı miktarının karşılaştırılması, kromatinin küçük bir alt popülasyonunun zenginleşmesinden kaynaklanabilecek bir yanlılık riskini hariç tutarak, ilgi duyulan bölgenin yaklaşık %50'sinin immünopurifiye edildiğini göstermektedir.Bu histogram, her bir modifikasyon için üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama değer artı eksi SEM'i temsil etmektedir; zenginleştirilmiş nükleozomlar içinde ortak olarak bulunan post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için kütle spektrometrisi (MS) uygulanmıştır. Tüm histon post-translasyonel modifikasyonları, CID fragmantasyonu kullanılarak hazırlanan bu temsili MS/MS spektrumlarındaki ilgili MS/MS spektrumlarının manuel incelenmesiyle doğrulanmıştır. B iyonu ve Y iyonu serileri, H3 9-17 peptidinin dizisinin tanımlanmasına ve trimetilasyonun lizin 9 kalıntısı üzerindeki lokalizasyonuna olanak sağlar; etiketsiz kantifikasyon, öncelikle kütle-yük değerine dayalı olarak her bir modifiye edilmiş peptide karşılık gelen ekstre edilmiş iyon kromatogramı (XIC) oluşturularak ve ardından her bir pik için eğri altındaki alan (AUC) hesaplanarak gerçekleştirilmiştir.Ardından, H3 9-17 peptidindeki lizin dokuzun farklı metilasyon derecelerinin göreceli bolluğu, her bir modifiye peptidin AUC değeri, söz konusu peptidin gözlemlenen tüm modifiye edilmemiş ve modifiye edilmiş formlarına karşılık gelen alanların toplamına bölünerek tahmin edilir. Üçüncü olarak, ChIP'li materyaldeki her bir modifikasyonun göreceli zenginleşmesi, ChIP'li peptitteki her bir metilasyonun göreceli bolluğunun input değerine oranının log2 değeri olarak ifade edilir. H3 9-17 peptidinin analizi, modifiye edilmemiş ve monometil formların karşılık gelen azalmasıyla birlikte, dimetillenmiş ve trimetillenmiş lizin dokuzun zenginleştiğini göstermektedir.Antikor özgüllüğü için pozitif kontrol olarak kullanılan bu sonuçlarla, diğer tüm modifikasyonların eş zamanlı birlikteliği veya eksikliği, hem aynı H3 üzerindeki intramoleküler düzeyde hem de aynı nükleozom içindeki diğer koen zenginleştirilmiş histonlar üzerindeki intermoleküler düzeyde değerlendirilebilir. Bu temsili ısı haritası, histon H3, H4 ve H2A üzerinde tanımlanan, birliktelik gösteren tüm H ptm zenginleşmelerini özetlemektedir. Her satır farklı bir modifikasyona karşılık gelir ve ND, tüm proteinlerin taranması sırasında tespit edilemeyen modifikasyonları belirtir. Sonikasyonla fragmante edilmiş çapraz bağlı kromatinin heterokromatin chip çalışmasındaki birliktelikleri, hücre kültüründe amino asitlerle stabil izotop etiketleme veya lac ile kombinasyon halinde kullanılır.İlk olarak, ağır lizin ve ağır arjininin proteinlere katılımı hesaplanarak etiketleme verimliliği değerlendirilir. Doğru protein nicellemesi için her iki ağır amino asit için de %95'in üzerinde bir katılım gereklidir; burada gözlemlendiği üzere, lizin ve arjinin peptid yoğunluk dağılımının medyan değerleri sırasıyla 0,974 ve 0,964'tür. İkinci olarak, çözünür peptid ile antikor oranı optimize edilmelidir.Bu şekil, H3 9-17 peptidindeki trimetilleyi lysine dokuz K9me3'ün iki artı yük değerine karşılık gelen yakınlaştırılmış kütle spektrumunu, hem giriş (input) hem de chipped octr örneklerindeki hafif ve ağır formlar için göstermektedir. Giriş örneğinde ağır ve hafif peptidlerin yoğunlukları birbirine yakınken, forward SLAC chip örneğinde hafif peptid yoğunluğu, ağır karşılığından çok daha düşüktür; bu durum etkin bir rekabet olduğunu göstermektedir.Hafif L ve ağır H ile etiketlenmiş kromatin girdisinin (input) ve ko-amino çöktürülmüş materyal ChIP'in temsilci bir SDS-PAGE sonucu burada gösterilmiştir. ChIP materyaline karşılık gelen şerit 10 dilime ayrılırken, girdi örneğinden sadece iki dilim analiz edilmiştir. İnkorporasyon testi analizi için SLAC kompetisyon deneyleri tipikçe, fazla çözünür peptit ile yapılan kompetisyonun ağır H'den hafif L kromatin örneklerine aktarıldığı, "ileri" ve "ters" formatlar olarak adlandırılan çiftler halinde gerçekleştirilir.Bu temsilci tam spektrumlar, HP bir ve makro iki A proteinlerinden gelen peptitlere karşılık gelen SLAC çiftini, ağır proteinin hafif proteine oranının birden büyük olduğunu göstermektedir. Ters replikada birden küçük bir oranla aynalanan ileri deney, bu proteinlerin heterokromatin proteinlerinde spesifik olarak zenginleştiğini kanıtlamaktadır; ağır ve hafif formlardaki yoğunlukları hem ileri hem de ters deneylerde benzer olanlar, bire yakın sabit bir oran oluşturur ve arka plan olarak sınıflandırılır. İleri ve ters X chipp deneylerinin kesişimi, her iki deneyde de mevcut olan ve en az iki oran sayımıyla miktarı belirlenen 635 proteinin tanımlanmasını sağlamıştır.Ağır-hafif oranlarının log 2 grafiği, sözde heterokromozomi temsil eder. Bu saçılım grafiğindeki kırmızı noktalı çizgiler, protein oranlarının üst %40'lık ve %30'luk kısımlarını göstermektedir. Belirtildiği üzere, gerçek trimetil-metillenmiş lizin dokuz etkileşimcileri, protein oranı dağılımlarının üst %40'ında bulunan proteinler olarak kesin bir şekilde tanımlanmıştır.Burada, girdi ileri ve geri X kırpma deneylerinden elde edilen protein oranı dağılımları sırasıyla siyah, mavi ve turuncu renklerle gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometresi analizi öncesinde mono çöktürülmüş proteinleri işlemek için kromatinin E ve uç kırpma için nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Kütle spektrumlarındaki histon modifikasyonlarının nasıl tanımlanacağı ve nicelendirileceği ve protein oranları üzerinden spesifik bir etkileşimin nasıl tanımlanacağı konularını öğrenmiş olacaksınız.

the-chrop-approach-combines-chip-mass-spectrometry-to-dissect-locus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir...

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca...

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

Belirli genomik bölgelerle ilişkili moleküllerin tanımlanması, bu bölgelerin fonksiyonlarının düzenlenme mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Bu protokol, belirli bir genomik bölge ile ilişkili proteinlerin ve RNA'ların tanımlanması için tasarlanmış DNA bağlayıcı molekül aracılı kromatin immünopresipitasyonu (enChIP) gerçekleştirme prosedürlerini açıklar.

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Bu roman proteinler DNA etkileşim belirli hedef loci, çapraz kromatin sonraki proteomik analizleri için yakalanması fingerprinting dayanarak, tanımlamak için bir yöntemdir. Potansiyel proteinler, ne de hücre değişiklikleri hakkında hiçbir ön bilgi gerekli. Başlangıçta Maya için geliştirilen, teknoloji şimdi memeli hücreleri için adapte edilmiştir.

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

CUT&amp;RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&amp;RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Uzaysal analiz için euchromatin, heterokromatin ve RNAP II'nin tekrarlanabilir haritalanmasını sağlayan üç renkli kromatin tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) boyama ve analiz protokolü sunuyoruz. Bu protokol, kromatinle ilişkili hedefler dahil olmak üzere yoğun nükleer ortamlarda verimli çok renkli etiketleme sağlar ve güvenilir eşzamanlı tespiti sağlar.

Yoğun Nükleer Ortamda Kromatinin Araştırılması İçin Çok Etiketli Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskopi Protokolü

Öğrenin, ChroP yaklaşımıyla kromatin immünopresipitasyonu ve kütle spektrometrisi kullanarak fonksiyonel olarak farklı kromatin alanlarının proteomik bileşimini nasıl karakterize edeceğinizi.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Daha fazla video keşfet