RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

Bu prosedürün genel amacı, in vitro hücre bazlı tahlillerin bir kombinasyonunu kullanarak geniş spektrumlu antiviralleri kimyasal kütüphanelerden izole etmektir. Bu, ilk olarak, lusiferleri bir raportör olarak kodlayan rekombinant bir kızamık virüsü suşunun in vitro replikasyonunu inhibe eden bileşiklerin seçilmesiyle gerçekleştirilir. Paralel olarak, bileşiğin toksisitesi, lusiferaz bazlı bir canlılık testi kullanılarak tahmin edilir.

Her iki testten elde edilen birleşik fenotipik veriler, HIIT moleküllerini izole etmek için kullanılır. Son adımlar, HIIT bileşiklerinin doz yanıt replikasyonu, kızamık ve tavuk guna virüsünün inhibisyonu için yeniden test edilmesi ve in vitro toksisitenin daha doğru bir şekilde ölçülmesidir. Sonuç olarak, geniş spektrumlu antiviral bileşikler ekran tarafından tanımlanır ve doğrulanır.

Bu tekniğin, sitopatik etkilere dayalı standart virüs replikasyon testleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bir okuma olarak lüminesansı kullanması ve bir raportör olarak lusiferaz ifade eden oldukça farklı virüslerle birleşmesidir. Prosedürü göstermek, El Niemans ekibinden bir teknisyen olan Olivier Ellan ve f Fredrik JI'nin araştırma birimi Begin to room temperature'da benimle birlikte çalışan bir mühendis olan Marianne Luca Ori olacak. DMSO'da kimyasal bileşiklerin 10 milimolar stok çözeltisini içeren 96 kuyulu ana plaka.

Her bir bileşiğin beş mikrolitresini, her bir oyukta 20 mikrolitre DMSO bulunan yeni 96 kuyucuklu plakalara aktarın, böylece ara seyreltme plakaları oluşturun. Şimdi bu seyreltme plakalarından bir mikrolitresini beyaz barkodlu doku kültürünün kuru kuyularına sıkın. 96 kuyu plakası.

Bunlar D bir plakadır ve 20 mikromolardaki bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Eksi 20 santigrat derecede saklayın. Şimdi 10 kez daha seyreltilmiş ara seyreltme plakalarından yeni plakalar yapın.

Her seyreltilmiş bileşiğin dört mikrolitresini alın ve bunları 36 mikrolitre DMSO ile kuyulara karıştırın. Bu plakalardan, numune başına bir mikrolitreyi beyaz düz tabanlı barkodlu doku kültürünün kuru kuyularına aktarın. 96 kuyu plakası.

Bunlar D iki plakadır ve MV replikasyonunun inhibisyonunu değerlendirmek için kullanılırlar. Onları da eksi 20 santigrat derecede saklayın. Her dört ila beş günde bir stabilize L-glutamin ile takviye edilmiş DMM'de HEK 2 93 T hücrelerini büyütün, hücreleri tripsin ile geçirin ve taze şişelere 10'uncu seyreltme yapın.

Logaritmik büyüme aşamaları sırasında, deney için hücreleri toplayın ve sayın. Hücreleri mililitre başına 300.000 hücrede yeniden askıya alın. Bu seyreltmede 12.5 mililitre hücre, taranacak her plaka için gereklidir.

Şimdi, plakaları bir mikrolitre DMSO ile bir set kontrol kuyusu hazırlayın. Hücreleri öldürmek için bir mikrolitre DMSO ve 2,5 mikrolitre %0,5 ipol çözeltisi ile ikinci bir kontrol kuyusu setini açın. Hücre süspansiyonunu bir oluğa aktarın ve D bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre dağıtın.

Sedimantasyonu önlemek için süspansiyonu düzenli olarak çalkalayın. Daha sonra hazırlanan plakaları 24 saat inkübe edin. Hücreleri önceki bölümde yapıldığı gibi plakalar için hazırlayın.

Kültür ortamı, pirimidin biyosentezinin erken aşamalarını hedefleyen antiviral molekülleri filtrelemek için üridin ile desteklenebilir, çünkü bunlar oldukça yaygındır. Enfekte olmamış hücrelerle kontrol kuyuları için hücre süspansiyonunun 10'da birini saklayın ve kalan hacmi enfekte edin. Yeterince çözdürün.

RMV, 0.1 çoklu enfeksiyon için hedef hücre başına 0.1 bulaşıcı partikül ile kültürü enfekte etmek için iki lüks stok çözeltisi. Hesaplanan virüs hacmini hücre süspansiyonuna ekleyin ve hafifçe karıştırın. Enfekte olmuş hücreleri bir oluğa aktarın ve 100 mikrolitre enfekte olmuş hücreyi D iki plakasına dağıtın.

Birinci ve 12. sütunlarda çivili kimyasal bileşikleri ve pozitif kontrol kuyularını içeren iki ila 11 arasındaki hedef sütunlar. Oluktaki hücreleri, bir ve 12 numaralı sütunların alternatif sıralarında yavaşça karıştırın, 100 mikrolitre enfekte olmamış hücreleri dağıtın. Şimdi plakaları 24 saat inkübe edin.

İnkübasyon süresinden sonra, D bir plaka hücrelerinin canlılığını belirleyin. Her bir oyuğa 50 mikrolitre lusiferaz bazlı canlılık reaktifi karıştırın ve 10 dakika bekleyin. Ardından plakaları bir luminometre ile okuyun.

Entegrasyon süresini kuyu başına 100 milisaniye olarak ayarlayın. Daha sonra, her bir oyuğa 50 mikrolitre ateşböceği Lucifer substratını karıştırarak ve oda sıcaklığında altı dakika bekleyerek D iki plakadaki MV replikasyonunu belirleyin. Daha sonra toksisite testinin her D bir ve D iki plakası için bir Z faktörüne danışın.

Viral replikasyonun inhibisyonunu hesaplayarak devam edin. Hi bileşikleri, viral replikasyonu uygulanan kesme değerinin altına düşüren ve her bir HI bileşiği için toksik olmayan bileşiklerdir. DMSO'da 500 mikro azı dişinden başlayarak ve 96 oyuklu bir plakanın bir sütunu boyunca yarım adımlarla dört mikro azı dişine doğru hareket ederek seri seyreltmeler yapın, bileşik seyreltme plakasından beyaz barkodlu doku kültürü plakasına bir mikrolitre ekleyin.

Üçlü bir test plakası seti oluşturmak için bu işlemi iki kez tekrarlayın. Daha sonra doku kültürü plakalarını 50 mikrolitre kültür ortamı ile doldurun. Şimdi mililitre başına 600.000 hücrede takviye edilmiş DM EM içinde süspanse edilmiş 37.5 mililitre HEK 2 93 T hücresi hazırlayın.

12,5 mililitre hücre süspansiyonu ile iki adet 15 mililitrelik tüp yükleyin. Her biri, 0.1'lik bir enfeksiyon çokluğunda RMV, iki Luke ile bir tüp hücreyi enfekte eder. İkinci hücre tüpünü vanilya lucifers eksprese eden rekombinant frenk soğanı ile enfekte edin.

0.2'lik bir enfeksiyon çokluğu kullanın. Virüs bulaşmış hücrelerin her iki tüpünü de ters çevirme kullanarak karıştırın. Bu, frenk soğanı patojenitesi nedeniyle biyogüvenlik seviyesi üç laboratuvarda gerçekleştirilmelidir, çünkü şimdi enfekte olmamış hücreleri ve enfekte hücre setlerini kendi HIIT bileşik plakalarına yüklemektedir.

Oyuk başına 50 mikrolitre hücre dağıtın ve plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, RMV ile enfekte olmuş iki hücrenin her bir kuyucuğuna 50 mikrolitre ateşböceği lusiferaz ekleyin. Benzer şekilde, Chick V Ren ile enfekte olmuş hücrelere, enfekte olmamış kontrol hücrelerine 50 mikrolitre koşmuş vanilya Lucifer substratı ekleyin, 50 mikrolitre turpgillerden baz canlılığı ekleyin.

Reaktif, MV ve Chick V replikasyonunu %50 oranında inhibe eden hi bileşik konsantrasyonlarını belirleyerek devam edin. Bu tarama boru hattı, herhangi bir önemli hücresel toksisite göstermeyen ve sırasıyla birincil ve ikincil ekranlarda belirlendiği gibi hem MV hem de Chick V replikasyonunu inhibe eden bileşiklerin seçilmesine dayanır, ateşböceği veya koşan vanilya lusiferlerini eksprese eden rekombinant virüslerden yararlanır. Muhabir olarak.

Bileşik toksisite, lüminesansın bu plaka üzerindeki canlı hücrelerle ilişkili olduğu ticari lusifers bazlı bir test kullanılarak değerlendirilir. 21 bileşik, pozitif kontrol kuyuları tarafından belirlenen bir eşiğe dayalı olarak toksik olarak puanlandı. Antiviral aktivite ilk olarak RMV iki kullanılarak ölçüldü.

Luke Lüminesans, kontrol kuyuları tarafından belirlenen sınırla karşılaştırıldı. Burada, dört bileşiğin diğer tahlilde viral replikasyonu %75'ten fazla inhibe edebildiği bulundu. Bunlardan ikisinin tüm HIIT bileşikleri için toksik olduğu bulundu.

Yarı maksimal inhibitör konsantrasyon, lusiferaz eksprese eden MV ve Chick VRNA virüsleri üzerinde belirlendi. Bu iki virüs ilgisizdir ve bu nedenle ekranı daha sağlam hale getirir. Paralel olarak, seçilen bileşiklerin hücresel toksisitesinin eksikliği bir doz yanıt deneyinde doğrulandı.

Hepsinde 13 toksik olmayan bileşik, 10.000 molekülden oluşan bir kimyasal kütüphaneden tanımlanmıştır. Bu bileşikler hem kimyasal yapı hem de biyolojik aktivite açısından yeniydi. Yapısal benzerliklere dayanarak, bileşikler üç kimyasal aileye ayrıldı.

Referans olarak, yarı maksimal inhibitör konsantrasyon değerleri, güçlü antiviral aktiviteye sahip bir madde ile elde edildi. Bu değerlere bakıldığında, bir büyüklük sırasından daha az, referans molekülünü ekran aracılığıyla tanımlanan çoğu aktif isabetten ayırdı. Bu, seçilen bileşiklerin nispeten güçlü antiviral aktivitesini gösterir Bir kez ustalaştıktan sonra.

Bu teknik, büyük kimyasal kütüphaneleri yüksek verimli bir ortamda taramak ve küçük molekül setlerini seçmek ve geniş spektrumlu antivirallere ulaşmak için kullanılabilir.