Name: Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin, C. elegans kullanarak iskemi/reperfüzyon hasarını modellemek için anoksi/açlık protokolünü. Bu yöntem, nöronal hasarı ve davranışsal yanıtları değerlendirmek için düşük maliyetli bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Şekil 1 ve 2 önceden Serbest Radikal Biyoloji ve Tıp (Queliconi ve ark. 5) yayımlanan ve Elsevier tarafından düzenlenen telif hakkı var edilmiştir. Bu çalışma ile desteklenmiştir Fundação de Amparo à pesquisa Estado de São Paulo (FAPESP), Instituto Nacional de Ciencia e Tecnologia de Processos Redoks em Biomedicina, pesquisa de Processos Redoks em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) à Núcleo de Apoio ve USPHS GM087483 (KN do .) Barbekü bir FAPESP burs tarafından desteklenen bir doktora öğrencisi.

1.. C. elegans Büyüme <ol><li> Standart yetiştirme yöntemleri 1 olarak başına OP50 bakteri ile ekim 35 mm Nematod Büyüme Medya (NGM) agar plakaları, hazırlayın. </li><li> Bir numaralı seribaşı NGM tabağa 6 gravid yetişkin koyarak C. elegans senkronize. ~ 100 yumurta (~ 3 saat) atılmıştır sonra yetişkin çıkarın. </li><li> Solucanlar, genç yetişkin aşamaya geliştirilmiş ve bu deney için en uygun olacak olan ve bu noktada 20 ° C&#39;de 3 gün boyunca inkübe edilir. C senkronize etmek için alternatif protokoller elegans başka bir yerde, 10 tarif edilmiştir. </li></ol> 2. AS için malzemeler <ol><li> M9 tamponu (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) N2 ile dengelenmeleri oksijenden arındırılmış olmalıdır önceki deneyden 30 dakika boyunca (argon da kullanılabilir) ve buz ile çevrili tuttu. </li><li> Küçük bir delik (3 mm olun) genişliğinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kapağı hangi solucanlar AS boyunca yerleştirilecektir. Bu aşırı medya buharlaşma yol açabilir gibi delik, kapağı açık tutmak olmadan gaz değişimi sağlar. </li></ol> 3. Anoksi / Açlık <ol><li> En az üç nüsha halinde tüm deneyler. </li><li> Yukarıda tarif edildiği gibi büyütüldü genç yetişkin solucanlar içeren her bir 35 mm plaka, oda sıcaklığında 1 ml, oksijenli M9 tampon ekleyin. (Bakteri numaralı seribaşı değil kenarlarına M9 ekleyin) plaka bakterilerin uzaklaştırılması önlemek için dikkatli olun. ~ 1 dakika sonra solucanlar M9 yüzme edilmelidir. </li><li> Pipetle steril bir% 1 BSA çözeltisi ile ihraç Coat BSA ile, 1 ml pipet. </li><li> Dikkatle M9 tampon solucanları içeren plaka eğim, eklendiği aynı yerden M9 kaldırmak ve hazırlanan mikrosantrifüj tüpler süspansiyon yerleştirin. Solucanlar tüplerin altına düştü kadar buz içinde kalan olsun (~ 1-2 Dk). </li><li> (Yaklaşık 100 ul bırakarak) tüpten solucanları bozmadan M9 mümkün olan en fazla miktarda çıkarın, oksijen-temizlendi ve buzlu M9 1 ml ekleyin ve solucanlar yeniden dibe kadar buz üzerinde tüp yerleştirin. Son adım 3x tekrarlayın. ~ 100 ul tüp içinde kalıncaya kadar, son yıkama olarak, M9 çıkarın. </li><li> (Bölüm 3.6.2, aşağıdaki talimatlara bakın) özel bir kapalı kap içine, alternatif, (aşağıdaki talimatları, Bölüm 3.6.1) veya bir anoksik / hipoksik odasının içine deoksijene M9 solucanlar ile tüpler yerleştirin. <ol><li> Ticari bir anoksik / hipoksik odası kullanılacak ise, adım 3.5 başlamadan önce odasının içinde bazı tasfiye M9 bırakın ve solucanlar odasının içine bir kez adımı 3.5 tekrarlayın. </li><li> Özel bir bölme kullanılacak ise, düşük maliyetli bir cihaz oluşturmak için ne kadar ayrıntılı bir açıklaması, bu protokol sonunda yer almaktadır ve daha önce 11 başka bir grup tarafından tarif edilmiştir. Kısaca: <ol&gt; <li> 250 ml Tupperware-tipi konteynır kapağının iki delik yapmak ve onlara tüp konnektörleri ekleyin. Bir diğer bir su banyosu içine gaz çıkış olacak ise gaz karışımı enjekte etmek için kullanılacaktır. </li><li> Bölmenin içine solucanlar yerleştirin ve kapağı ile sızdırmaz odayı. </li><li> Sabit bir N2 akışı (100 ml / dakika) ile gaz. </li><li> 26 ° C&#39;de bir su banyosu içinde kap yerleştirin Herhangi bir sızıntı (bölmenin kendisinden kaynaklanan kabarcıkları ile görünen) sistemde olduğu ve hava geri döner, böylece çıkış tüpü de suya batırılır olduğundan emin olun. </li></ol></li></ol></li><li> 20 saat boyunca 26 ° C&#39;de inkübe solucanlar. </li></ol> 4. Simüle Reperfüzyon <ol><li> Gibi koşullar altında, 20 saat sonra oda havası içine inkübasyon odasından tüpleri çıkarın. </li><li> Pipet C. Bir OP50 üzerine (adım 3.3 gibi) bir BSA kaplı ucu ile elegans 35 mm NGM plaka numaralı seribaşı. 24 saat boyunca 20 ° C&#39;de inkübe edin.Bundan sonra, solucanlar atılır hazır olacaktır. </li></ol> 5. Canlı Worms Karşı Ölü belirlenmesi <ol><li> Bir platin almak kullanarak, hafifçe solucanın başının üst dokunun. Canlı solucanlar dokundu sonra geriye doğru hareket edecek. Solucanlar vermeyen iseniz, ölü olarak puan. Bazen, bir solucan geriye hareket değil, ama hafif bir yan-yan kafa hareketi görülebilir. Teknik ölü olmasa da, bu solucanlar saat içinde sona erecek neredeyse kesin, ve ölü olarak atılır gerekir. Bir solucan puan için çok uzun beklerse, döl iç çıkım oluşabilir ve bu &quot;çanta-of-solucan&quot; çok zor leşleri tespit yaparak, yırtılabilir. </li><li> Onlar yinelenen sayar önlemek için sayılır gibi plakadan hem de canlı ve ölü solucanları kaldırmak. Canlı solucanlar davranış testleri gerçekleştirmek için ayrı bir plaka taşınmış olabilir. Toplamına göre, canlı solucan miktarı kalan solucanların% &#39;si olarak ifade edilir (Şekil 1A </stRong&gt;). </li></ol> 6. Tepki Testi dokunun <ol><li> Bu protokol ayrıntılı bir açıklama Hart, Anne C., ed sunulmuştur. Davranış (3 Temmuz 2006), WormBook, ed. C. elegans Araştırma Topluluğu, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Dokunmatik yanıt için puan için, hareketli ve hafif bir kirpik çekme (Şekil 3) ile (yutak orta kısmına yakın) solucan başının tarafına dokunmayın vardır solucanları tespit. </li><li> Solucan geri hareket ederse, gibi duyarlı puan, değilse, (Şekil 1B) olarak vermeyen puan. 10 saniye aralıklarla her solucan için bu adım 10-15x tekrarlayın. Doğru veriler olması için her gruptan en az 10 solucanlar inceleyin. Aynı deney, arka gövde duvarına hafif dokunma, aşağıdaki ileri ettirici değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu ayrı bir davranışı uyarır, çünkü solucanın baş veya kuyruk dokunmak için değil emin olun. </li><li> Son olarak, inkurumsal genetik kontrol suşları [negatif pozitif, mec (mechanosensory) mutant için N2 Bristol vahşi-tip - örneğin CB1338 mec-3 (e1338) IV] solucanlar dokunmak ile kuvvet kalibre etmek. Bir uyarım çok sert çok az vahşi tip N2 kontrollerde bir etki ortaya olmaz, mec mutantlar davranışsal bir tepki ortaya çıkarır. </li></ol></li></ol> 7. Nöronal Değişiklikler <ol><li> , Nöronal değişiklikler AS yazı görselleştirmek dokunmatik yanıt mec nöronlar 4,5 GFP ifade bir yük kullanın. Bu nöronlar vücut duvarı boyunca uzanan ve kolayca morfolojik anormallikler için atacak uzun süreçleri var. Buna ek olarak, morfolojik bilgileri yukarıda tarif edildiği gibi, nöronal fonksiyon davranışsal önlemler ile entegre edilebilir. Bu amaçla kullanılabilecek bir suş C ile kullanılabilir TU2583 olduğu elegans Genetik Center ileri ve geri GFP ifade uIs25 entegre transgen içerirentegre bir mec-3 :: GFP füzyon içeren MEC-18 promotör, ya da seçenek olarak TU2562, m. </li><li> Bir agaroz dolgusunu hazırlayın. <ol><li> Su içinde, bir 10x stok ile M9 1x getirmek, ve 70 ° C de muhafaza solüsyonu% 2 agaroz eritilir </li><li> Kendi alt tarafında bant tek parça, her biri iki slaytlar arasında yerleştirilmiş olan bir cam slayt (75 mm x 25 mm) bu çözeltinin, bir damla (~ 20 ul) yerleştirin. </li><li> % 2 agaroz çözeltisi üzerine ilk dik olan bir nihai cam slayt yerleştirin ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Bu, bant kalınlığı olan bir pedi oluşturmalıdır. </li><li> Üst slayt kaldırmak ve solucanlar hareketsiz olacaktır% 0.1 Tetramisole içeren M9 10 ul ekleyin. </li></ol></li><li> % 2 agaroz slayt üzerine solucanları yaşayan bazı (~ 10) hareket ettirin. Üzerlerine bir lamel yerleştirin ve uygun aydınlatma ile bir 100X objektif altında bir floresan mikroskop kullanılarak GFP görselleştirmek. </li><li> Hasarlınöronlar işlemler (Şekil 2B) kırılabilir görünür bir sitosolik zar çok punktum (Şekil 2A) oluşan işlemlerinde inci Desenin dize ve / veya anormallikleri gösterir. En az 10 solucanlar toplam kullanarak, her bir solucan için hem nöronlarda punktum ve anormallikleri saymak. </li></ol> 8. Lab yapımı Hipoksik Odası <ol><li> Bir Tupperware tarzı, yapışmalı, hava geçirmez kap bir oksijensiz odası olarak güçlendirme edilebilir. Mümkün olduğu kadar küçük bir kap seçmek için özen gösterin. Küçük bir kap daha hızlı hipoksik ortam yaratır ve (Şekil 4) su banyosu içinde uyacak şekilde daha kolaydır. </li><li> Kapak üzerinde iki delik (bir tornavida ile ya da forseps ısıtma ve kapağının içine zorlayarak yapılabilir) yapmak ve tüp (Şekil 5A) uygun bir plastik veya metal konnektörü takın. Su altında yerleştirilebilir tutkal kullanın ve aynı zamanda hareket kaçınarak, kuruduktan sonra zorlaşıyorbağlayıcı ve dolayısıyla sızıntı olasılığını (Şekil 5B) azaltır. </li><li> (Şekil 4) tamamen daldırılmış, böylece kap su banyosu içine yerleştirilmelidir. Kabı batırmak için, bir şişe ağırlık veya bir dalış ağırlık kullanın. </li><li> Boru bağlantılarının biri bir gaz karışımı tanıtmak ve diğer boru, kap dış çevre (Şekil 4) karşı sızdırmazlığı temin edilir, böylece bu nedenle su altında bırakılmalıdır, bir basınç kabartma olarak hareket edecek kullanılacaktır. </li><li> Hava bileşim özel yapılmış gaz, kütle akış kontrol ya da gaz karışımları arzu edilen herhangi bir aparat kullanılarak modüle edilebilir. Yüksek akış aşırı buharlaşma oluşturabilir olarak gaz akışı, kontrol edilmelidir. Örneğin, bir 250 ml kap içinde, gaz 100 ml / dakika solucanlar için iyi bir alan ve uygun bir akışı sağlayacaktır. </li><li> Bunlar gaz, a karşı geçirgen olabilir olarak boru uzunluğu, en az tutulmalıdırllowing O 2 giriş. Bu malzemeler gaz alışverişine geçirgen olduğu gibi silikon kullanmaktan kaçınmak önemlidir, Tygon borular. Biz polipropilen ya da naylon tüpler tercih. Cam ya da metal boru de gazlar muhafaza, aynı zamanda çalışmak zordur. </li></ol>

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+gene+function+in+Caenorhabditis+elegans+using+RNA-mediated+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+Funct.+Genom.+Proteom%22%5BJournal%5D)">Studying gene function in Caenorhabditis elegans using RNA-mediated interference.</a> Briefings Funct. Genom. Proteom. 7 (3), 184-194 (2008).</li>
<li>Vanden Hoek,, L, T., Shao, Z., Li, C., Zak, R., Schumacker, P. T., Becker, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+injury+on+cardiac+myocytes+after+simulated+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reperfusion injury on cardiac myocytes after simulated ischemia.</a> Am. J. Physiol. 270 (4), 1334-1341 (1996).</li>
<li>Ba Scott,, Avidan, M. S., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+hypoxic+death+in+C.+elegans+by+the+insulin%2FIGF+receptor+homolog+DAF-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of hypoxic death in C. elegans by the insulin/IGF receptor homolog DAF-2.</a> Science. 296 (5577), 2388-2391 (2002).</li>
<li>Queliconi, B. B., Marazzi, T. B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicarbonate+modulates+oxidative+and+functional+damage+in+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Rad.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Bicarbonate modulates oxidative and functional damage in ischemia-reperfusion.</a> Free Rad. Biol. Med. 55, 46-53 (2013).</li>
<li>Wojtovich, A. P., DiStefano, P., Sherman, T., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP-sensitive+potassium+channel+activity+and+hypoxic+preconditioning+are+independent+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+subunit+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP-sensitive potassium channel activity and hypoxic preconditioning are independent of an inwardly rectifying potassium channel subunit in Caenorhabditis elegans.</a> FEBS Lett. 586 (4), 428-434 (2012).</li>
<li>Dasgupta, N., Patel, A. M., Scott, B. A., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+Preconditioning+Requires+the+Apoptosis+Protein+CED-4+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxic Preconditioning Requires the Apoptosis Protein CED-4 in C. elegans.</a> Curr. Biol. 17 (22), 1954-1959 (2007).</li>
<li>Jia, B., Crowder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+anesthetic+preconditioning+present+in+the+invertebrate+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Volatile anesthetic preconditioning present in the invertebrate Caenorhabditis elegans.</a> Anesthesiology. 108 (3), 426-433 (2008).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Sherman, T. A., Nadtochiy, S. M., Urciuoli, W. R., Brookes, P. S., Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLO-2+is+cytoprotective+and+contributes+to+mitochondrial+potassium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SLO-2 is cytoprotective and contributes to mitochondrial potassium transport.</a> PloS One. 6 (12), e28287(2011).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Fawcett, E. M., Horsman, J. W., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+defined+gaseous+environments+to+study+the+effects+of+hypoxia+on+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (65), e4088(2012).</li>
<li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bokov, A. F., Hakala, K. W., Weintraub, S. T., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+anaerobic+response+of+C.+elegans+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling the anaerobic response of C. elegans using GC-MS.</a> PLoS One. 7 (9), 10-1371 (2012).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cell+cycle-regulated+proteins+correlates+with+anoxia-induced+suspended+animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cell cycle-regulated proteins correlates with anoxia-induced suspended animation in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (5), 1473-1483 (2002).</li>
<li>Jiang, H., Guo, R., Powell-Coffman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+hif-1+gene+encodes+a+bHLH-PAS+protein+that+is+required+for+adaptation+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans hif-1 gene encodes a bHLH-PAS protein that is required for adaptation to hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7916-7921 (2001).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+age-dependent+reversal+in+the+protective+capacities+of+JNK+signaling+shortens+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">An age-dependent reversal in the protective capacities of JNK signaling shortens Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 11 (4), 659-667 (2012).</li>
<li>Wang, Y., Chen, J., Wei, G., He, H., Zhu, X., Xiao, T., Yuan, J., Dong, B., He, S. S. kogerbøG., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+intermediate-size+transcriptome+shows+high+degree+of+stage-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans intermediate-size transcriptome shows high degree of stage-specific expression.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5203-5214 (2011).</li>
<li>Perry, C. N., Huang, C., Liu, W., Magee, N., Carreira, R. S., Gottlieb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+mitochondrial+electron+transfer+enzyme%2C+Ndi1%2C+in+myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of mitochondrial electron transfer enzyme, Ndi1, in myocardial reperfusion injury.</a> PloS One. 6 (2), e16288(2011).</li>
<li>Chai, Y., Li, W., Feng, G., Yang, Y., Wang, X., Ou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cellular+Dynamics+During+Caenorhabditis+elegans+Postembryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cellular Dynamics During Caenorhabditis elegans Postembryonic Development.</a> Nature Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).</li>
<li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na%2B%2FH%2B+exchanger+NHX-2+increases+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J. Biol. Chem. 278 (45), 44657-44666 (1074).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yaygın C kullanılmıştır AS IR hasarı modeli elegans. Bazı kilit noktaları bu protokol için dikkat edilmelidir: C. elegans bu sistemi kullanarak ölüme ulaşmak için 3 eşlik hakaret (ısı, açlık ve anoksi) için ihtiyaç haklı, yaralanmalar geniş bir dizi dayanıklıdır. Yalnız anoksi zaman 14 Bu pencerede solucanları öldürmek değil. Ayrıca, sıcaklık artışı ilave bir stres, yani yakından izlenmesi önemlidir. Açıkçası, açlık başına, 7 gözlenen ölüm derecesine önemli ölçüde katkıda bulunmaz, ancak deneysel çoğaltır arasında değişkenliği azaltmak için görünür. Gün-günden itibaren önemli değişkenlik olabilir göz önüne alındığında, bu numuneler paralel olarak doğrudan çalıştırmak karşılaştırmak, ve birden fazla gün içinde deneyleri tekrarlamak son derece önemlidir. Genel olarak, sonuçlar 50-100 solucanlar, üç ayn tabağın / deney koşulu için ölçülmüş ve bu vardırn ortalama ve tek bir deneysel tekrarında olarak kabul. Genellikle, yedi ila dokuz tekrar elde etmek ya da istatistiksel anlamlılık ekarte etmek yeterli görülebilir. Deneyde kullanılan solucanların gelişim aşaması da hasar anlamlı 15,16 değişir AS dikkatle farklı aşamalarında duyarlılık olarak izlenmesi gerekmektedir. Genç yetişkinlerin kullanımı standart ve larva evresi (L3 ve L4) solucanlar A.Ş. (yayınlanmamış veri) zararlı etkilerine daha dayanıklı olduğu görülmektedir. Bu protokol deneyleri gerçekleştirmek için iki yol, bir ticari hipoksik haznesi 4,6 kullanıyorum ve diğer (Tupperware-tipi kaplar ve gaz girişi 11 kullanılarak) bir laboratuvar yapımı cihazı kullanarak birini sunuyor. Başka bir yerde tarif edildiği gibi 13,17 Yetersizliği, oksijeni tüketen diğer yollarla elde edilebilir. Hipoksik bir ortam oluşturmak için alternatif tekniklerin kullanılması gerekli AS inkübasyon süresi değişebilirÖlüm istenilen miktarda oluşturmak için kullanılır. % 80 AS zararlı etkilerini şiddetlendirebilir müdahaleler için benzer ideal iken ~ 20% yaşam hedefleyen, koruyucu müdahaleler eğitim için ideal bir başlangıç ​​noktasıdır. Bir diğer önemli unsur da gözlemci skorları canlı / ölü solucanlar zamanıdır. Analiz için süre 24 saat ötesine ise ölü solucanlar belirlemek için giderek daha zor hale yana, veri yanıltıcı olabilir. Bu durum solucan karkaslar zamanla nispeten şeffaf olma, aynı zamanda döllenmiş embriyo karkas iç döl otopside dönüşebilir ve ortaya olarak bozabilir gerçeği olabilir. Nöronal morfoloji analizi, protein ekspresyonu 18, nükleer parçalanma 4 ile uygun bir işaretleyici ifade eden genetik olarak kodlanmış bir sonsuz yük ikame diğer parametreler 19 bakmak için modifiye edilebilir. Bir son ihtar olduğunu ve görselleştirmenöronal süreçleri slaytta solucanlar yerleştirdikten sonra en az 30 dakika yapılmalıdır. Uzun süreler AS-bağımsız hasar sergileyebilir için Hayvanlar slaytlar anestezi altında tutulur. Onları izlemek ve analiz etmek için gerekli zamana göre slayt başına hayvan miktarını ayarlayın.

C. elegans yaygın Brenner 1 tarafından piyasaya sunulmasından bu yana bir çok hücreli ökaryotik model organizma olarak kabul edilmiş bir nematod olduğunu. Bu genetik değişiklikler ve fenotipik arasında kolay bağlantılar 2 değiştiren sağlayan ucuz, basit ve çok yönlü bir model. İskemi reaktif oksijen türlerinin bir kayma üretilen 3 ve zararın en gerçekleşir reperfüzyon ardından besin ve bir dokuya oksijen kaynağı bir eksikliği, ile karakterize edilmektedir. 2002 yılında, C. ve iskemi / reperfüzyon (IR) bir modeli elegans, normal şartlar altında, 24 saat, ardından yaklaşık 20 saat boyunca anoksi, besin yoksunluğu ve ısı stresi için bütün solucan göndererek dahil 4 geliştirilmiştir. Bu modeli teknik bir anoksik-açlık (AS) olsa da durum, hücre ölümü, reperfüzyon esnasında oksidanlar neden olduğu hasar dahil olmak üzere memelilerde muhafaza edilir mekanizmalar yoluyla gerçekleşir &lt;sup&gt; 5.. AS C. tarafından uyarılan Bundan başka, memeli IR benzer, hasar elegans iskemik ön 6,7 veya anestetik önkoşullama 8,9 ile önlenebilir. Aşağıdaki protokoller C. IR taklit nasıl göstermek elegans AS kaynaklanan morfolojik ve davranışsal anormallikler puan nasıl, AS modelini kullanarak ve nasıl deney bir ısmarlama, kolayca inşa odası alternatif kullanarak düşük bir başlangıç ​​yatırımı ile yapılacak sağlar bir şekilde protokol uyum için .

<table><tbody><tr><td>N2&nbsp; suşu</td><td>CGC</td><td></td><td>Yabani tip suş. http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td><td></td><td>CGC TU2583</td><td>entegre floresan transgeni, dokunma nöronlarını etiketlemek için kullanılır.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</s></td></tr><tr><td>CB1338 mec-3 (e1338)IV</td><td>CGC</td><td>CB1338</td><td>dokunmaya duyarsız kanonik mec-3 mutantı.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</s></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U Mikroskobu&nbsp;</td><td>Nikon USA</td><td>TE2000-U Düşük Sıcaklık İnkübatörü</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sheldon Manufacturing Inc.</td><td>Model 2005</td><td></td></tr><tr><td>Kirpik Çekme</td><td></td><td></td><td>Tahta bir kürdan üzerine bir kirpik takılarak ve ardından kürdan bir cam Pasteur pipetine (<güçlü>Şekil 3</güçlü>) takılarak bir kirpik penası hazırlanabilir.</td></tr><tr><td>Hipoksik Oda</td><td>Coy</td><td>8307030</td><td>paladium katalizörü ve CO2 kontrolörü ile donatılmış Hipoksik Torpido gözü</td></tr></tbody></table>.

iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık modeli<em&gt; c. elegans</em

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Genetik model organizma C. elegans anoksi / açlık için Protokoller iskemi / reperfüzyon simüle. Worms bakteriyel gıda ayrılır ve oksijen altına yerleştirildi, 20 saat (simüle iskemi) için, ve daha sonra yiyecek (simüle reperfüzyon) ile normal bir atmosfere taşınır. Artan ölüm ve nöronal hasar ve teknikleri Bu deneysel sonuçlar organizma canlılığı, dokunmatik nöron süreçlerin morfolojisine değişiklikler, hem de nöronal işlevin davranış çıktısını temsil dokunma duyarlılığını, değerlendirmek için sunulmaktadır. Son olarak, ortak bir mutfak saklama kapları kullanılarak hipoksik kuluçka oluşturmak için bir yöntem tarif edilmektedir. Değişiklikler özel kuluçka gaz karışımına yapılacak ve dolaşan su banyosu hem de ısı kontrolü sağlar ve kolay sızıntıları tespit etmek kılan bir kütle akış kontrol ünitesinin eklenmesi sağlar. Bu yöntem, ticari olarak için düşük maliyetli bir alternatif sağlarmevcut birimler.

C. tabi özel laboratuvar yapımı kuluçka odasının AS 26 ° C 20 saat için elegans açıklanan (Bölüm 3.6.2) önemli mortalite (Şekil 1A) sonuçlandı olarak 5. Kurtulan GFP etiketli nöronal işlemlerinde punktum ve sonlarının sonraki flüoresan görüntüleme morfolojik anormalliklerin mevcut (Şekil 2) doğruladı. Kurtulanlar da ışık beden duvarı touch (Şekil 1B) iyi yanıt. Bu model, genetik yatkınlık, ilaç müdahale ve metabolik plastisite AS bağımlı sonuçlarını 4-6,8,9,12,13 nasıl etkilediğini incelemek için birden fazla grup tarafından kullanılmıştır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> Şekil 1. C. elegans hayatta kalma ve dokunmatik tepki sonrası24 saat sonrası-AS hayatta sergileyen solucan AS. A) yüzdesi. N2 gerginlik yabani tip genetik arka plan, ve KWN85 C yaşayan uyaranlara dokunmak GFP. B ile mec nöronları etiketler entegre transjeni) Tepki içeriyor AS sonrası elegans (N2 süzün). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> Şekil 2. Böyle dolambaçlı süreçler ve sonları (A) veya süreçler (B) GFP agrega birikimi AS sonra nöron değişiklikler dokunun. Dokunmatik nöron (PLML ve PLMR) anormallikleri kurtarabilecek izlenmiş C. anestezi eleg<html> ans AS sonra. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> Şekil 3,. Kirpik seçim. Bir araya kirpik seçim. Içerlek, kirpik bir ayrıntı kürdan ahşap yapıştırılmış. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> Şekil 4. Lab yapılan su banyosu içinde hipoksik odası. Denemeyi başlatmak için hazır kapalı bir kap. Oklar gaz giriş ve çıkış ve yüzen onu tutmak için kullanılan şişe ağırlığını göstermektedir. 231fig5.jpg &quot;/&gt; Şekil 5,. Kap kapağının, iç ve dış yan detaylı. Daha önce yapılan deliğine bağlı olan boru konektörünü gösteren, daha önce yapılan delik. B), kap kapağının dış tarafında bağlanmış tüp ve konnektör gösteren kap kapağının A) dış tarafında,.

Bir protokol C. anoksi / açlıkla kullanan tarif edilir iskemi / reperfüzyon modeli elegans. Fonksiyonel sonuçlar artmış mortalite, GFP etiketli nöronal süreçleri görünür anormallikleri, ve nöronal fonksiyonu gerektiren bozulmuş davranışsal tepkileri içermektedir.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Bu prosedürün genel amacı, sea elegance modelinde iskemi reperfüzyonu taklit etmektir. Bu işlem, sea elegance örneklerinin bir mikrotüpe aktarılması ve bakterilerin yıkanarak uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise anoksik bir ortam oluşturmaktır.Laboratuvar yapımı bir hipoksik oda kullanılarak, hayvanlar 20 saat boyunca anoksiye maruz bırakılır ve ardından 24 saat sonra aerobik koşullara yerleştirilir. Son adım, ölü hayvanların ve dokunma tepkisinin puanlanmasıdır. Nöronal modifikasyonlar da floresan mikroskopi aracılığıyla gözlemlenir.Nihayetinde, C. elegans'taki anoksi açlığı, üstökaryotlarda görülen iskemi yaralanmasıyla aynı koşulları daha kolay ve daha esnek bir genetik modelde oluşturmak için kullanılır. Bu tekniklerin, izole kalp hücrelerinde iskemi tekrarlamalı füzyonu gibi geleneksel yöntemlere göre sağladığı avantajlar, C. elegans'ın çok güçlü bir genetik model olması ve aynı zamanda şeffaf bir organizma olmasıdır; bu durum birçok farklı sıvı ve tekniğin kullanılmasına olanak tanır. Buna ek olarak, pahalı bir hipoksi veya çevreleme odası kullanmak yerine, sadece birkaç dolara mal olacak laboratuvar yapımı bir hipoksi ve çevreleme odasının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz.Genel olarak, bu konuyla ilgilenen kişilerin; örneğin tamponların temizlenmesi, solucanların puanlanmasında çok dikkatli olunması ve kullanılan sıcaklık ile oksijen miktarının sabit tutulması gibi bazı temel noktalara dikkat etmesi gerekir. Tüm bu noktalar deneyin sonucunu değiştirebilir. Özel bir hipoksik oda hazırlamak için, Tupperware tarzı sızdırmaz hava geçirmeyen bir kap, anoksik oda olarak yeniden düzenlenebilir. Mümkün olan en küçük kabı seçin; çünkü küçük bir kap hipoksik ortamı daha hızlı oluşturur ve su banyosuna yerleştirilmesi daha kolaydır.Kapağa, borulara uygun plastik veya metal bir konnektörün sığacağı boyutta iki delik açın; konnektörün hareket etmesini önlemek ve böylece sızıntı olasılığını azaltmak için konnektörü, su altında uygulanabilen ve kuruduktan sonra sertleşen bir yapıştırıcı ile yerine sabitleyin. Alternatif olarak, konnektörün kaba sızdırmaz bir şekilde sabitlenmesine yardımcı olmak için neopren bir pul kullanılabilir. Kabı, tamamen batacak şekilde su banyosuna yerleştirin.Kabı batırmak için bir şişe ağırlığı veya daldırma ağırlığı kullanın. Tüp bağlantılarından biri gaz karışımını iletmek için, diğeri ise basınç tahliyesi sağlamak için kullanılacaktır.Bu nedenle, kabın dış ortamdan izole edilmesi için su altında bırakılmalıdır. Metin protokolünde açıklandığı gibi C. elegans yetiştirmeye başlamak için, deneyden 30 dakika önce M9 tamponu hazırlayın, azot ile dengeleyerek oksijeni uzaklaştırın ve buz içinde muhafaza edin. Anoksi açlığı sırasında solucanların yerleştirileceği 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinin kapağına küçük bir delik açın.Delik, kapak açık tutulmadan gaz değişimine olanak tanır; kapağın açık kalması besiyerinin aşırı buharlaşmasına yol açabilir. Genç erişkin solucanlar içeren her 35 milimetrelik plakaya, oda sıcaklığında oksijenle doyurulmuş bir mililitre M nine tamponu ekleyin. Plakadan bakteri uzaklaştırmamaya dikkat edin.Yaklaşık bir dakika sonra, solucanlar M nine içerisinde yüzüyor olmalıdır. Ardından, steril %1BSA çözeltisini pipetleyip boşaltarak, bir mililitrelik pipet ucunu sığır serum albümini veya BSA ile kaplayın. M nine tamponu içeren plakayı dikkatlice eğin ve M nine'yi eklendiği yerden uzaklaştırın.Ardından süspansiyonu hazırlanan mikro santrifüj tüplerine yerleştirin. Solucanlar tüplerin dibine çökene kadar örnekleri buz üzerinde bekletin. Solucanları rahatsız etmeden tüpteki mümkün olan maksimum M9 miktarını uzaklaştırın.Ardından, oksijeni alınmış ve buz üzerinde soğutulmuş bir mililitre M9 ekleyin ve solucanlar dibe çökene kadar tüpü buz üzerinde bekletin. Bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Son yıkamada, tüpte yaklaşık 100 µL kalana kadar M9'u uzaklaştırın.Ardından, Deoksijenize M nine tamponu içindeki solucanların bulunduğu tüpleri hazneye yerleştirin ve hazneyi kapakla kapatarak dakika başına 100 milliliters sabit bir azot akışı sağlayın. Kabı 26 °C sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. Hava geri dönüşünü önlemek için çıkış tüpünün suya iyice daldırıldığından ve sistemde herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun.Solucanları 26 °C'de 20 saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından BSA kaplı bir uç kullanarak sea elegance'ı 35 mm'lik nematod büyüme ortamı plakasına pipetleyin. Plakaları 20 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Bunun ardından solucanlar skorlama için hazır olacaktır.Platin bir öze kullanarak, canlı solucanın başının üst kısmına hafifçe dokunun. Dokunulduğunda solucanlar geriye doğru hareket edecektir; eğer solucanlar tepki vermiyorsa, ölü olarak kaydedin. Nadiren bir solucan geriye doğru hareket etmeyebilir ancak hafif bir yanlara doğru baş hareketi sergileyebilir; teknik olarak ölü olmasalar da bu solucanların birkaç saat içinde ölmeleri neredeyse kesindir ve ölü olarak kaydedilmelidirler.Bu adımı, her solucan için on saniyelik aralıklarla 10 ila 15 kez tekrarlayın. Anoksi sonrası açlık ve nöronal modifikasyonları görselleştirmek için doğru veriler elde etmek amacıyla her grupta en az 10 solucanı inceleyin. Dokunmaya yanıt veren mech nöronlarında yeşil floresan protein veya GFP eksprese eden bir suş kullanın.%2 ARO çözeltisinden bir damlayı, alt kısımlarına tek bir parça bant yapıştırılmış iki diğer lam arasına yerleştirilen bir lam üzerine damlatın. %2 ARO çözeltisinin üzerine, birinci lama dik olacak şekilde son bir lam yerleştirin ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Bu işlem, bant kalınlığında bir ped oluşturmalıdır.Ardından üst lamı kaldırın ve solucanları hareketsiz hale getirecek olan %0,1 tetra aole içeren 10 µL M dokuz ekleyin. Yaklaşık 10 canlı solucanı %2 aro lamına taşıyın ve üzerlerine bir lamel kapatın. GFP'yi, uygun aydınlatma altında 100 x objektif kullanarak floresan mikroskobu ile görüntüleyin.Hasarlı nöronlar, birden fazla punctumdan oluşan ve/veya uzantıların kopmuş gibi göründüğü anomaliler içeren, uzantılarda sitozolik membran inci dizisi paterni gösterecektir. En az 10 solucan kullanarak, her solucan için her iki nöründeki punctum ve anomalileri sayın. C. elegans'ın özel yapım bir laboratuvar inkübasyon odasında 26 °C'de 20 saat boyunca anoksi ve açlığa maruz bırakılması, belirgin bir mortalite ile sonuçlanmıştır.Hayatta kalanlar ayrıca vücut duvarına hafifçe dokunulmasına karşı da zayıf tepki verdiler. Hayatta kalanların GFP ile işaretlenmiş nöronal çıkıntılarındaki noktacıkların ve kırıkların ardından yapılan floresan görüntüleme, morfolojik anomalilerin varlığını doğruladı. Bu videoyu izledikten sonra, iskeminin nasıl teşvik edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Laboratuvar ortamında üretilmiş hipoksik odacıklarda gözlem yapabilir; ayrıca C. elegans'ta ölümü ve nörolojik modifikasyonları ölçebilmelisiniz. Bu model, doğal iyon kanallarına yönelik müdahalelerin ve metabolizmanın, hipoksik koşullar altında yaşam ve ölüm üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla birçok grup tarafından kullanılmıştır.

an-anoxia-starvation-model-for-ischemiareperfusion-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

O tanımlanan konsantrasyonları ile atmosfer oluşturmak için sürekli akış hipoksi odalarına nasıl kullanılacağı Bu kağıdı...

Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma<em&gt; C. elegans</em

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Kaynak: Chen, Y. ve ark., Caenorhabditis elegans modelinde Aeromonas Enfeksiyonunun Virulansı ve Patogenezi Değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, patojenik Aeromonas suşları kullanılarak C. elegans (Caenorhabditis elegans) üzerinde kas nekrozu testini göstermektedir.  Aeromonas tohumlu plakalarda yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu olan solucanları besleyerek analiz, bakteriyel enfeksiyonu modeller ve floresan görüntüleme yoluyla doku hasarını ortaya çıkarır. Kas yapısının ve GFP...

Patojenik Aeromonas Suşuyla İndüklenen C. elegans'ta Kas Nekrozu Testi

Protein homeostazı, stres ve yaşlanma arasındaki ilişkiyi incelemek için, genetik olarak izlenebilir metazoan Caenorhabditis elegans'ı model sistem olarak kullanarak, protein disfonksiyonunu, hücredeki protein lokalizasyonunu ve organizma, hücresel ve protein seviyelerinde protein stabilitesini takip ederek protein katlanmasındaki değişiklikleri izledik.

Caenorhabditis elegans'ın Çok Hücreli Bir Organizmada Protein Homeostazını İncelemek için Model Sistem Olarak Kullanılması

Burada tarlada bu tekniğin standardizasyonu teşvik etmek mortalite olmadan tekrarlanabilir yaralanma ile sonuçlanan farelerde bağırsak iskemi-reperfüzyon ayrıntılı prosedürü açıklar. Bağırsak iskemi-reperfüzyon hasarının Bu model yaralanma ve yenilenme hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Bağırsak İskemi-reperfüzyon Hasarı Murin Modeli

Serebral iskemi-reperfüzyon bir fare modeli kontur Patofizyoloji araştırmak için kuruldu. Klemple sağ orta serebral arter ve şu ortak Karotid arter ligate ve kan akımı iskemi 10-40 dakika sonra geri yükleme.

Serebral iskemi-reperfüzyon iki damar tıkanıklığı fare modeli

Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans ana bilgisayar-patojen etkileşimleri incelemek için mükemmel bir modeldir. Burada açıklanan solucan mitis grubu streptokok üyeleri ile enfekte ve oksidatif stres tepkisi bu grup organizmalar tarafından üretilen H2O2 karşı aktivasyonu belirlemek için bir iletişim kuralıdır.

Oksidatif stres nedeniyle Mitis grubu streptokok Caenorhabditis elegans içinde eğitim

Burada, nematod C. elegans hücresel proteotoksik stres yanıtları floresan transkripsiyonel muhabirlerin aktivasyonunu ölçerek ve fizyolojik strese duyarlılık belirterek karakterize.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Burada, yaşla ilişkili nörodejeneratif hastalıkların hücresel ve moleküler temellerini izlemek ve incelemek için hiperaktive iyon kanal kaynaklı nekroz ve protein agrega kaynaklı nörotoksisite gibi çok yönlü nematod modellerini kullanan yaygın olarak erişilebilir metodolojileri tanıtıyor ve tanımlıyoruz.

Caenorhabditis elegans Yaş İlişkili Nörodejeneratif Hastalıkların Modellendirilmesi

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Öğrenin, C. elegans kullanarak iskemi/reperfüzyon hasarını modellemek için anoksi/açlık protokolünü. Bu yöntem, nöronal hasarı ve davranışsal yanıtları değerlendirmek için düşük maliyetli bir yaklaşım sunar.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli

Daha fazla video keşfet