Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tütün yaprağı epidermal hücrelerinde GFP etiketli bir raportörün geçici gen ekspresyonunu gözlemlemektir. Bu, önce kloroplast ve peroksizomlarda ifade edilecek bir DNA yapısı tasarlanarak elde edilir. Yapı daha sonra PCR amplifikasyonu ve Gibson montajı kullanılarak oluşturulur.

Daha sonra, yapıyı tütün yaprağı epidermal hücrelerine iletmek için bir gen tabancası kullanılır. Sonuç olarak, tütün yaprağının konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi, kloroplast ve peroksizomdaki GFP ekspresyonunu ortaya çıkarır. Bu tekniğin klasik klonlama gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, kısıtlama enzimleri gerektirmemesi ve bu nedenle PCR ile amplifiye edilebilen herhangi bir dizinin klonlanabilmesidir.

Genetik tasarımın esnekliği nedeniyle, bu tekniklerin uygulamaları daha büyük bir ölçeğe doğru uzanır. Tarımsal bitkilerin genetik mühendisliği: Bu protokole, nihai protein ekspresyonu için bitki hücresi içindeki bölgeleri belirleyerek başlayın. Bu çalışma için amaç, kloroplast, peroksizom ve sitozole yönelik ekspresyonunu hedeflemektir.

Ardından, ifade yapısını tasarlayın. Yapı, tek bir plazmit içinde bir promotör, saptanabilir bir gen ve bir sonlandırıcı içermelidir. Bu durumda, kurucu promotör P end cup iki, GFP'nin ifadesini yönlendirir ve bunu Nolene Synthe, sonlandırıcı veya nos t takip eder.

Bu deneyde, kloroplast ve peroksizomlarda ekspresyon için GFP'ye ifade edilen bir dizi etiketi, trit etiketlerini, bir, iki ve üç ifade edilen uç terminali test edeceğimizi unutmayın. Gibson montaj yöntemi, çift sarmallı DNA'nın uçlarını kısmen sindirmek ve komşu DNA dizilerinin tamamlayıcı baz çiftlerinin tavlanmasını kolaylaştırmak için önceden hazırlanmış bir karışımdaki birkaç enzimin etkisine bağlıdır. Son yapı, Gibson montajından önce dört PCR reaksiyonunda amplifiye edilmesi gereken üç parçaya sahiptir.

Birinci ve ikinci reaksiyonlar, GFP NOS T ve bir cany direnç markörü içeren 8.000 baz çifti plazmit vektörü, PORE'u amplifiye eder. Direnç işaretleyicisi, bu büyük DNA'yı daha kolay PCR amplifiye edilen iki küçük şablona bölmek için iyi bir noktadır. Üçüncü reaksiyon, promotör P uç fincan ikiyi amplifiye eder ve dördüncü reaksiyon, her bir parça arasında 50 baz çifti örtüşmesi olacak şekilde, baz için yapı tabanı olan maymun tasarımı gibi in silico tasarım yazılımını kullanarak triag birini amplifiye eder.

PCR için primer sipariş ederken, 50 baz çifti örtüşmesini primerler olarak kullanmak mümkündür Her bir bileşeni amplifiye etmek için PCR yaptıktan sonra, PCR ürününü ayrı ayrı saflaştırın ve damıtılmış deiyonize su ile seyreltin. PCR şablonu, kısıtlama enzimi DPN ile e coli tedavisinden bir mini hazırlık ise, kontamine şablon DNA'sı çıkarılacaktır. Ardından, DNA parçalarının her birinin konsantrasyonlarını ölçün.

Bir kontrol de dahil olmak üzere monte edilecek her yapı için vektör konsantrasyonunu mikrolitre başına yaklaşık 150 nanograma ayarlayın, Gibson Assembly karışımının 15 mikrolitrelik bir alikotunu dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözdürün. Çevrimiçi açık kaynak tool@gibbon kullanma. org, parçaların her birinin eşmolar miktarları için hacimleri belirleyin.

Parçaların her birinin hesaplanan hacmini 15 mikrolitre Gibson karışımına ekleyin. Ayrıca tek başına vektör DNA'nın bir kontrolünü hazırlayın. Her reaksiyonun toplam hacmi 20 mikrolitre olmalıdır.

Gerekirse ses seviyesini ayarlamak için su kullanın. Tüpleri 50 ila 55 santigrat derecede 30 ila 60 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tüpleri tekrar buzun üzerine yerleştirin.

200 mikrolitre kalsiyum klorür yetkin e coli'nin ticari bir preparatını içeren bir mikro fuge tüpünü eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve elle hafifçe ısıtın. Sonra reaksiyonun 20 mikrolitresini de e coli'ye ekleyin. Kültürleri buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, daha sonra 42 santigrat derecede bir su banyosuna aktarın ve 60 saniye boyunca ısı şoku uygulayın.

Elektro yetkin hücreler kullanmayın. Nispeten yüksek tuz konsantrasyonu ve düşük DNA konsantrasyonu, dönüşümü takiben hücrelerin ark yapmasına neden olabilir. Kültürleri iki dakika boyunca ICE'ye geri koyun, ardından 750 mikrolitre SOC veya LB ortamı uygulayın ve 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca iyileşmelerine izin verin.

Daha sonraki plaka, CANY veya başka bir uygun antibiyotik ile LB plakaları üzerindeki karışım, gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilir, sırayla 10 koloni taranır. Bu yöntemin, geleneksel ligasyon tabanlı klonlamaya göre daha yüksek bir arka plan ve daha fazla sayıda hedef olmayan rekombinasyon olayıyla sonuçlanabileceğini unutmayın. Tütünün bir gen tabancası ile biyotik transfeksiyonu daha önce JoVE'de tanımlanmıştır.

Burada, önceki protokollerden önemli adımlar ve farklılıklar gözden geçirilir. Yapıları güçlendirdikten ve izole ettikten sonra, woods ve zeto tarafından JoVE makalesinde anlatıldığı gibi gen tabancası mermileri hazırlayın ve bunları Nico Tania Benham Miana tütün yaprağı epidermal dokusunun transfeksiyonu için gen tabancasına yükleyin. Üç ila beş aylık bir bitkinin tabanına yakın büyük bir yaprak seçin.

Uygun göz ve kulak koruması kullanarak 15 santimetrelik bir Petri kabındaki ıslak kağıt havluların üzerine alt tarafı yukarı bakacak şekilde dikkatlice yerleştirin. Gen tabancası için helyum basıncını 200 ila 250 PS'ye ayarlayın. Gen tabancasını, bir yaprağın alt tarafındaki kaburgaların arasına, yaklaşık üç ila beş santimetre yukarısına dikkatlice nişan alıyorum. Güvenliği serbest bırakın ve parçacıkları yaprağa verin.

Her mermiyi yaprak üzerinde aynı yerde iki kez kullanın. Başka bir yere gidin ve yaprak patlarsa işlemi tekrarlayın, atın ve yeni bir yaprak başlatın. Yaş, nem vb. büyüme koşullarına bağlı olarak yaprak tokluğunda bazı farklılıklar vardır.

Tüm çekimler yapıldıktan sonra, yaprağın üzerini örtün ve iki ila üç gün düşük ışıkta bankta saklayın. Yaprağı UV floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobunda inceleyin ve GFP'yi ifade eden tek tek hücreleri arayın. GFP'yi ifade eden hücreler bulunduğunda, yaprağın beş ila 10 milimetrelik bölümünü dikkatlice çıkarmak için diseksiyon makası kullanın.

Her bir yaprak parçasını hemen yaklaşık 200 mikrolitre %0.1 Triton X 100 içeren derin bir kuyu mikroskop lamının kuyusuna daldırın. Deterjan, yüzeyde hava kabarcıklarının oluşmasını önlemeye yardımcı olur ve derin kuyu mikroskobu slaytı, uygun filtrelerle donatılmış bir konfokal mikroskop ve 40 x suya daldırma objektifi kullanarak daha büyük doku görüntüleme alanı görüntü hücrelerine izin verir. Bu çalışmada, üç farklı GFP organel hedefleme yapısı, untag GFP ve a rubis ile karşılaştırılmıştır. Öğr.

Etiketlenmemiş GFP'nin eksprese edildiği kontrol deneylerinde geçici olarak dönüştürülmüş tek hücrelerde GFP floresansını tespit etmek için GFP konfokal mikroskobu kullanıldı. Floresan sadece çekirdekte ve sitozolde gözlenir, ancak klorofilin kırmızı otofloresansı ile tanımlanan kloroplast gözlenmez, bu örnekte görüldüğü gibi sadece bir kloroplast Rubis Oag ile transfekte edilmiş bir hücre. GFP yapısı: GFP, büyük organellerde ifade edildi.

Hücre beyaz renkle belirtilmiştir. Sarı, yapının klorofil ile kolokalizasyon alanlarını gösterir, yapının kloroplastı hedeflediğini gösterir, bu üçlü görüntüde gösterildiği gibi, bir transfekte hücre GFP ekspresyonu kloroplast, periferiler, sitozol ve peroksizom olduğuna inanılan küçük punktat organellerde görülür. Benzer şekilde, transfekte edilmiş iki triag hücre, kloroplast sitozolünde GFP'yi de eksprese eder ve peroksizomlar, kloroplast dizisinin düşük karmaşıklık bölgesine gömülü bir peroksizom sinyalinden oluşan, sadece kloroplast ve peroksizoma lokalize olan triag üç

Bu hücrenin farklı bir yaprak katmanında olduğuna dikkat edin. Bu şekil, tipik bir tütün yaprağı epidermal hücresinin bölmelerinde gözlemlenen ifadeyi özetlemektedir. Hücre içindeki nispi boyutlar ve konumlar gösterilir ve gen tabancası transfeksiyonu ve konfokal mikroskopi ile gözlemlenen nispi ekspresyon seviyeleri gösterilir.

Etiketin kaldırılmasının GFP'nin sitozol ve çekirdeğe lokalize olduğunu, PIMT iki GFP kontrolünün kloroplasta lokalize olduğunu ve triag bir GFP, triag iki GFP ve Triag 3G FP'nin tahmin edildiği gibi kloroplast ve peroksizoma lokalize olduğunu unutmayın, Bu videoyu izledikten sonra, Gibson montajı ile bir plazmanın nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız, tütün yapraklarına bally verin ve üç gün içinde GFP ekspresyonunu gözlemleyin. Bu prosedürü denerken, Gibson montajı için vektör DNA'nın mikrolitresi başına 150 nanogram ve gen tabancası mermilerinizi yapmak için son DNA yapınızın mikrolitresi başına 1500 nanogram kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, geçici yerine kararlı gen ekspresyonu elde etmek için agrobacterium transfeksiyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.