Name: Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T15:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster pupalarında hücresel süreçleri canlı görüntüleme yöntemini. Hızlı taramalı konfokal mikroskop kullanarak mitoz, fagositoz ve morfojenez gibi dinamik olayları uzun süre gözlemleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar entelektüel desteği, maddi destek ve hisse senetleri için Akira Chiba kabul etmek istiyoruz. Yorumlar için Julia Dallman teşekkürler.

1.. Çalışma Fly <ol><li> Oda sıcaklığında 10 standart mısır unu-agar-pekmez-maya ortamda sinekler koruyun. </li><li> Haçlar için, eclosion 6 saat içinde bakireler izole. Istenen genotip erkeklere geçtikten sonra, değişim her 3-4 günde yeni şişelere uçar. </li></ol> Not: Bu deneyler için, Gal4 hat A9 kanat transgenlerin anlatımını sürmek için kullanılmıştır. Fly stokları Bloomington stok merkezinden elde edilebilir. Bu deneylerde kullanılan Hisse A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), SCO / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), 11, lollibow içerir. 2. Seçimi ve Pupa ve montajı <ol><li> Sahne pupa ya beyaz prepupa (RES) olarak toplanması ve bunların uygun yaşa gelinceye kadar 25 ° C&#39;de tutarak veya morfolojik kriterlere 12. kullanarak. </li><li> Hücre bölünmeleri, son zamanlarda baş tersine çevrilmesi uğramıştır seçeneğini pupa gözlemlemek için.Bu zaman kadar sadece eclosion (en&gt; 96 saat) önce, pupa hareketsiz uzun time-lapse gözlem izin vardır. </li><li> Önce su fırça üzerine onları dürterek yavaşça yapışkan gevşetmek ve izin için bir dakika bekleyen, su ile nemlendirilmiş bir fırça ile onlara dokunarak flakonlarından pupa çıkarın. </li><li> Yavaşça tükürük bezi yapıştırıcı ve gıda parçacıkları uzaklaştırmak için su içinde bir boya fırçası ile dürtüyordu seçilir pupa yıkayın. </li><li> Bir lamel altındaki (sayı 1 ½ lamelleri) ile bir 25 mm Petri kabı temiz pupa aktarın. </li><li> Ilgilenilen doku lamel en yakın olan, böylece bir destek olarak modelleme kil ya da diş balmumu ya da ince şeritler kullanılarak, pupa monte edin. Not: Burada anlatılan çalışmalarda, pupa kanatlar, bacaklar, karın histoblasts veya dorsal notum gözlenmiştir. Uygulamada, pupa durumda yüzeyinin 20 mikron olan bir doku gözlemlenebilir. </li><li> Orient pupa dikkatlice böylece tissuilgi e cam lamel yüzeyine paralel. </li><li> Pupa monte edildikten sonra, pupa ve lamel arasındaki boşluğa tiodietilen glikol (TDG) ince bir tabaka aktarmak için bir fırça kullanın. </li></ol> Not: TDG, yüzeye dağılımını azaltır yağın kırılma indeksi ile eşleşir ve oksijen doku 13 nüfuz sağlar. Bu hücre davranışlar hızlı durmasına neden olan, oksijenin dokulara mahrum eğilimi gibi yağlar kullanılması tavsiye edilmez. 3. Görüntüleme Not: görüntüleme için, konfokal mikroskop confocality pupa durumda yoğun aydınlatma neden obscuring arka çoğunu çıkarır gibi önemli olması muhtemeldir. <ol><li> Pupa gelişimi ve canlılığı üzerindeki aydınlatma etkisini en aza indirmek için konfokal ayarlarını. Bunu yapmak için, uyarma yoğunluğu ve toplama duyarlılığı arasında bir denge. Görüntüleme wi için tipik bir yapılandırmaLeica SP5 rezonans tarayıcı (8,000 Hz),% 2 olarak ayarlanmış lazer gücü (% 20 güç,% 10 geçirgenlik), 120 um iğne deliği grubu, ve hat 8 için kullanılan kurulu ortalama th. Ayarlar deney koşullarına bağlı olarak değişecektir. </li></ol> Not: ince ölçek onlar odak derinliğini sınırlamak olsa da başarılı, bu yöntem kullanılmıştır 40X ve 63X Petrol daldırma lens (0,1 mm çalışma mesafesi) bulunmaktadır gidermek için. 4. Analiz Çerçeveleri analiz etmek için, z-yığınları ya da film, izleme, ölçme ve sunum 14 için dosyaları değiştirmek için etkili araçlar vardır FIJI, veri dosyalarını içe. Örneğin mitoz tamamlamak için zamanı telofaz için profazın bir hücreyi izlerken kare ilerlemek için örnekleme aralığı ve çok boyutlu görüntü tarayıcı kullanılarak ölçüldü. x-, y-ve z-boyutları ölçme aracı kullanılarak ölçülebilir. Yazılım ve kullanımı hakkında ayrıntılı talimatlar içinbkz: http://fiji.sc/Fiji.

<ol><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+Fzy%2FCdc20+and+Fzr%2FCdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).</li>
<li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li>
<li>Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332, 354-358 (2011).</li>
<li>Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage%3A+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126, 3573-3584 (1999).</li>
<li>Ninov, N., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+epidermal+morphogenesis+during+the+development+of+the+adult+abdominal+epidermis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila.</a> Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).</li>
<li>Edgar, B. A., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+control+of+cell+cycle+regulators%3A+a+fly%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective.</a> Science. 274, 1646-1652 (1996).</li>
<li>Wirtz, R. A., Semey, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+kitchen%3A+equipment%2C+media+preparation%2C+and+supplies%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Information+Service%22%5BJournal%5D)">The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies.</a> Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).</li>
<li>Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+multicolor-labeled+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila.</a> Development. 140, 1605-1613 (2013).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C2%27-thiodiethanol%3A+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+is+a+broadly+conserved+feature+of+cell+division+in+pseudostratified+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia.</a> Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).</li>
<li>Sauer, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bölünen hücrelerin özellikleri, His2AvGFP ifade eden hücrelerin konfokal analizi ile Drosophila canlı pupa kanadında mitoz gözlemlemek için basit bir hazırlama gerekli geliştirme, görselleştirmek ölçmek ve ölçmek için. Bu yöntem, pupa kanadında hücre döngüsü onlar mitoz girmek epitelin apikal yüzeyine o çekirdekler hareket yalancı epiteliada döngüleri hücre güçlü benzerlikler taşıdığını belgelemek için kullanılmıştır. Telofaz ardından, çekirdekler geri epitel tabakasının içine bırakın. Dolayısıyla, bu tek tabak...

<html> Sirke sineği, Drosophila melanogaster. Drosophila araştırma anlatım, demonte ve mutasyonunu içeren gen manipülasyonu sofistike formları sağlar genetik deney zengin bir geçmişe sahiptir biyoloji birçok yönleriyle inceleyerek için iyi kurulmuş bir modeldir. Floresan proteini etiket gelişiyle, bu repertuar yaşayan hayvanlar hücre ve proteinlerin çalışmaları kapsayacak şekilde genişletti. Sinek embriyo in vivo 1-3 derin, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan küçük ve optik net gibi çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Sinek gelişme diğer aşamaları anestezi 4, diseksiyon ve kısa vadeli kültürünü 5,6 veya 7,8 görüntüleme için manikür pencerelerin oluşturulmasına gerektiren, daha az uysal olduğu kanıtlanmıştır. Bu manipülasyonlar, genellikle uzun vadede hayvan gelişimi uzlaşma ya da kısa süreler için görüntüleme sınırı şekillerde hayvan etkiler. En embriyonik hücre siklusu kesiliyor yana hücre siklus düzenleyicileri benzer genlerinde mutasyon roman incelemek için ent &quot;&gt; bu. hücre döngüsünün zamanlaması ve sadakat incelemek için uygun bir hazırlık bulmak için gerekli olan (SM veya S-G2-M) ve çalışma kapsamında mutantlar ileriki evrelere kadar, bu pupa aşaması dokularda hücre döngüsünü gözlemlemek için önemli kusurları görünmüyor. pupa epitel hücreleri daha tipik bir G1-S-G2-M hücre döngüsü ve bu aşamada pupa olan var kas hareketleri 9 yeteneğine sahip değildir. manipülasyonlar için başlangıç ​​noktası pupa davanın belirgin donukluk rağmen Histone2AV-GFP ifade bozulmamış bütün pupa. dahil, bu bozulmamış hazırlık vivo görüntüleme uzun vadede mükemmel olduğunu kanıtladı. Bu teknik basittir lisans araştırmacılar rutin Drosophila hücre ve gelişim biyolojisi yönlerini incelemek için kullanabilirsiniz ve henüz çözünürlük mikrometre ölçekli özellikleri ayrımcılığı sağlayacak kadar gayet yeterli. Bu yöntemle, saat, dakika veya saniye içinde olayların gözlemleri sadece zaman serisi parametrelerini ayarlayarak mümkündür. Mavi, yeşil, sarı, turuncu ve kırmızı floresan proteinleri, veya bunların kombinasyonları kullanılarak Videolar yapılmıştır. Önemli olarak, eğer bakım hatta uzun süreli görüntüleme hayvanların geliştirme veya canlılığı üzerinde bir etkisi yoktur, lazer yoğunluğu en aza indirmek için alınır.

<table><tbody><tr>Sinek <td>anestezitizasyonu için</td> <td>sinek malzemeleri sinek pedi</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td></tr><tr><td>CO2 gaz</td><td>Airgas Güney</td><td>CD50</td><td>Sinek anestezitizasyonu için</td></tr><tr><td>Regülatör</td><td>Airgas Güney</td><td></td><td>CO2 regülatörü</td></tr><tr><td>Sinek şişeleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-113RLBF</td><td>Sinek kültürü</td></tr><tr><td>Drosophila hatları:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam alt tabaklar # 1 1/2</td><td>WillCo Wells BV</td><td></td><td>Mikroskopi için</td></tr><tr><td>Tiyodietilen Glikol</td><td>Fluka</td><td>88559</td><td>mountant</td></tr><tr><td>Modelleme kil</td><td>sanat malzemeleri mağazası</td><td></td><td>Pupaları</td></tr><tr><td>Boya Fırçalarına</td> karşı konumlandırma desteği <td>sanat malzemeleri mağazası</td><td></td><td>Sinekleri manipüle etmek için</td></tr><tr><td>İnce Forseps, Inox #5</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>bilgisayar</td><td>herhangi bir</td><td></td><td>görüntü / film analizi için 8 Gb RAM</td></tr><tr><td>Fiji yazılımı</td><td></td><td>Ücretsiz yazılım http://fiji.sc/Fiji</td><td>Görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir hızlı tarama konfokal yeterli olmalıdır</td></tr><tr><td>20X kuru ve 40X veya 63X yağa daldırma lensleri</td><td>herhangi biri</td><td></td><td>Doku, hücresel ve hücre altı özellikleri</td></tr> <tr><td>görüntülemek içinDaldırma yağı (floresan olmayan)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>herhangi bir</td><td></td><td>sinek manipülasyonu için</td></tr></tbody></table>

ve pupa durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; drosophila melanogaster</em

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Hücre ve gelişim biyolojisi için bir model olarak Drosophila uzun süredir devam eden kullanım araçları bir dizi vermiştir. Birlikte, bu teknikler metodolojik açılardan çeşitli hücre ve gelişim biyolojisi analizini sağlamıştır. Canlı görüntüleme, hücre bölünmesi ya da hücre hareketi gibi dinamik hücre süreçlerini, gözlem için gelişmekte olan bir yöntemdir. Canlı görüntüleme kullanarak yerinde mitoz gözlemlemek için gerekli oldu uncharacterized farazi hücre döngüsü proteinleri mutasyonlar izole olması. Drosophila en canlı görüntüleme çalışmaları nedeniyle küçük boyutu ve optik netlik manipülasyon ve gözlem için erişilebilir embriyonik aşamalarında odaklanmıştır. Bu boşluk fazlarının biri ya da her ikisi yoksun olmasıyla Ancak, bu aşamada, hücre döngüsü sıra dışıdır. Buna karşılık, Drosophila pupa kanadının hücreleri, tipik bir hücre döngüsü ve pupa gelişme, yaklaşık 20 saat süren hızlı bir mitoz bir süre geçer. Bu i kolaydentify ve yerinde mitoz yakalamak için uygun sahnenin pupa izole. Montaj sağlam pupa deneyleri, hücre ve hayvan canlılığı üzerinde minimum etki ile birkaç saat çalışmasına izin veren, görüntüleme sırasında tractability ve dayanıklılık en iyi kombinasyonu sağladı. Yöntem olarak küçük, ya da daha küçük, kromozom sinek gibi özellikleri gözlem sağlar. Mikroskop ayarları ve montaj detayları ayarlanması, preparasyonun dahili zar komşu hücrelerin dinamiklerini ve bu tübülin gibi flüoresan etiketli proteinlerin görselleştirmek bırakıldı. Bu yöntem test edilen tüm floresan proteinleri için çalışıyor ve zaman ölçekleri çeşitli üzerinden Mikronaltı ölçek özelliklerini yakalayabilir. Geleneksel bir konfokal mikroskop ile pupa dış 20 um ile sınırlı olsa da, in vivo pupa dokularda protein ve dinamikleri hücresel gözlem için bu yaklaşım, bu hücre ve dokularda gelişimsel biyoloji çalışmaya genel olarak yararlı olabilir.

Gibi gelişmekte olan Drosophila göz, omurgalı ya da gelişmekte olan merkezi sinir sistemi içinde, ventriküler tabaka olarak yalancı epitel hücreler, nükleer hareketleri geçmesi, hücre döngüsü ile zaman içinde, interkinetic nükleer göç adlandırılır. Çekirdekler bazal yüzeyinde veya yakınında ve çekirdekler apikal yüzeye 15,16 ulaştığınızda hücrelerin mitoz girdiğinde DNA replikasyonu oluşur. Pupa kanat hücreler kafa eversiyonu sonra ilk birkaç saat boyunca bir hızla bölünen tek tabakalı epitel oluştur...

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Bu videoda, pupanın yapısal bütünlüğünü bozmadan Drosophila Melanogaster pupasının görüntülenmesine olanak tanıyan yeni teknikleri göstereceğiz. Pupa kılıfını sağlam tutarak, görüntülemenin pupanın gelişimi ve canlılığı üzerindeki etkisini en aza indiriyoruz. Görüntüleme için 8.000 hertz rezonans taramalı konfokal mikroskop kullanıyoruz.Önemli bir nokta olarak, bu mikroskobun çok hızlı tarama hızı ve yüksek hassasiyeti ağarma etkisini büyük ölçüde azaltarak uzun süreli gözlemlere olanak tanır. Bu yöntemle; davranış, fop, podia, morfogenez, fagositoz ve mitoz dahil olmak üzere çeşitli hücre biyolojik süreçlerini görselleştirebildik. Bu teknik sayesinde, organizmaya zarar vermeden olayları in situ olarak uzun süreler boyunca gözlemleyebiliyoruz.Bu yöntemlerden elde edilen gözlemler, drosophila gelişiminin nispeten erişilemez olan bu evresindeki çeşitli biyolojik fenomenleri anlamak için kullanılabilir. Uygun evrede, gelişim evresine dair temel göstergeleri arayarak onları henüz flakonda olduğumuz sırada inceleriz; hücre bölünmelerini çalışmak için başlarını çevirmiş ancak henüz yeşil paketler ve dorsal abdomende mekonium göstermemiş pupaları ararız. Tükürük yapıştırıcısını çözmek için su aktararak nemli bir boya fırçasıyla pupa kılıfına dokunulup bireyler gevşetilir. Ardından pupalar nazikçe itilerek serbest bırakılır, boya fırçasıyla alınır ve su içeren bir Petri kabına aktarılır.Gıda kalıntılarını veya debrisleri temizlemek için örnekler suyla iyice yıkanır. Ardından, doğru evrede olduklarından emin olmak için onları sırt kısımları yukarı bakacak şekilde yan yana dizeriz. Örnekleri dikkatle taşıyın.Boruda küçük bir delik oluşsa bile kolayca ölebilirler. Seçilen bireyler dikkatlice cam tabanlı bir Petri kabına yerleştirilir ve incelenmek istenen özelliğin kapatma camına en yakın ve yüzeye mümkün olduğunca paralel olacağı şekilde yönlendirilir. Pupa kanadını gözlemlemek için, pupayı ince bir tel, modelleme kili veya dental mum gibi bir desteğe yaslayarak yönlendirme sonrası hareket etmemelerini sağlarız.Ardından, ilgilenilen özelliğin görünür ve doğru yönlendirilmiş olduğundan emin olmak için kaba bakıyoruz. Genellikle, birinin floresan proteini eksprese etmemesi veya istenen evrede olmaması ihtimaline karşı aynı anda birden fazla pipa monte edilir. Tüm pipa'lar monte edilip uygun şekilde yönlendirildiğinde, her bir pipa'nın tabanına, kırıcılık indisi saf yağ ile uyumlu olan veya suyla seyreltilmiş, toksik olmayan bir sabitleyici olan diod dilin glycol ile nemlendirilmiş bir resim fırçasıyla dokunuyoruz.Bu işlem, hem pupil kasasından kaynaklanan kırınımı azaltma hem de daldırma lenslerinin kırılmasını azaltma şeklinde iki amaca hizmet eder. Pupil uygun şekilde monte edilip düzenlendikten sonra, lazer taramalı konfokal mikroskoba geçeriz. Rezonans tarayıcı ile donatılmış SP5 gibi ters mikroskop kullanırız.Kap mikroskoba yerleştirilir ve mikroskobun optik sistemi kullanılarak pupa bulunur. Pupa bulunduktan sonra, bu durumda ilgile olunan bölge olan kanat görünür olacak şekilde odak ayarı yapılır. Kanat, ortasından geçen büyük bir trakeal elementin varlığıyla tanımlanır.İlgi bölgesi belirlenip mikroskop odaklandığında, 20 x kuru objektife geçiyoruz. Odaklamayı yeniden onayladıktan sonra, mikroskobu konfokal moda alıyoruz. Işığa maruz kalmayı minimize etmek için konfokal parametrelerini ayarlıyoruz.Işık şiddeti %10 geçirgenliğin altında tutulur. Parlaklığı maksimize etmek için, azuma four ile 20 x lens için iğne deliğini 130 mikrona açıyoruz ve kazancı 900 volt olarak ayarlıyoruz. Bu ayarlar ile, mitotik aralığın süresini veya hayvanın sağlığını etkilemeden saatlerce görüntüleme yapabiliyoruz.Ardından, gözlemlemeye çalıştığımız biyolojik fenomenin özelliklerine uygun olacak şekilde Z kesit sayısını ve görüntü yakalama sıklığını ayarlıyoruz; örneğin, bir dakikalık görüntüleme aralıkları hücre bölünmesinin tüm önemli özelliklerini yakalamak için yeterlidir. Ancak filopodların dinamiklerini gözlemlemek için üç saniyelik aralıklar önemlidir. İstediğiniz özelliği bulana kadar epitel boyunca yukarı ve aşağı odaklama yapın.Gerekirse, zaman içinde Z-yığınları toplamak için mikroskobu ve XYZT modunu kullanın. Videoların süresi de önemli bir parametredir. 10 saat kadar uzun videolar hazırladık.Birden fazla floresan molekül aynı anda görüntülendiğinde, toplam görüntüleme süresini mümkün olduğunca kısa tutmaya çalışıyoruz. İlkesel olarak, her bir floresan etiket reaktif oksijen türlerinin üretimini artırır. Pratikte, üçlü etiketlenmiş hatların bir saat veya daha kısa süreli görüntülenmesine bağlı herhangi bir letalite gözlemlemedik.Hedef doku veya süreç yaklaşık beş mikrondan daha küçükse, muhtemelen bir immersiyon lensi kullanmanız gerekecektir. Bu lenslerin lazeri daha ince bir noktaya odakladığını, böylece ışık yoğunluğunu artırdığını unutmayın ve görüntüleme parametrelerini buna göre ayarlamanız gerekir. Videolar, konfokal mikroskoptan Fiji adlı ücretsiz görüntü analiz programının çalıştığı bir bilgisayara aktarılır. Fiji ile konfokal sistem tarafından oluşturulan çok boyutlu görüntülerdeki özellikleri açabilir, ölçebilir ve manipüle edebiliriz.Bu görüntüleme yöntemi, çekirdeklerin konumlarını hücre döngüsüne göre incelememize olanak sağlamıştır. Pupil kanadında, epitelyumun üst kısmından gözlemlenebilen en alt çekirdeklere kadar birer dakika aralıklarla Z yığını (Z stack) topladık. Bu videolarda, bölünmelerin yalnızca burada solda gösterilen apikal konfokal kesitlerde gerçekleştiğini gözlemledik; sağda gösterilen daha bazal kesitler, yeni bölünmüş çekirdeklerin yüzeysel tabakaya geri dönüşünü ortaya koymakta ancak mitozun diğer özelliklerini içermemektedir.Bu veriler, hızla bölünen pupa kanat epitelinin, çekirdeklerin mitoz sırasında epitelin apikal yüzeyine doğru hareket etmesi bakımından larva kanat diskine ve diğer MedOne epitel yapılarına benzer olduğunu göstermektedir. Bu ortaklığa rağmen, pupa kanat epiteli, çoğu çekirdeğin en üst katmana çok yakın olduğu nispeten tabakalanmamış bir yapıdadır.Pupila gelişiminin erken evrelerinde drosophila görüntülemeye yönelik önceki yöntemler, büyük ölçüde pupila kılıfının çıkarılması veya nüfuz edilmesi girişimleri nedeniyle engellenmiştir. Burada, organizmanın canlılığını etkilemeden gelişim sırasındaki yetişkin hücreleri görselleştirmemize olanak tanıyan yeni bir yaklaşımı tanımlıyoruz. Yöntemimiz, pupila kılıfını tamamen bozulmamış halde tutması bakımından diğerlerinden niteliksel olarak farklıdır.Konfokal mikroskobinin rezonanslı tarama ile kombinasyonu, pupilla kılıfının 20 mikron derinliğindeki gelişmekte olan dokuları görselleştirmemize olanak tanır. Derinlik çözünürlüğündeki temel kısıtlamalar, lensin çalışma mesafesi ve dokudaki kılıftan kaynaklanan saçılmadır. Bununla birlikte, yöntemimiz epitel hücrelerin özelliklerini apeksinden tabanına kadar çözünürlüğe kavuşturmamıza imkan sağlar.Bu tekniği mitoz, filopodya, podya, morfogenez ve fagositozu gözlemlemek için kullandık. Buna ek olarak, tek bir örnekte üç farklı floresan etiketi inceledik. Burada açıklanan yaklaşımların, pupil gelişiminin erken dönemini en dış epitel tabakalarının çalışılmasına uygun hale getirdiğine inanıyoruz.Genetik biliminin gücüyle birleştiğinde, bu erişilebilirlik yetişkin gelişimine dair anlayışımızı daha da geliştirebilir.

imaging-through-the-pupal-case-of-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Bu video, canlı hücre görüntüleme asimetrik sağlam duyu organı progenitör hücreleri ve epidermal hücrelerin bölünmesi için bir metodu...

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Source: Hellerman, M. B., et al. Drosophila Pupa Gözünün canlı görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2015)Video, bir Drosophila melanogaster pupasında göz desenini incelemek için canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir. Yeşil floresan proteini (GFP) etiketli belirteçler, gelişmekte olan göz yapısının oluşumu sırasında hücresel organizasyonun ve farklılaşmanın görselleştirilmesini sağlar.

Floresan mikroskobu kullanılarak Drosophila pupa gözünün canlı görüntülenmesi

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Burada, canlı genel ve kas-tendon morfogenez gelişim süreçlerinin özellikle yaşam görüntüleme gerçekleştirmek için kullanımı kolay ve çok yönlü bir yöntem mevcut Drosophila pupa.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Burada, fizyolojik koşullar altında hücresel ve hücre altı dinamikleri gözlemlemek için Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarından canlı eksplant beyinlerini hazırlamak, parçalamak, monte etmek ve görüntülemek için bir iş akışını tartışıyoruz.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Burada, pupa evresinde Drosophila bacağının uzun süreli canlı görüntülenmesi için pupariumun tamamen çıkarılmasını içeren bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol diğer dokulara da uygulanabilir.

Puparium çıkarıldıktan sonra Drosophila pupa bacak gelişiminin uzun süreli canlı görüntülenmesi

Drosophila , miyogenezin temel mekanizmalarını anlamak için güçlü bir modeldir. Toraks hemi-sezaritlerinin diseksiyonu ve hazırlanması için bu protokol, hem pupa hem de yetişkin aşamalarından dolaylı uçuş kasının mikroskopi analizini sağlar. Bu protokol, hücresel morfolojinin, protein lokalizasyonunun, kas yapısının ve miyogenezin diğer birçok yönünün konfokal görüntülenmesini sağlar.

Mikroskopi Yaklaşımları için Drosophila melanogaster Dolaylı Uçuş Kaslarının Diseksiyonu

Öğrenin Drosophila melanogaster pupalarında hücresel süreçleri canlı görüntüleme yöntemini. Hızlı taramalı konfokal mikroskop kullanarak mitoz, fagositoz ve morfojenez gibi dinamik olayları uzun süre gözlemleyin.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme

Daha fazla video keşfet