Name: Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An Ex Vivo Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Öğrenin, ekz vivo beyin dilimlerinde biyotinilasyon kullanarak nöronal yüzey proteinlerindeki akut değişiklikleri nicelendirmeyi. Bu yöntem, sinirbilim ve farmakoloji araştırmalarında protein trafiğini in situ incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma HEM NIH hibe DA15169 ve DA035224 tarafından finanse edildi

Tüm hayvan taşıma ve doku hasat onaylanan protokol # A1506 (Melikian, PI) ardından, Massachusetts Medical School Kurumsal Hayvan Bakım Kullanım Komitesi Üniversitesi (IACUC) esaslarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Gerekli çözümleri Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) - günlük taze olun 125 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 1.2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO 3, ve 11 mM glükoz Not: 10x stok solüsyonu olarak ACSF hazırlayın, NaHCO 3 ve glikoz hariç. Taze NaHCO 3 ve glukoz ile tamamlayan, 10x stok günlük 1x çalışan çözümler olun. Sükroz takviye ACSF (SACSF) - günlük taze olun 250 mM suc, 2.5 mM KCI, 1.2 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgCl2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO 3 ve 11, mM glukoz gül Not: 10x stok solüsyonu olarak SACSF hazırlayın, NaHCO 3 ve glikoz hariç. Taze NaHCO 3 ve glukoz ile tamamlayan, 10x stok günlük 1x çalışan çözümler olun. Sülfo-N-hidroksisukkinil-SS-Biotin (sülfo-NHS-SS-biyotin, Pierce Chemical Company) Stok çözeltileri, DMSO içinde 200 mg / ml olabilir ve birden fazla donma / erime döngüsüne karşı dayanıklı olan gerekir. Alikotlar -20 ° C&#39;de saklanır Sukkinil ester hızla sulu çözelti içinde hidrolize edilir, böylece çalışma çözeltiler önce dilimlerine uygulamadan hemen hazırlanmalıdır. Dilim Quench Çözüm ACSF 100 mM glisin ile desteklenmiş RIPA Liziz Buffer 10 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA,% 1 Triton-X-100,% 0.1 SDS,% 1 Na deoksikolat Proteaz inhibitörleri ile RIPA (RIPA / PI) - günlük taze olun RIPA 1 uM löpeptin, 1 uM pepstatin, 1 uM aprotinin ve 1 mM fenilmetil sülfonil fluorür ile takviye edilmiştir. 1.. Beyin Dilimleri hazırlayın <ol><li> Taze 1x SACSF ve 1x ACSF olun </li><li> Küçük bir beher buz üzerinde SACSF Chill. Bu durum, taze hasat edilmiş fare beyin tutmak için kullanılacaktır. </li><li> % 95 /% 5 O 2 / CO 2, buz üzerinde 20 dakika ile köpüren tarafından oksijen ile ACSF ve SACSF doyurun. </li><li> P30-38 farenin en uygun doku yaşam için kullanılmalıdır. Servikal dislokasyon ve başları kesilerek hayvanların Kurban ve hızla önceden soğutulmuş, oksijenli SACSF içine beyinleri kaldırın. </li><li> Bir titreşimli mikrotom kullanılarak, ilgi bölgesinde 300 mikron beyin bölümleri yapmak. </li><li> Eğer istenirse, dilimleri başka özel beyin bölgeleri veya ayrı sağa sırasıyla, kontrol ve deney dilimleri olarak kullanmak için sol hemisfer zenginleştirmek için önce toparlanmaya disseke edilebilir. </li><li> Bir ateş cilalı Pastör pipeti kullanarak, 24-yuvalı plakalar içine yerleştirilmiş odaları tabanlı bir örgü dilimleri aktarın. </li><li> Dilimleri sürekli, yumuşak kabarcıklarla, oksijenli ACSF, 40 dakika boyunca 31 ° C geri izin verin. </li></ol> 2. İlaç Tedavisi (uygunsa) ve Dilim Biyotinilasyonu <ol><li> Düzelmesinin ardından, önceden ısıtılmış (37 ° C), oksijenli ACSF köpüren sürekli% 95 /% 5 O 2 / CO 2 dilim yıkayın 3x. </li><li> Test bileşikleri ekleyin ve sürekli oksijenasyonu ile kuluçkaya yatmaktadır. <ol><li> Kolaylık sağlamak için, 10x konsantre ilacın 1/10 th ses eklemek, ve hafifçe ters çevirerek karıştırın. </li><li> Yavaşça istenen sıcaklıkta bir su banyosu içinde plakalar çalkalayın. </li></ol></li><li> Ardından ilaç tedavisi, hızlabuz soğuk ACSF 3x yıkayarak soğuk dilimleri. </li></ol> 3. Biotinylate Yüzey Proteinleri <ol><li> Hemen önce etiketlenmesi için buz gibi soğuk ACSF hazırlanması 1.0 mg / ml sülfo-NHS-biyotin-SS. </li><li> Dilimlerine sülfo-NHS-SS-biotin 0.75 ml ekleyin ve buz, 45 dakika dilimleri kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Buz üzerinde buz soğuk ACSF 10 dakika boyunca inkübe edilir, daha sonra buz soğukluğunda ACSF ile hızlı bir şekilde dilimleri üç kez yıkayın. </li><li> Buz dilim söndürme tamponu ile dilimleri üç kez yıkayın ve ücretsiz sülfo-NHS-SS-biotin gidermek için 0.75 ml dilim söndürme tamponu ile buz üzerinde iki kez, 25 dakika, kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 4. Doku hazırlanması lizatları <ol><li> Buz soğuk ACSF dilimleri üç kez yıkayın ve bir yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak bir mikro tüp her dilim aktarmak. </li><li> Yavaşça 200 xg, 1 dakika ve dikkatle aspire kalan ACSF santrifüj edilerek pelet dilim. </li><li> 400 ul buz gibi soğuk RIPA / PI ekleyin ve yukarı pipetleme dokusu kırmak ve aşağı bir kez P200 pip aracılığıylaette. </li><li> Aktarım, yeni bir tüpe dilim / RIPA liziz ayrılmış ve tamamlamak için, döndürme, 30 dak, 4 ° C inkübe edin. </li><li> Santrifüj ile hücre yıkıntıları pelet haline, 18,000 xg, 15 dakika, 4 ° C </li><li> , Bir standart olarak sığır serum albümini (BSA) ile BCA protein deneyi kullanılarak lisatı, protein konsantrasyonları belirler. </li></ol> 5. Biyotinilat Proteinler izole <ol><li> Boncuk / total protein oranını optimize. Not: Bireysel protein ekspresyon düzeyleri farklı beyin bölgeleri arasında yaygın olarak değişebilir. Doku lisat belirli bir miktarda biyotinile protein her yakalanır sürece, doğru bir yüzeyi ifade herhangi bir potansiyel değişiklikleri tespit etmek mümkün değildir. Bu nedenle, ampirik önce yeni bir dilim biotinilasyon çalışmaya girişmeden belirli bir protein / beyin bölge için en uygun boncuk / total protein oranını tespit etmek zorunludur. <ol><li> Artan miktar 25 ul streptavidin agaroz boncuklar inkübe, yıkama ve elüsyon adımları bağlanma için, aşağıda tarif edildiği gibi doku lisatı (yaklaşık 25-200 ug) ve bir s devam edin. </li><li> Ortaya çıkan immünoreaktif bantlar sayısal olarak ve artan ya da protein ya da azalmış yüzey ifadesi de doğru olarak izin verecek bağlayıcı doğrusal aralığı içinde bir boncuk / lizat oranını seçmek. </li></ol></li><li> Streptavidin-agaroz taneleri hazırlanması <ol><li> Bütün numuneler için gerekli toplam boncuk hacim belirler. 25 ul / numune = 100 ul boncuk + ekstra = 125 ul boncuk bir miktarı için yeterli bir boncuk hacmi artı bir ilave (yani 4 örnekleri hazırlayın. </li><li> Vortex Streptavidin boncuk stok ve pipet dışarı hacmi istenen. P200 pipet kullanarak ederse, tıkanıklık veya boncuk zarar görmesini önlemek için ucu ucuna kesti. </li><li> Oda bir öfke, 18.000 xg, 1 dakika santrifüj edilerek koruyucu, her RIPA eklenmesinden sonra vorteks ve yıkamalar arasında toplama boncuk kaldırmak için 0.5-1.0 ml RIPA / PI boncuk 3 kere yıkayınfaktöörlere. </li><li> Bir vakum şişeye bağlı bir cam Pasteur pipet kullanılarak yıkamalar arasında tampon aspire. Aspire cam Pasteur pipet ucuna takılı plastik P200 ucu ince kontrol sağlar. Bu pipet içine aspirasyon boncuk risk gibi, ilk iki yıkama için kesinlikle bütün tampon kaldırmak için gerekli değildir. Son yıkamadan sonra, boncuklar aspire olmadan mümkün olduğu kadar fazla tamponunu çıkarın. </li><li> Ve tekrar süspansiyon aşağı yukarı pipetleme, geri orijinal hacmi boncuk getirmek RIPA / PI ekleyin. Boncuklar boru duvarına sopa gibi, bu noktada vorteks kaçının. </li><li> Ucu ile bir P200 kullanarak mikrosantrifüj tüpler içine kısım boncuk kesti. Boncuk eşit askıya ve tüpler arasında dağınık kalmasını sağlamak için aşağı örnekleme arasında birkaç kez yukarı pipet ve. </li></ol></li><li> Streptavidin boncuk Bağlama biyotinile edilmiş proteinler <ol><li> Agaroz boncuklar içeren tüplere hücre lizatları dağıtın. Deneyleri için whe<html> Birden çok numune karşılaştırılan yeniden doğru karşılaştırmalar için, her numune için protein aynı miktarda kullanmak için emin olun. </li><li> 200 ul minimum hacme örnekleri getirmek ilave RIPA / PI ekleyin. Bu örnekler inkübasyon sırasında yeterince karıştırmak ve aynı zamanda örnekleri arasında, protein konsantrasyonları birleştiren garanti eder. </li><li> Bir boru rotator tüpler koyun ve 4 ° C&#39;de gece boyunca karıştırın </li><li> Ayrı tüpler içinde, her bir numune için kullanılan toplam lizat hacmi bir eşdeğerine dağıtmak. Numune hacimleri yüksek, alternatif olarak, toplam lizat hacmi bir kısmı SDS-PAGE jelleri üzerinde maksimum yük birimleri yerleştirmek için, bunun yerine ayrılmış olabilir. Bunlar toplam protein miktarı yüzey ekspresyonunu normalize etmek için kullanılacaktır. </li><li> Eşit 2X hacim veya 6x, SDS-PAGE örnek tamponu içinde 1/5 hacim ve ya örnekleri analiz edilinceye kadar -20 ° C&#39;de boncuk numuneleri ya da mağaza paralel olarak, 4 ° C de inkübe ya ekleyin. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Zehir ve örnekleri analiz <ol><li> Oda sıcaklığında, 18,000 xg, 2 dakika santrifüjleme ile boncuk Pelet. </li><li> Aspire yüzenler ve yıkama boncuk 0.75 ml RIPA&#39;da ile üç kez. Boncuk kaybını en aza indirmek için, yıkamalar arasında boncuk yukarıdaki tampon küçük bir baş hacmini bırakın. Son yıkamadan sonra, boncuk pelet bozmadan, mümkün olduğunca RIPA çıkarın. </li><li> Disülfid bağı azaltarak streptavidin biyotinile edilmiş proteinler boncuklardan Zehir. Örnek tampon, vorteks de azaltarak 25 ul 2x SDS-PAGE ekleyin ve numuneleri 30 dakika, oda sıcaklığını döndürün. Not: Birçok zar proteinleri ciddi şekilde zarar elektroforetik hareketlilik, SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde kaynatılmış zaman toplamak için bir yüksek eğilimi vardır. Bu araştırılmaktadır protein için durum ise, ısıtma örnekleri engellemek ve bunun yerine, oda sıcaklığında yavaşça elute. Kaynar (paralel değerlendirilen bir başka protein kaynamasını gerektiriyorsa örneğin) kesinlikle gerekli ise, SAMPLe tampon toplanmasını en aza indirmek için 2 M üre (nihai konsantrasyon) ile takviye edilebilir. Bazı durumlarda toplama azaltılmasında etkili olsa da, üre genellikle grup görünüşe uzlaşma. </li><li> Immunoblot&#39;da örnekleri analiz. </li><li> Toplam lizat örnekleri çözülme ve boncuk numuneleri, 30 dakika, oda sıcaklığı ile paralel olarak döner. </li><li> SDS-PAGE jelleri üzerinde ayrı proteinler. </li><li> Immünolojik işaretleme ile ilgilenilen protein (ler) belirlenmesi. <ol><li> Bantları uygun miktar tespiti için lineer aralığında tespit emin olun. </li><li> Biyotinilasyon reaktif hasarlı / tehlikeye hücreler yoluyla hücre içi proteinlerin erişim elde olmadığını temin etmek. Bu en iyi araştırılan hücre tipine özel bir hücre içi protein için paralel olarak immünolojik işaretleme ile gerçekleştirilir. </li><li> Bant yoğunluğu ölçmek, toplam protein ekspresyon seviyesinin bir yüzdesi olarak görece protein yüzey yoğunluğunu hesaplamak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+portals+of+entry+into+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li>
<li>Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li>
<li>Leto, D., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transport+by+insulin%3A+traffic+control+of+GLUT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).</li>
<li>Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+membrane+trafficking+defects+of+disease-associated+dynamin+2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations.</a> Traffic. 12, 1620-1633 (2011).</li>
<li>Li, X., DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recycling+endosome+and+its+role+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The recycling endosome and its role in neurological disorders.</a> Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).</li>
<li>Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-independent+endocytosis%3A+mechanisms+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Res. 20, 256-275 (2010).</li>
<li>Barry, M. F., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+trafficking+and+the+plasticity+of+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).</li>
<li>Bredt, D. S., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking at excitatory synapses.</a> Neuron. 40, 361-379 (2003).</li>
<li>Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+synapses+and+the+emergence+of+a+postsynaptic+mechanism+for+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+the+ventral+tegmental+area%3A+electrophysiological+and+behavioral+correlates+in+individual+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats.</a> J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).</li>
<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+dopamine+neurons%3A+Behavioral+correlates+in+GluRA%28-%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice.</a> PNAS. 101, 14282-14287 (2004).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+addiction%3A+the+role+of+reward-related+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).</li>
<li>Thomas, M. J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).</li>
<li>Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+protein+kinase+C-induced+internalization+of+the+dopamine+transporter+is+mediated+by+a+clathrin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism.</a> Traffic. 6, 157-170 (2005).</li>
<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical%2C+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li>
<li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li>
<li>Melikian, H. E., Buckley, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+trafficking+regulates+the+activity+of+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter.</a> J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).</li>
<li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+trafficking+of+the+human+dopamine+transporter.+Clathrin-mediated+internalization+and+lysosomal+degradation+in+response+to+phorbol+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters.</a> J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).</li>
<li>Sorkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screen+reveals+an+essential+role+of+Nedd4-2+in+dopamine+transporter+ubiquitination+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis.</a> J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).</li>
<li>Eriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dopamine+transporter+trafficking+in+live+neurons+by+use+of+fluorescent+cocaine+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs.</a> J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).</li>
<li>Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subcellular+distribution+of+endosomal+compartments+and+the+dopamine+transporter+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar finansal ilgilendiriyor bu çalışma ile bu çatışma var.

Beyinde kritik etkileri sinaptik sinyal endositik kaçakçılığı, kantitatif yetişkin nöronlarda protein yüzey ifade değişikliklerini ölçmek için zor kanıtlamıştır uzun zamandır bilgimiz rağmen. Bu çalışmada, akut beyin dilimleri yüzey proteini ex vivo etiketlemek için güvenilir bir yaklaşım rapor. Sinaptik bağlantıları ve bunların hazırlanması saat sonra hücre canlılığı muhafaza edilmesi gibi beyin dilim hazırlıkları, elektrofizyolojik kayıtlar için yarar bir süredir devam eden bir geçmişi var. Ayrıca, dilimleme ...

Endositik ticareti bütün zar proteinlerinin çeşitli plazma zarı tanıtımı ince ayar her yerde bulunan bir hücresel mekanizmadır. Endositozdan sonra hücre içi ortamı 1 için çok önemlidir besin sağlar ve reseptör aktivasyonu 2 tepki olarak reseptör sinyallemesini desensitizes. Geri plazma zarına dönüşüm endositik ek olarak hücre yüzeyinde de 3 protein ekspresyon seviyelerini arttırarak hücre sinyali artırabilir. Ayrıca, membran kaçakçılığı tedirginlikler protein endositik ticaretini yöneten moleküler mekanizmalarının araştırılması gerektiğini vurgulayarak, çok sayıda hastalık ve patolojik koşullarda 4,5 sorumlu tutulmaktadır. Çok protein, son birkaç yıl içinde kanıt montaj klasik klatrin bağımlı içselleştirme mekanizmaları kullanmak da çok klatrin bağımsız endositik mekanizmalar giderek artan bir dizi potansiyel endositik yöneten gösteriyorproteinler 6,7. Böylece, fizyolojik, ilgili sistemlerin ticareti kolaylaştırıcı endositik mekanizmaları araştırmak için ihtiyacı önemli ölçüde büyüdü. Beyinde, reseptörler, iyon kanalları ve nörotransmitter nakliyecilerin endositik kaçakçılığı sinaptik plastisite 8-11 ve sonuçta nöronal heyecanlanabilirliğini ve sinaptik yanıtları etkileyen kötüye 12-15 ilaçlara yanıt kurulmasında başlıca role sahiptir. Nöronal kaçakçılığı çalışmaların çoğunluğu heterolog ekspresyon sistemleri veya kültür birincil nöronlar ya güveniyor Bugüne kadar, ikisi de güvenilir bir yetişkin nöronların oynayan mekanizmaları yansıtıyor olabilir. Burada, sayısal olarak yetişkin kemirgenlerden türetilen akut beyin dilimleri yüzey proteini seviyelerini ölçmek için yüzey biyotinilasyonunu kullanan bir yaklaşım sunulmuştur. Bu yaklaşımı kullanarak, fare striatal dopamin taşıyıcısı hızla re içselleştirilmesini göstermek veri mevcutforbol ester-kaynaklı protein kinaz C (PKC) aktivasyonu için tepkisi uyarma.

<table><tbody><tr><td>sülfo NHS-SS-biotin</td><td>Pierce</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agaroz</td><td>Pierce</td><td>20347</td><td></td></tr><tr><td>IgG içermeyen, Proteaz içermeyen sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Titreşimli mikrotom kesitleyici</td><td>çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çalkalama su banyosu</td><td>çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell ağ tabanlı uçlar (8 & mikro; m gözenek boyutu)</td><td>Millipore</td><td>PI8P 012 50</td><td>Bunlar elde yıkanabilir ve tekrar kullanılabilir</td></tr></tbody></table>

beyin dilim biyotinilasyonu: an<em&gt; ex vivo</emyetişkin nöronlar bölge özgü plazma membran protein ticaretiyle tedbir&gt; yaklaşım

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Düzenlenmiş endositik kaçakçılığı dinamik bir dakika zaman ölçeğinde reseptör, iyon kanalı, ve taşıyıcı hücre yüzey sunum kontrol ederek, nöromodülasyonundaki etkinlikleri kolaylaştırmak merkezi mekanizmadır. Tek tek proteinlerin endositik kaçakçılığı kontrol eden mekanizmalarla geniş bir çeşitlilik bulunmaktadır. Ticareti moleküler temellerini araştıran çalışmalar öncelikle niceliksel dışsal uyaranlara ve gen manipülasyonu yanıt membran protein yüzey ifadesindeki değişiklikleri ölçmek için yüzey biyotinlasyonu dayanmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım esas olarak aynen yetişkin nöronların oynayan fizyolojik olarak ilgili mekanizmaları yansıtmayabilir kültürlenmiş hücreler, sınırlayıcı edilmiştir. Ayrıca, kültürlü hücre yaklaşımlar ticareti mekanizmaları bölgeye özgü farklılıkları hafife olabilir. Burada, biz akut beyin dilim hazırlanması için hücre yüzey biyotinilasyonunu uzanan bir yaklaşım açıklar. BizBu yöntem, yetişkin nöronların yüzey zar proteini seviyelerindeki hızlı değişiklikleri ölçmek için bir yüksek kalitede bir yaklaşım sağladığını gösterir. Bu yaklaşım nöronal endositik ticareti alanında geniş bir kullanım olması muhtemeldir.

Nöronal dopamin taşıyıcı hücre hatları 16-20 PKC aktivasyonuna karşılık olarak yerleştirilebilir. Hücre dizileri ve ifade sistemlerinin çeşitli kaynaklı PKC DAT yüzey kayıp gösteren çok sayıda raporlara rağmen, bu kültüre, dopaminerjik nöronların 21-23, bu bulguyu teyit etmek zor olmuştur. Biz doğrudan DAT yetişkin dopaminerjik nöronlarda PKC aktivasyonuna karşılık olarak içselleştiren olup olmadığını test etmek için fare striatal dilimleri kullanılır. Dilim hazırlandıktan sonra, dilimler aynı düzl...

Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Bu prosedürün genel amacı, nöronal yüzey proteinlerindeki akut değişimleri nicelleştirmektir. Ex vivo beyin dilimi preparatlarında bu işlem, öncelikle canlı akut beyin dilimlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, dilimler ilgili ilaçlarla işleme tabi tutulur.Ardından, hücre yüzey proteinleri membran geçirmez işaretleme reaktifleri kullanılarak işaretlenir. Son olarak, yüzeyde biyotinillenmiş proteinler streptavidin ve afinite kromatografisi kullanılarak izole edilir. Nihai olarak, ilaç tedavilerini takiben protein yüzey ekspresyonundaki değişimleri nicelendirmek için immünoplotlama kullanılır.Bu tekniğin, hücre tabanlı yöntemler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nöronal protein trafiğinin heterolog ekspresyon sistemlerinde veya primer nöronal kültürlerde değil, in situ olarak incelenmesidir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler canlı beyin dilimleri hazırlamakta zorlanacaktır. Beyin dilimlerini hazırlamak için, metin protokolüne uygun olarak taze 1x yapay serebrospinal sıvı (A CSF) ve sükroz takviyeli A CSF (S-A-C-S-F) hazırlayarak başlayın ve soğutun.Buz üzerindeki S-A-C-S-F, tamponları oksijenle doyurmak için buz üzerinde 20 dakika boyunca kabarcıklandı

brain-slice-biotinylation-an-ex-vivo-approach-to-measure-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Bir özel poliklonal antikor, hücre dışı epitopuna kullanarak canlı nöronlar yüzeyinde proteini etiket için bir yöntem tarif eder. Hücre yüzeyi üzerinde antikor tarafından bağlanan ve daha sonra endositoz üzerinden içsel protein Protein kalan ayırt veya inkübasyon sırasında yüzeye, kaçırılan edilebilir.

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

Biz, hipokampusun CA1 bölgesinde ve dilimin tetanized alan nükleer zenginleştirilmiş kısımların daha sonraki izolasyon Uzun süreli potansiyasyon indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yaklaşım, önemli aktivitesini öğrenme ve hafıza ile hücresel modellerinde bağımlı nükleer protein alma belirlemek için kullanılabilir.

Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak

BDNF, bir nörotrofik faktör, bir aksonal taşınması birçok nöron popülasyonlarının hayatta kalma ve fonksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bazı dejeneratif bozukluklar aksonal yapı ve fonksiyon bozulması ile işaretlenmiştir. Biz birincil nöronları kullanarak mikroakışkan odaları QD-BDNF canlı ticaretini incelemek için kullanılan teknikler gösterdi.

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

Işık mikroskobu teknikleri, biyokimyasal tahlillerle birleştiğinde, netrin bağımlı akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun katılımını aydınlatmaktadır. Bu tekniklerin kombinasyonu, akson dallanmasını ve hücre şekli değişikliğini kontrol eden moleküler mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Bu makalede, ayrılmış primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptörü (GluR) kaçakçılığı çalışması için bir yöntem sunulur. Endojen veya aşırı ifade reseptörlerinin farmakolojik yaklaşımlar ile birlikte etiketlenmesi için antikor beslemeli bir yaklaşım kullanarak, bu yöntem, GluR yüzey ifadesini düzenleyen moleküler mekanizmaların belirlenmesi için izin verir veya geri dönüşüm süreçleri.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Bu yöntem, akut beyin dilimleri kullanılarak endojen monoamin salınımının tespiti için basit bir teknik sunar. Kurulum, monoamin salınımı için bir doku tutucu içeren 48 kuyulu bir plaka kullanır. Serbest bırakılan monoamin, elektrokimyasal algılama ile birlikte HPLC tarafından analiz edilir. Ek olarak, bu teknik ilaç keşfi için bir tarama yöntemi sağlar.

Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Öğrenin, ekz vivo beyin dilimlerinde biyotinilasyon kullanarak nöronal yüzey proteinlerindeki akut değişiklikleri nicelendirmeyi. Bu yöntem, sinirbilim ve farmakoloji araştırmalarında protein trafiğini in situ incelemeyi sağlar.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An

Daha fazla video keşfet