Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An Ex Vivo Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, nöronal yüzey proteinlerindeki akut değişiklikleri ölçmektir. Ex vivo beyin dilimi preparatlarında, bu ilk önce canlı akut beyin dilimlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, dilimler ilgilenilen ilaçlarla tedavi edilir.

Daha sonra hücre yüzeyi proteinleri, membran imperian tonasyon reaktifleri kullanılarak etiketlenir. Son olarak, yüzey biyotinile proteinleri, strep avid ve afinite kromatografisi kullanılarak izole edilir. Sonuç olarak, ilaç tedavilerini takiben protein yüzey ekspresyonundaki değişiklikleri ölçmek için immün komplo kullanılır.

Bu tekniğin hücre bazlı asyon gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, nöronal protein kaçakçılığının heterolog ekspresyon sistemleri veya primer nöronal kültürlerden ziyade yerinde incelenmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişi, uygun marka dilimleri hazırlamak için mücadele edecektir. Tamam. Beyin dilimleri hazırlamak için taze bir x yapay beyin omurilik sıvısı veya A BOS yaparak başlayın ve metin protokolüne göre A CSF veya S-A-C-S-F takviyeli sükroz yapın, soğutun.

ICE üzerindeki S-A-C-S-F, buz üzerinde 20 dakika köpürerek tamponları oksijenle doyurmak için %5 karbondioksit ile %95 oksijen kullanır. Servikal çıkık ve dekapitasyon ile P 30 ila 38 fareyi feda ettikten ve beyinleri hızla çıkardıktan sonra, titreşimli bir mikrotom kullanarak önceden soğutulmuş oksijenli S-A-C-S-F'ye yerleştirin. İlgilenilen bölgede 300 mikronluk beyin kesitleri oluşturun ve istenirse sağ ve sol hemisferleri sırasıyla kontrol ve deney dilimleri olarak kullanmak üzere ayırın.

Ateşle parlatılmış bir pastier pipeti kullanarak, dilimleri oksijenli A BOS içeren ağ tabanlı tutma odalarına aktarın. Dilimlerin 31 santigrat derecede 40 dakika boyunca sürekli yumuşak köpürme ile iyileşmesine izin verin. İnkübasyondan sonra, dilimleri ayrı ayrı ağ odalarına aktarın.

24 oyuklu plakalarda ve dilimleri sürekli köpürme ile önceden ısıtılmış oksijenli A BOS'ta üç kez yıkayın. Bileşikler test ediliyorsa, 10 x konsantre bir ilacın hacminin 10'da birini ekleyin ve plakaları istenen sıcaklıkta bir su banyosunda hafifçe salladıktan sonra hafifçe ters çevirerek karıştırın. Aate yüzey proteinleri satın almak için dilimleri üç kez yıkayarak hızla soğutmak için buz gibi soğuk A CSF kullanın.

Buz gibi soğuk A BOS'ta mililitre sülfa N-H-S-S-S biyotin taze hazırlayın Dilimlere 0,75 mililitre çözelti ekleyin ve 45 dakika buz üzerinde inkübe edin. Dilimleri üç kez hızlı bir şekilde yıkamak için buz gibi soğuk A CSF kullandıktan sonra, buz üzerinde buz gibi soğuk A CSF'de 10 dakika inkübe edin, ardından dilimleri üç kez yıkamak için buz gibi soğuk dilim söndürme tamponu kullanın ve 0.75 mililitre dilim ile inkübe edin, doku lizatlarını hazırlamak için serbest suo NHSSS biyotini söndürmek için buz üzerinde her biri 25 dakika boyunca iki kez söndürme tamponu. Her dilimi bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için ateşle parlatılmış bir macun pipeti kullanmadan önce dilimleri buz gibi soğuk A SF'de üç kez yıkayın.

Dilimleri bir dakika boyunca 200 GS'de santrifüjle nazikçe pellet ve kalan A BOS'u dikkatlice aspire edin. Daha sonra 400 mikrolitre buz gibi ekleyin, bir pi yırtın ve lizizi tamamlamak için bir kez yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu parçalamak için bir P 200 pipet kullanın. Ayrışmış dokuyu taze bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 18.000 G'de dönen santrifüj ile dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 30 dakika inkübe edin.

Hücresel kalıntıları peletlemek için biyotinile proteinleri izole edin ve immünoblot ile analiz edin. Metin protokolüne göre, nöronal dopamin taşıyıcısı, hücre hatlarındaki PKC aktivasyonuna yanıt olarak içselleştirilir. Çeşitli hücre hatlarında ve ekspresyon sistemlerinde PKC'nin neden olduğu dopamin, aktif taşıyıcı veya borç yüzey kayıplarını gösteren birçok rapora rağmen, kültürlenmiş dopaminerjik nöronlarda bu bulguyu doğrulamak zor olmuştur, dat'ın görüldüğü gibi yetişkin dopaminerjik nöronlarda PKC aktivasyonuna yanıt olarak içselleştirilip içselleştirilmediğini doğrudan test etmek için fare stri AAL dilimlerini kullandık.

Burada, fesleğen veya araçla tedavi edilmiş koşullar altında fare striatumunda, hücre yüzeyinde toplam borcun 81.4 artı veya eksi %5.8'i ile sağlam DA yüzey ekspresyonu tespit ettik, dört top 12 ile PKC aktivasyonu. Myra State 13 asetat, dat yüzey ekspresyonunu önemli ölçüde azaltarak toplam borcun artı veya eksi %5.2'sine düşürdü, bu da plazma zarından yaklaşık %30'luk bir borç kaybına karşılık geliyor. Buna karşılık, toplam tirozin hidroksilazın sadece 1.6 artı veya eksi %0.4'ü, hücre içi lokalizasyonu ile tutarlı olarak biyotinile edildi ve tonlama reaktifinin dopaminerjik nöronların hücre içinden çıkarıldığını doğruladı.

Bu videoyu izledikten sonra, sağlam nöronal terminallerde artı zar protein ekspresyonundaki değişikliklerin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.