Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Bu prosedürün genel amacı myos küreleri oluşturmaktır. İnsan embriyonik kök hücrelerinden elde edilen iskelet kası hücrelerinden oluşan EB benzeri yapılar. Bu, Baf 60 C'nin lentiviral enfeksiyonu ile hücrelerin yeniden programlanmasıyla gerçekleştirilir.İşlemin ikinci adımı, aynı hücreleri ikinci bir virüs olan myo D lentivirüsü ile enfekte etmektir.

Enfekte olmuş hücreler daha sonra serum bazlı kültür ortamında beş gün boyunca EB benzeri agregalar oluşturmak üzere indüklenir. Daha sonra EB besiyeri, serum içermeyen bir diferansiyasyon besiyeri ile değiştirilir ve agregalar iki hafta daha miyos küreleri halinde büyütülür. Sonuç olarak, OCT gömülü agregaların bölümlerini görselleştirmek için immünofloresan kullanılır.

Bu tekniğin ana avantajı, mezenkimal veya mezodermal Progenitörlerden türetilen, gerçek sıralama gerektirmeyen ve bu nedenle üç boyutlu bir kültürel sistemle uyumlu olan iskelet kası hücrelerinin yüksek verimli dejenerasyonudur: Altı kuyucuklu plakalarda insan embriyonik kök hücrelerine enfeksiyondan bir gün önce, insan embriyonik kök hücre klonlaması ve geri kazanım takviyesi, bir sonraki iki mikromolar nihai konsantrasyon için 1000 x'te ortama eklenir gün, insan embriyonik kök hücrelerini yüksek titre banyosu 60 CGFP lentivirüsü ile enfekte eder. İlk olarak, bir mililitre işkembe ekleyerek ve plakayı beş dakika inkübe ederek bir hücre kuyusunu tek bir hücre süspansiyonuna ayırın. Ardından süspansiyonu toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hazırlanan ortamdan dokuz mililitre ekleyin ve hücreleri 1.200 RPM'de beş dakika boyunca döndürün ve bir mililitre mt. SIR, bir. Mililitre nihai konsantrasyonda altı mikrogramda poli beyin ve iki mikromolarda insan embriyonik kök hücre geri kazanım takviyesi ekleyin.

Daha sonra hücreleri bu çözelti içinde yeniden süspanse edin ve bunları altı kuyulu düşük bir bağlantı plakasının tek bir kuyusuna aktarın. Şimdi konsantre banyo 60 C virüsünü 100 milyonluk bir enfeksiyon çokluğunda ekleyin. Plakayı virüsle üç saat boyunca inkübe edin.

Daha sonra hücreleri toplayın ve iki matrigel kaplı plaka kuyusuna bölün. Her plakaya, biri iki mikromolar takviye ile iki mililitre mt, SIR ekleyin ve ardından hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, medyayı yeni medyayla değiştirin.

Hücreler, enfeksiyonun başlangıcından 48 saat sonra zaten topaklanmış gibi görünecektir. Enfeksiyon etkinliğini değerlendirmek için floresanı kontrol edin. Hücreler %80 birleşime gelene kadar günlük ortam değişikliklerine devam edin, ardından aynı protokolü kullanarak hücreleri ve myo D virüsünü hücrelere ayırın.

Enfekte olmuş hücreleri, bu büyüme noktasından bir gün önce% 80 birleşmeye ulaşana kadar günlük ortam değişiklikleriyle koruyun. Enfekte hücreleri ME'S plakasına geçirmek için santimetre kare başına 1000 hücrede matrigel kaplı plakalar üzerine MES plakası. Ertesi gün.

Onları ayırmak ve hücreleri hücrelere 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için ALI'yi kullanın. Dokuz mililitre insan embriyonik kök hücre ortamı ekleyin ve santrifüjleyin. Beş dakika boyunca 1.200 RPM ekleyin.

Resus, peletlenmiş hücreleri altı mililitrelik taze bir insan embriyonik kök hücre ortamında askıya alır. Şimdi ortamı iki tabak mes'ten çıkarın ve enfekte olmuş hücreleri bunlara ekleyin. Hücreleri birkaç gün inkübe edin.

Bir kez,% 80 izdiham ekleyin. Tüm ortamı çıkarın ve bir mililitre kollajenaz dört ekleyin. 37 santigrat derecede kollajenaz içinde beş dakika sonra mililitre başına bir miligram ekleyin.

Kollajenazı bir mililitre insan embriyonik kök hücre ortamı ile değiştirin. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında, 10 mililitrelik bir pipet ucu kullanarak kolonileri kazıyın, kolonileri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve çökmelerine izin verin. Üç dakika sonra, süpernatanı çıkarın ve insan embriyonik kök hücre ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin.

Daha sonra hücreleri metamfetamin plakalarına bir ila dört oranında plakalayın. Bu işlem için enfekte hücrelerin yüksek sayıda olması ve iyi kalitede koloniler oluşturmuş olması gerekir. Ortamı her bir oyuktan çıkarın ve bir mililitre kollajenaz ekleyin. Dört.

Daha önce olduğu gibi mililitre konsantrasyona bir miligram ekleyin ve beş dakika sonra kollajenaz reaksiyonunu EB ortamı ile değiştirerek ekleyin. Ve sonra kolonileri kazımak için hızlı bir şekilde bir mikroskop kullanın. 10 mililitrelik bir pipet ucu kullanarak, hücreleri küçük hücre kümelerine ayırmak mümkündür.

Bu agregaları 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve yaklaşık üç dakika yerleştikten sonra, süpernatanı çıkarın, hücreleri üç mililitre EB ortamında yeniden süspanse edin ve her şeyi altı kuyulu düşük bir bağlantı plakasının tek bir kuyusuna aktarın. Ertesi gün bu tabağı gece boyunca inkübe edin. Büyük koloni parçaları için onları kontrol edin.

Varsa bulunur. Beş mililitrelik bir pipetten birkaç kez geçirerek parçalayın. Çok sayıda yüzen tek hücre varsa, agregaları sedimantasyon yoluyla toplayın ve taze EB ortamı ile değiştirin.

Beş günlük kültürlemeden sonra medyayı her gün değiştirin. Hücre agregalarını toplayın ve bir kez iki mililitre PBS ile yıkayın, hücrelerin normal yerçekimi altında çökelmesine izin verin. Daha sonra PBS'yi üç mililitre DM ortamı ile değiştirin ve hücreleri sonraki 15 günlük kültür boyunca aynı plaka kuyucuklarına geri koyun.

Ortamı her üç günde bir değiştirin. Bu süre zarfında mezosferler oluşacaktır. İnsan embriyonik kök hücreleri, GFP floresan taşıyan banyo 60 C ile enfekte edildi.

72 saat sonra, hücreler gerçekler sıralandı. BAF 60 C eksprese eden hücreler yaklaşık% 75 co akıcılığına kadar büyütüldü ve daha sonra myo D lentivirüsü ile enfekte edildi. Enfekte hücrelerde kantitatif gerçek zamanlı PCR ile eksojen gen ekspresyonu tespit edildi.

Protein düzeyindeki ekspresyonu ve dağılımı incelendi. Daha sonraki GFP, baf 60 C ekspresyonuna karşılık gelir ve myo D ekspresyonunu kontrol etmek için bir myo D antikoru kullanıldı. İnsan embriyonik kök hücrelerinden 15 gün sonra EB benzeri agregalar oluşmaya başladı.

Miyos kürelerinin bir kısmı OCT bileşiğine gömüldü ve miyojenik ve miyozin ağır zincir belirteçleri için pozitif boyanmış bölüm kesitlendi. 10. günden başlayarak, myos kürelerinde sporadik kasılma gözlemlemek mümkün oldu. Bazı myos küreleri, belki de myos küreleri arasındaki füzyon nedeniyle farklı veya alışılmadık şekiller aldı.

Bu teknik, hastalık modelleme ve tedavisi alanındaki araştırmaları ilerletecektir, çünkü miyo küreler, farklı kas bozukluklarından etkilenen hastaların pluripotent kök hücrelerinden üretilebilir. Bu nedenle miyo küreler, ilaç temizliği ve hastalık patogenezi için uygun bir hastalık modeli sağlar.