Name: Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinden epigenetik yeniden programlama ile kas progenitörleri ve myosphere oluşturmayı. Bu yöntem, kas biyolojisi ve rejeneratif tıp araştırmaları için yüksek verimli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PLP Sanford Çocuk Sağlığı Araştırma Merkezi&#39;nin bir Associate Araştırmacı. R01AR056712, R01AR052779 ve Artrit ve Kas-iskelet Sağlık / Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü ve Cilt Hastalıkları (NIAMS), MDA ve Sanford Çocuk Sağlığı Araştırma ödül gelen P30 AR061303: Bu çalışma PLP&#39;ye aşağıdaki hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen projede Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı araştırma fonlarından yararlandı FP7-Sağlık - 2009 ENDOSTEM 241440 (tamir ve kas dokusunun bakımı için damar ilişkili kök hücre ve kas kök hücrelerinin aktivasyonu) SA tarafından desteklenmiştir. CIRM dostluk.

HESC 1. Enfeksiyon Bu protokol, yüksek titre lentivirüsler kodlayan BAF60C ve MyoD 13 gerektirir. Bu yapılar istek üzerine mevcuttur. <ol><li> Başlamadan önce Öneriler <ol><li> Besleyici ücretsiz koşullarına enfeksiyon viral alımı sırasında hücresel rakiplerini ortadan kaldırmak için (Şekil 2A) için enfeksiyon, plaka hESC yüksek verim sağlamak için. Gerçekten de, MEF&#39;ler HESC göre ve MyoD-aracılı dönüşüm için yetkin olduğu gibi enfekte herkesin bildiği gibi daha kolaydır. Bu nedenle, HESC kültürlerden MEFS ortadan enfeksiyon oranı artar. </li><li> Bu enfeksiyon, yüksek verim sağlamak için yüksek titre lentivirüsler olması tavsiye edilir. Enfeksiyon verimliliğini artırmak için Seçenekler &quot;enfeksiyon kontrol&quot; bölümünde tartışılmıştır. </li><li> Her kuyucuğa 1 mg / ml 1 ml Matrigel eklenerek Matrigel kaplı tabak hazırlayın ve en az 1 saat oda sıcaklığında (veya O bırakmak / N 4 ° C&#39;de mühürlübir gün önce hazırlandı ise). </li></ol></li><li> Enfeksiyon işlemi <ol><li> Enfeksiyondan bir gün önce <ol><li> 1000 X seyreltme (2 mM nihai konsantrasyon) de ortam içinde embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek ekleyin. </li></ol></li><li> Gün 0 - BAF60C ile enfeksiyon Not: İlk MyoD ile enfeksiyonu takiben BAF60C ile hESC enfeksiyon yapın. <ol><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca TrypLE 1 ml ile kuluçkalama ile tek bir hücre süspansiyonu olarak 14 koloni olarak yetiştirilen hESC bir 6-yuvalı plakanın bir kuyu ayrıştırmaları </li><li> 15 ml tüp transfer süspansiyon, 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj HESC orta ve 9 ml ekleyin. </li><li> Santrifüj sırasında, 1 ml mTeSR1, polibren (6 mg / ml) ve embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek (2 mM) ilave edilerek temiz bir tüp içinde enfeksiyon karışım hazırlayın. </li><li> Bir c yeniden askıya hücre topağı (yaklaşık olarak 5 x 10 5 -1 x 10 6 hücreonfluent iyi hESC) plastiğe yapışmasını engelleyen bir hücreler 6-çukurlu, düşük tutturucu levha, üzerine enfeksiyon karışımı ve plakanın 1 ml. </li><li> 8 10 MOl&#39;de BAF60C-IRES-GFP virüs ekleyin ve inkübatör içinde 3 saat inkübe </li><li> Virüs içeren hücre süspansiyonu toplayın ve iki Matrigel kaplı oyuklara eşit bölün. Daha sonra her bir oyuğa mTeSR1 + embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ekleyin ve inkübatör O / N bırakın. </li></ol></li><li> Gün 1 <ol><li> Dikkatle virüs içeren orta kaldırmak ve mTeSR1and iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ile değiştirin. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, hücreler topaklanmış başlayacaktır. </li></ol></li><li> Day2 - myod ile enfeksiyon <ol><li> Devam önce, enfeksiyon riski yüksek verim için emin olmak için flöresanlı bir mikroskop altında, hücrelerin floresans durumunu kontrol edin. Değilse, Infect kontrol &quot;bölümüne bakıniyonu &quot;. </li><li> Hücreler izdiham en az% 80 ulaştı varsa aşağıdaki işlemleri; Aksi önce işlem için ek bir gün bekleyin. </li><li> Ortamı çıkarın ve hücreleri ayırmak için TrypLE maddesi 1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe </li><li> Tarif from1.2.2.2 gibi tekrarlayın - 1.2.2.6 10 8 MOI&#39;da MyoD virüs ekledi. </li></ol></li><li> 3. Gün <ol><li> Dikkatle virüs içeren orta kaldırmak ve mTeSR1and iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ile değiştirin. </li><li> Matrigel Plaka MEF&#39;ler enfekte olmuş hücrelerin yayılmasını sağlamak için ertesi gün için 2.5 x 10 5 / cm 2 plakaları kaplı. </li></ol></li><li> 4. Gün <ol><li> Ortamı çıkarın ve hücreleri ayırmak için TrypLE maddesi 1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe </li><li> 15 ml Falcon tüpüne transfer hücreleri, 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj HESC orta ve 9 ml ekleyin. </li><li> Raldır süpernatan ve HESC orta 6 ml yeniden askıya. </li><li> Her bir MEF&#39;ler ihtiva eden 3 ml dağıtma 1:2 bir bölünme oranında MEF&#39;ler ihtiva eden 6 oyuklu plaka ve plaka hESC orta çıkarın. Koloniler izdiham ulaştığınızda! TIP, MyoD/BAF60C-infected hücrelerin bazı kuyularında bir rezerv stok olarak sıvı nitrojen içinde dondurulmuş olabilir. Donma orta 90 KOSR% ve% 10 DMSO artı 2 mM iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Desteği içerir. Geri kalan kuyular sonra farklılaşma protokole maruz olabilir - açıklama için aşağıya bakınız. Daha hücreleri daha myospheres üretmek için gerekli aşağıdaki gibi, enfekte HESC daha çoğaltılabilir: </li><li> Ortamı çıkarın ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1 mg / ml kollajenaz IV, 1 ml &#39;si ile inkübe </li><li> Kollajenaz IV çıkarın ve HESC ortamın 1 ml. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında 10 ml ucu ile koloniler kazımak. </li><li> Coloni ve parçaları toplayın, 15 ml bir tüp içinde ve 3 dakika boyunca tortu izin es. Daha sonra, bir oran 01:04 ile MEF&#39;ler tabakalarına HESC orta ve plaka içindeki süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın. </li></ol></li></ol></li><li> Enfeksiyon kontrol etme <ol><li> Hücreleri yayılan iken, RNA analizi için hasat ve (Temsilcisi sonuçları görmek) her aşamada doğru biyolojik durumu yansıtır biyobelirteçlere kontrol etmek için immünofloresans tarafından protein ekspresyon analizi gerçekleştirmek için daha küçük bir ölçekte enfekte hücreleri plaka tavsiye edilir. Yüksek titre lentivirüsler için beklenen enfekte olan hücrelerin yüzdesi en az% 80 olmalıdır. </li><li> Yüksek verim sağlamak için, lentiviral vektörler, floresan bir seçim işaretleyicisi ve / veya bir antibiyotik direnç sokulması, modifiye edilebilir. BAF60C ifade Bizim lentiviral Plazmid aynı zamanda GFP floresan taşır. </li><li> Bir floresan işaretleyici için hESC sıralama. Enfeksiyonunun düşük verimlilik durumunda floresan a kullanılması önerilirBAF60C virüs eksprese eden hücreler için zenginleştirmek ve daha sonra yüksek titre MyoD virüs ile enfekte etmek için hücreler (FACS-sıralama) sıralama ctivated hücreleri. <ol><li> Orta iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek sıralama gün önce ekleyin. </li><li> Sıralama günü, (günde 0 açıklandığı gibi) TrypLE tarafından hücreleri ayırmak ve FACS-tüplerde KO yedek serum artı iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Eki&#39;nde hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Sıralama sonunda, iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Desteği ekleyerek MEF&#39;ler plakalar üzerinde KO yedek serum ve plakadaki hücreleri toplamak. </li></ol></li></ol></li></ol> 2.. EB-benzeri İndüksiyon ve Farklılaşma <ol><li> Indüksiyon ve farklılaşma prosedür <ol><li> Gün 0 - EB indüksiyon <ol><li> Kuyunun (Şekil 2C) koloni sayısının yüksek olması, BAF60C/Myod-infected hESC farklılaşma başlamadan önce, emin olun. </li><li> Her bir Raldır ortam, PBS ile yıkayın ve 1 mg / ml kollajenaz IV, 1 ml. 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe </li><li> Kolajenaz çıkarın ve EB ortamın 1 ml. </li><li> , Bir teşhir mikroskopu altında hızlı bir şekilde, mekanik olarak 10 ml ucu ile kazınarak 400-800 hücre agregalar halinde kolonileri ayırmak. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde koloni parçalarını toplamak ve 3 dakika boyunca çöktürmek için izin verir. Süpernatantı, EB ortamının 3 ml yeniden askıya ve 6-kuyulu düşük bağlanma plakanın bir çukuruna hücre süspansiyonu aktarın. </li></ol></li><li> Gün 1 <ol><li> Geçmeden önce koloni büyüklüğü ve hücre ölümünü edin. Büyük parçalar varsa, bir 5 ml pipet, 3-4 kez hafifçe yukarı pipetleme ve onları yıkmak. Hücre ölümü çok yüksek ise (bir çok yüzer hücreler ve döküntüler) çekimi ile bir 15 ml&#39;lik bir tüp içinde agregalar toplayarak orta yerine taze ortam EB 3 ml ile levha, aşağıdaki gibi başka bir devam edin. </li><li> Ekle 1.5kuyu taze ortam ml EB </li></ol></li><li> 2. Gün <ol><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde kuyulardan agrega toplayarak orta değiştirin. Onları 2 dakika sakin olalım. </li><li> Süpernatantı taze EB orta 3 ml ile değiştirin ve aynı kuyuların üzerinde dağıtabilir. </li></ol></li><li> 3. Gün <ol><li> Kuyularda taze EB orta 1.5 ml ekleyin. </li></ol></li><li> 4. Gün <ol><li> &quot;2. Gün&quot; de anlatıldığı gibi devam edin. </li></ol></li><li> Gün 5 - EB-benzeri kümeler (Şekil 2B) ve andMyogenic farklılaşması. <ol><li> 2.1.3.1 tarif edildiği gibi agrega toplayın ve 2 ml PBS ile bir kez yıkama; toplanmış çöktürmek için izin verir. </li><li> PBS çıkarın ve DM orta 3 ml ekleyin; Aynı kuyu üzerinde plaka. </li></ol></li><li> Gün 6 - Gün 20 <ol><li> D6 kaynaktan d20 için her 3 günde bir, taze ortam ile orta yerine. Temsilci myospheres F gösterilirŞEKIL 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Denetleme myosphere farklılaşma <ol><li> Daha fazla ilerlemeden önce, bir önceki protokol JoVE 12&#39;de tarif edildiği gibi, OCT bileşiği içine gömülü myospheres bölümleri yaparak myospheres içinde miyojenik farklılaşma etkinliğini kontrol etmek için önerilmektedir. Böyle myognenin gibi miyojen belirteçleri (klon F5D, DSHB) ve miyozin ağır zincir (klon MF20, DSHB) (Temsilcisi sonuçları görmek) için bir imünoflüoresans lekeleme gerçekleştirin. Bu, 5 dakika boyunca sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.5 ile işlenerek antijen alma gerçekleştirmek için kritiktir EB bölümlerinde myogenin için boyama ile başarılı olmak için! Uç. Buna ek olarak, bu F5D ve MF20 antikorlar kullanılarak çift boyama için bu protokolü kullanmak mümkündür. </li></ol></li></ol> 3.. Medya Tarifler <ol><li> ESC orta DMEM-F12 1 mM L-glutamin % 20 Knockout Serum değiştirme ortamı (KOSR) 0.1 mM esas olmayan amino asitleri (NEAA) 50 U / ml penisilin / streptomisin (Pen / Strep) 0.1 mM beta-merkaptoetanol 8 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) </li><li> EB orta DMEM F12 1 mM L-glutamin % 15 FBS % 5 at serumu </li><li> DM ortamı DMEF F12 1X ITS Sıvı Medya Desteği 1X N-2 Ek </li></ol>

<ol><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li>
<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li>
<li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cassette+exchange%3A+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li>
<li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li>
<li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li>
<li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex%2C+esBAF%2C+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li>
<li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M. Human embryonic stem cell cardiogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarcova%2C+M+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+a+Laboratory+Guide%22">Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide</a>. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam. 227-237 (2007).</li>
<li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle%3A+the+role+of+MyoD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada önerilen protokol doğrudan hESC kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeleri oluşturmak için nasıl açıklar. Önerilen strateji tarama deneyleri ve gelişim çalışmalarında hem modeli &quot;bir çanak içinde hastalık&quot; olarak uygun olabilir süspansiyon mini kasları üretmek için görülmemiş ve olağanüstü bir potansiyele sahip. Ayrıca, hESC myospheres üretmek için yöntem basittir ve tipik olarak geri kazanılan hücre verimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olan farklılaşması sırasında herhangi bir FACS-ayırma adımı gerektirmez. Bu, tek hücre içine EB bir ayrışma olduğunu ima eder Bunun yanı sıra, farklılaşması sırasında bir ayırma prosedürü toplama müdahale olacaktır. Önerilen yöntem, pluripotent kök hücrelerde ifade olmayan özel faktörlere ve MyoD BaAF60C ile hESC epigenetik reprograming dayanmaktadır. MyoD ve BAF60C &quot;çekirdek&quot; protein kompleksi TH sağlamakişaretleri de transkripsiyon iskelet miyojen programı etkinleştirmek için devam hangi genomik loci. Bu iki faktör lentiviral enfeksiyonların yoluyla hücrelere teslim ve bütün hücrelerde her iki faktörün enfeksiyon yüksek verim elde etmek için kritiktir edilir. Bu yüksek titreli bir virüs ya da seçim işaretçileri sahip virüs kullanılarak elde edilebilir. Kültür koşulları da kas kaynaklı farklılaşma ölçüde optimize de önemli bir rol oynamaktadır. Iskelet myotubes miyojen öncüllerinin dönüşüm elde etmek - Biz, serum serbest tanımlanmış ortamda inkübasyon (ITS insülin transferin içeren) izledi miyojen öncüleri kümeler halinde hESC ifade MyoD/BAF60C farklılaşması için bir serum bazlı farklılaşma protokol öneriyoruz. Ancak, diğer tanımlanmış medya eşit veya daha iyi miyojen farklılaşma elde etmesi mümkündür. Protokolün bir akım sınırlama yanında içeren, fetal sığır serumu, kullanımına dayanır olmasıdırbirçok hayvan proteinleri ve maddeler ing, çok partiye farklılıklar göstermektedir. Bu myospheres içinde kas kaynaklı dönüşümü daha düşük verimlilik veya heterojen neden olabilir. Notun, BAF60/MyoD-expressing hESC türetilen tüm EB-benzeri yapılar myospheres değil; yani, bazı tamamen myofibers oluşan EB gibi agrega vardır. (Sonuçlar bakınız) protokolünün sonunda gerçekleştirilen EB bölümleri üzerinde imüno-boyama ile tahmin edildiği üzere, normal BAF60C ve MyoD ifade hESC türetilen myospheres sayısı 30 ila 60% arasında değişebilir. Sadece myospheres için bir kültür çanak zenginleştirmek için olası bir yaklaşım miyojen muhabiri kullanmak olacaktır. Bu, kısmen ya da farklılaşmış EB benzeri gruplar atarak ve sadece myospheres seçerek kolaylaştıracaktır. Son olarak, tanıtılan faktörlerin zamansal şartları altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması teslimat yöntemi geliştirmek için yararlı olacaktır. Örneğin, BAF60C ve MyoD sadece sh için gereklidirort zaman doğru yönde &quot;tekme&quot; hücreleri için, modifiye mRNA teslim dayalı yöntemler uygulanabilir olabilir. Faktörleri hücreler, endojen proteinler istismar önce daha uzun bir süre için gereklidir Buna karşın eğer, epizomal bir yaklaşım değişkenliği ve genomuna entegrasyonu nedeniyle kontrolsüz etkilerini ortadan kaldırmak için tavsiye edilir. Son olarak, bu önce, iskelet kas içine HESC dönüşüm elde etmek için ya da MyoD (hiçbir zaman sonra) ile aynı anda BAF60C ifade etmek için zorunlu olduğunu not edin. BAF60C önceden ekspresyonu için gereksinim muhtemelen genom 6,15 ile uygun MyoD kromatin dağıtımı için epigenetik manzara ön ayar rolü dayanır. Gibi, gelecekte protokoller bileşikler veya hESC BAF60C ifadesini destekleyen diğer manipülasyonlar tarafından geliştirilmiş olabilir.

Pluripotensini koruyarak çünkü kendi benzersiz yeteneği kendini yenilemek, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) rejeneratif tıpta paha biçilmez bir kaynak olarak kabul edilir. In vitro hastalık modelleme için iskelet kaslarının hastalıklı kas ve HESC-veya uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin hücre aracılı iskânından Kök (iPSC) türetilmiş nesil tedaviler belirlenmesi ve birçok nöromüsküler hastalıkların patogenezi tanıtılması amaçlanmıştır çalışmaların önemli hedefleri vardır. Ancak bu çalışmalar iskelet kası hücrelerine dönüştürmek için hESC direnci ve iskelet Miyogenesis doğru HESC-taahhüdünün moleküler düzenlenmesi ile ilgili bilgilerin azlığı meydan olmuştur. Gerçekten de, hESC iskelet kası ata hücreleri üretmek için daha önceki girişimler sadece embriyoit gövde (EB) türetilmiş yavrularıyla veya mezenkimal hücreler transkripsiyonel aktivatör elemanının ve ektopik ifade (alttaki iskelet Miyogenesis aktif hale getirmek için yeterli olduğunu ortaya örPax3 veya Myf5) 1-3 ya da özel kültür koşulları 4-5 maruz kalma. Daha önce (SMARCD3 tarafından kodlanan) SWI / SNF bileşen, BAF60C, kas özel lokusların 6 MyoD aracılı aktivasyonunu sağlar: transkripsiyonel makinelerin önemli bir bileşen olduğunu göstermiştir. Yakın zamanda BAF60C seçici olmaması HESC üzerine başka bir somatik hücreler 8-10 ifade BAF60C gözlenmiştir iskelet Miyogenesis 7&#39;nin MyoD aracılı aktivasyonu için direnç kazandıran keşfettiler bir işlem genel olarak kas kaynaklı dönüştürme anılacaktır. BAF60C Zorla ifadesi doğrudan BAF60C ve miyojen soy 7 doğru hESC taahhüt epigenetik bir imza heybetli myod ile, belirli bir kültür şartlara bağlı, hESC iskelet Miyogenesis etkinleştirmek için myod sağlar. Not, önceki proteomik analiz BAF6 seçici olmadığını ortaya0C, SWI / SNF bileşenleri arasında, EKH 11. Biz üç boyutlu kasılma oluşturmak için toplanmış olabilir iskelet miyoblastların homojen bir nüfus nesil lider, miyojenik soy üzerine hESC epigenetik bir taahhüt altına bu bilgi kullanılır yapıları (myospheres), işlevsel taklit minyatür iskelet kasları 7. Nitekim, hESC iskelet kas atalarıdır üreten bizim yöntem böyle hücresi gibi hücreler farklılaşma sinyallere maruz kadar fenotipik gizildir miyogenik soyu, için hESC epigenetik taahhüt dayanır farklılaştırma ortamı içinde toplama ve kültür (belirli bir protokol bakınız). Bu strateji epigenetik iskelet kası soy kararlı ve histolojik iskelet ve fonksiyonel özellikleri özetlemek üç boyutlu kasılma myospheres oluşumuna uygun olan hESC bir homojendirler ve genişlemesine izin verenkaslar. Myospheres kas hastalıklarının modeli bir &quot;bulaşık hastalık&quot; için işletilebilir minyatür kasların ilk kanıt. Hasta türetilmiş iPSCs üretilen, bu myospheres tedavi edici bileşiklerin yüksek veri akışı tarama için bir araç olarak büyük potansiyel sunan ek olarak, uzun süredir devam eden gelişim soru aydınlatmak için potansiyel ve nadir hastalıkların patojenezi. Ayrıca Gomes et al. 12 ile bir JoVE protokolde tarif edildiği gibi analiz myosphere hemen tek bir okuma, bölme immünohistokimyasal olarak temin edilebilir olduğuna dikkat

<table><tbody><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu düşük bağlantı plakası</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>GFR Matrigel</td><td>BD Biosciencies</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEF'ler (büyüme durduruldu) 14</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajen IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>1 mM L-glutamin (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/Strep (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>İnvitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ITS Sıvı Ortam Takviyesi</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>N2-takviyesi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Invitrogen</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Hücre Klonlama ve Kurtarma Takviyesi</a></td><td>Stemgent</td><td>01-0014-100</td><td></td></tr><tr><td>bfgf</td><td>Sigma</td><td>4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Anti-miyojenin</td><td>DSHB</td><td>F5D</td><td></td></tr></tbody></table>

epigenetik yeniden programlanması ile hesc itibaren myospheres Üretimi

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ikinci iskelet kas hücrelerinin homojen ve bol nüfusun Üretimi hücre bazlı terapiler için ve insan nöromüsküler hastalıklar modeli bir &quot;bir bulaşık hastalık&quot; için bir gerekliliktir. Örneğin düşük yoğunlukta ve ilgi nüfus, hem de üç boyutlu kasılma yapıların oluşumu için protokoller eksikliği heterojenlik gibi büyük engel, nöromüsküler bozukluklar için kök hücrelerin kullanımı da sınırlıdır. Biz HESC tanımlanan faktörlerin ektopik getirilmesi ile bu sınırları aşan bir protokol tasarladık - kas belirleyicidir MyoD ve SWI / SNF kromatin karmaşık bileşen BAF60C biçimlenme - iskelet kası hücrelerine hESC yeniden programlamak mümkün olduğunu. Burada protokol HESC türetilmiş miyoblastları oluşturmak ve üç boyutlu minyatür yapılar (myospheres) onların kümelenmeyi teşvik için kurulan açıklayan fonksiyonel taklit minyatür iskelet kasları 7 </sup&gt;.

Şekil 1A protokolünün şematik hESC myospheres oluşturmak için önerilen gösterir. (Oklar ile belirtilen) kontrol etmek için en önemli adımlar hESC enfeksiyonun etkinliği ve myospheres içindeki kas kaynaklı dönüştürme bulunmaktadır. Deneylerde GFP floresan taşıyan lentiviral vektör kodlama BAF60C yararlanmak. Genellikle BAF60C ifade nüfus için zenginleştirmek için enfeksiyondan sonra BAF60C ve FACS-sıralama 72 saat ile hücreleri enfekte etmektedir. Hücreler izdiham yaklaşık% 70-80 ulaştığında, biz MyoD lentivirüsünün ile enfekte. İlk enfeksiyondan sonra, normal olarak bu izdiham ulaşmak için, hücreler için iki ya da üç gün sürer. Şekil 1B bulaşmamış HESC misli indüksiyon göreceli olarak eksojen genlerin ifade seviyelerini gösterir. Şekil 1C tanıtılan faktörlerin protein seviyesinde ifade ve dağılımını gösterir. BAF60C<html> MyoD ifade MyoD antikoru ile bağışıklık fluorışıması yoluyla tespit edilir ise ifade GFP floresan olarak gösterilir. Biz EB gibi agrega içine enfekte hESC farklılaşma başlatmak gün Günü 0 düşünün. DM ortamı içinde 15 gün sonra, myospheres bir kısmı (genelde bir bütün oyuk) bileşik 12 Ekim gömülü ve kas kaynaklı dönüştürme etkinliğini kontrol etmek için kas kaynaklı işaretleri için immünofloresan gerçekleştirmek için kesilir. Şekil 1D myogenin ve miyozin ağır zincir için temsili boyamasını göstermektedir optimal miyojen farklılaşma. Myospheres belki de daha küçük myospheres ile füzyon sonucunda, farklı ya da anormal şekillere sahip olabilir. Günün 10 başlayarak, (film 1 ve 2 bakınız) myospheres sporadik daralmayı gözlemlemek mümkündür. 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. A) hESC. B&#39;den myospheres) BAF60C ve MyoD (H9-BM) QRT-PCR ile gözlenmiş ve katı bir endüksiyon olarak ifade ile enfekte HESC olarak dışsal genin mRNA seviyeleri üretimi için kullanılan protokol şematik olarak enfekte hESC taklit göre nedeniyle. D) immünofloresan Myogenin için boyandı myosphere bölümlerinde gerçekleştirilmiştir vektöründe IRES-GFP elemanı (MYOG için MyoD boyama (kırmızı) ve BAF60C floresan (yeşil) arası (H9-ctr). C) immünofloresan görsel ), miyozin ağır zincir (MyHC) ve DAPI için zıt (İmmünofloresan detaylarını görmek). Ölçek çubuğu 100 mikron. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Şekil 2. Farklı aşamalarında hücre görünümü Temsilcisi resimlerifarklılaşması (Bölüm II) için enfeksiyon (part I) protokolü. Ölçek çubuğu 100 mikron. EB-benzeri yapıların ise d1 den d5 şekil (D) çoğunlukla dairesel, Şekil 1A şeması beklenmeyen bir şekil sunmak ve kültür heterojen göre 15 gün içinde büyüdü myospheres; E ve F iki örneklere bakın.

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Bu prosedürün genel amacı, insan embriyonik kök hücrelerinden elde edilen iskelet kas hücrelerinden oluşan EB benzeri yapılar olan myos küreleri üretmektir. Bu işlem, Baf 60 C'nin lentiviral enfeksiyonu ile hücrelerin yeniden programlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, aynı hücreleri ikinci bir virüs olan myo D lentivirüsü ile enfekte etmektir.Enfekte hücreler daha sonra serum bazlı kültür ortamında beş gün boyunca EB benzeri agregatlar oluşturmaya teşvik edilir. Ardından EB ortamı, serumsuz bir diferansiyasyon ortamı ile değiştirilir ve agregatlar iki hafta daha büyütülerek miyosferlere dönüştürülür. Son olarak, OCT'ye gömülmüş agregat kesitlerini görüntülemek için immünofloresan yöntemi kullanılır.Bu tekniğin temel avantajı, mezenkimal veya mezodermal öncüllerden türetilmesine benzer şekilde, iskelet kas hücrelerinin yüksek verimle farklılaştırılmasıdır; bu süreç hücre ayıklama gerektirmez ve bu nedenle üç boyutlu bir kültür sistemiyle uyumludur. Altı kuyucuklu plakalardaki insan embriyonik kök hücrelerinin enfeksiyonundan bir gün önce, ortama 1000 x oranında insan embriyonik kök hücre klonlama ve geri kazanım takviyesi ekleyerek iki mikromolar nihai konsantrasyon sağlayın. Ertesi gün, insan embriyonik kök hücrelerini yüksek titreli bath 60 CGFP lentivirüsü ile enfekte edin. İlk olarak, bir kuyucuktaki hücrelere bir mililitre tripsin ekleyip plakayı beş dakika inkübe ederek hücreleri tek hücre süspansiyonuna ayırın. Ardından süspansiyonu toplayıp 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Hazırlanan ortamdan dokuz mililitre ekleyin ve bir mililitre mt. SIR, bir beklerken hücreleri 1.200 RPM'de beş dakika santrifüjleyerek çöktürün. Final konsantrasyonu mililitre başına altı mikrogram olacak şekilde poly brain ve iki mikromolar insan embriyonik kök hücre kurtarma takviyesi ekleyin.Ardından hücreleri bu çözeltide yeniden süspanse edin ve altı kuyucuklu, düşük tutunma özelliğine sahip bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Şimdi, 100 milyon enfeksiyon çokluğuyla konsantre edilmiş 60 C virüsünü ekleyin. Plakayı virüsle birlikte üç saat boyunca inkübe edin.Ardından hücreleri toplayın ve matrigel kaplı iki plaka kuyucuğuna paylaştırın. Her bir plakaya, biri iki mikromolar takviyeli olmak üzere iki mililitre mt, SIR ekleyin ve ardından hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, medyayı taze medya ile değiştirin.Enfeksiyonun başlangıcından 48 saat sonra hücreler kümelenmiş görünecektir. Enfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için floresan kontrolü yapın. Hücreler %80 Konfluens düzeyine ulaşana kadar günlük besiyeri değişimlerine devam edin, ardından hücreleri disosiye edin ve aynı protokolü kullanarak hücrelere myo D virüsünü ekleyin.Enfekte hücreleri, bu büyüme noktasına ulaştıkları günden bir önceki güne kadar günlük besiyeri değişimleri ile sürdürün. Enfekte hücreleri ME'S plakasına pasajlamak için MES'i matrigel kaplı plaklara santimetrekare başına 1000 hücre olacak şekilde ekin. Ertesi gün.Hücreleri ayırmak için trip ALI kullanın ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dokuz mililitre insan embriyonik kök hücre besiyeri ekleyin ve santrifüj ile çöktürün. Beş dakika boyunca 1.200 RPM hızda santrifüjleyin.Çöktürülmüş hücreleri 6 mL taze insan embriyonik kök hücre medyumunda resüspande edin. Şimdi iki adet MES plakasındaki medyumu uzaklaştırın ve enfekte hücreleri bu plakalara ekleyin. Hücreleri birkaç gün inkübe edin.%80 konfluens sağlandığında, tüm medyumu uzaklaştırın ve bir mililitre kollagenaz dört ekleyin. 37 °C'de beş dakika kollagenazla inkübasyonun ardından mililitre başına bir miligram ekleyin.Kollajenazı bir mililitre insan embriyonik kök hücre besiyeri ile değiştirin. Ardından bir diseksiyon mikroskobu altında, kolonileri 10 mililitrelik bir pipet ucu kullanarak kazıyın, kolonileri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve çökmelerini bekleyin. Üç dakika sonra süpernatanı uzaklaştırın ve hücreleri insan embriyonik kök hücre besiyeri içinde yeniden süspande edin.Ardından hücreleri meth plaklarına bir ila dört oranında ekin. Bu prosedür için enfekte hücrelerin sayısının yüksek olması ve kaliteli koloniler oluşturmuş olması gerekir. Her kuyucuktaki besiyerini uzaklaştırın ve bir mililitre collagenase.Four ekleyin.Daha önce olduğu gibi mililitre başına bir miligram konsantrasyon ekleyin ve beş dakika sonra kolajenaz reaksiyonu ortamını EB ortamı ile değiştirerek sonlandırın. Ardından, kolonileri kazımak için hızlıca bir mikroskop kullanın. 10 mililitrelik bir pipet ucu kullanarak hücreleri küçük hücre kümelerine ayırmak mümkündür.Bu agregatları 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve yaklaşık üç dakika boyunca çökmelerini bekledikten sonra süpernatantı uzaklaştırın, hücreleri üç mililitre EB medyumunda yeniden süspande edin ve her şeyi düşük yapışmalı altı kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Bu plakayı gece boyunca inkübe edin; ertesi gün büyük koloni parçaları oluşup oluşmadığını kontrol edin.Eğer herhangi biri bulunursa, bunları birkaç kez beş mililitrelik bir pipetle aktararak parçalayın. Çok sayıda yüzen tek hücre varsa, agregatları sedimentasyon yoluyla toplayın ve taze EB besiyeri ile değiştirin.Beş günlük kültürleme süresinin ardından besiyerini gün aşırı değiştirin. Hücre agregatlarını toplayın ve hücrelerin normal yerçekimi altında çökelmesini sağlayarak iki mililitre PBS ile bir kez yıkayın. Ardından PBS'yi üç mililitre DM besiyeri ile değiştirin ve hücreleri kültürün sonraki 15 günü boyunca aynı plaka kuyucuklarına geri yerleştirin.Besiyerini her üç günde bir değiştirin. Bu süre zarfında mezosferler oluşacaktır. İnsan embriyonik kök hücreleri, GFP floresansı taşıyan bath 60 C ile enfekte edildi.72 saat sonra, hücreler FACS ile ayrıştırıldı. BAF 60 C eksprese eden hücreler yaklaşık %75 konfluense ulaşana kadar büyütüldü ve ardından myo D lentivirusu ile enfekte edildi. Enfekte hücrelerde eksojen gen ekspresyonu, kantitatif gerçek zamanlı PCR ile tespit edildi.Protein düzeyindeki ekspresyon ve dağılım incelendi. GFP, baf 60 C ekspresyonuna karşılık gelmektedir ve myo D ekspresyonunu kontrol etmek için bir myo D antikoru kullanılmıştır. İnsan embriyonik kök hücreleri EB benzeri agregatlar oluşturmaya başladıktan 15 gün sonrası.Myos kürelerin bir kısmı OCT bileşiğine gömülmüş ve kesitler alınmıştır; alınan kesitler miyojenik ve miyozin ağır zincir belirteçleri için pozitif boyanmıştır. 10. günden itibaren myos kürelerde sporadik kasılmalar gözlemlemek mümkün olmuştur. Bazı myos küreler, muhtemelen myos küreler arası füzyona bağlı olarak farklı veya alışılmadık şekiller almıştır.Myosferlerin, farklı kas bozukluklarından etkilenen hastaların pluripotent kök hücrelerinden üretilebilmesi nedeniyle, bu teknik hastalık modelleme ve tedavi alanındaki araştırmaları ileriye taşıyacaktır. Bu nedenle myosferler, ilaç taraması ve hastalık patogenezi için uygun bir hastalık içi model sunmaktadır.

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Fare embriyonik fibroblastı, transkripsiyon faktörleri Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc'nin zorla ekspresyonu ile düşük verimlilikte indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanabilir. Yeniden programlama reaksiyonunun nadir ara ürünleri, hücre yüzeyi yapıcıları Thy-1.2, Ssea-1 ve Epcam'a karşı antikorlarla etiketleme yoluyla izole edilen FACS'dir.

Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Bu protokol, insan yetişkin periferik kan hücrelerinden entegrasyon gerektirmeyen iPSC'lerin verimli bir şekilde üretilmesi için ayrıntılı bir yöntemi açıklar. Yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için dört oriP/EBNA bazlı epizomal vektörün kullanılmasıyla, KLF4, MYC, BCL-XL veya OCT4 ve SOX2, 1 mL periferik kandan binlerce iPSC kolonisi elde edilebilir.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu protokol, insan dermal fibroblastlarında hemojenik bir programın hematopoetik kök ve döl hücreleri üretmek için gata2, GFI1B ve FOS transkripsiyon faktörlerinin zorunlu ekspresyonu ile indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Bu video fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyici hücreler insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir. Part 1 3.

MEFS I Matrigel: MEFS Durum Pasajlanması hESC

Öğrenin, insan embriyonik kök hücrelerinden epigenetik yeniden programlama ile kas progenitörleri ve myosphere oluşturmayı. Bu yöntem, kas biyolojisi ve rejeneratif tıp araştırmaları için yüksek verimli bir model sunar.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Daha fazla video keşfet