Çok ilaca dirençli Demonstrating Mycobacterium tuberculosis Amplifikasyon Microarray

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir amplifikasyon mikrodizisi kullanarak çoklu ilaca dirençli mikrobakteri tüberkülozunu genotiplemektir. Bu, tek bir mikroakışkan reaksiyon odası içinde bir mikrodizinin tepesi üzerinde çok katlı bir asimetrik PCR gerçekleştirilerek elde edilir. Orada numune aynı anda büyütülür, etiket boyutu seçilir, tek sarmallı hale getirilir ve mikrodiziye hibritlenir.

Daha sonra, mikrodizi yıkandıktan sonra, bir okuyucu mikrobakteri tüberkülozunun mevcut olup olmadığını ve rifampin iso, niazi etambutol veya streptomisine direnç kazandırdığı bilinen bir DNA mutasyonu içerip içermediğini gösterir. Bu yöntemin mevcut mikrodizi hat probu veya nükleik asit hibridizasyon yöntemlerine göre avantajı, bir amplifikasyon mikrodizisinin test ile kullanıcı etkileşimini önemli ölçüde basitleştirmesidir. Yine de, PCR'nin analitik hassasiyetini ve bir mikrodizinin çoğullama kapasitesini sağlarken Bu prosedür için, dekontamine solüsyonla silinmiş temiz bir çalışma alanına sahip olun ve multipleks PCR için yeterince saf nükleik asitlere sahip olun.

Tüm stok çözeltilerini çözdükten ve karıştırdıktan sonra, PCR ana karışımını birleştirin. Bu karışımı hazırlarken, burada gösterilen TB testi için en az bir ekstra hacim karışım yapın. Ayrıca, ana karışıma ekstra T polimeraz ekleyin.

Stok reaktifleri ile sağlanan yapışma miktarına ek olarak, bir mikrolitre numune DNA'sını 49 mikrolitre ana karışıma karıştırın. Her reaksiyon karışımından 48 mikrolitreyi uygun mikrodizinin merkezine dikkatlice ekleyin. Mikrodizinin kendisine dokunmayın.

Ardından mikrodiziyi dikkatlice örtün ve kapatın. Kapak kaymasının uygulanması, artefaktlara, buharlaşmaya, zayıf amplifikasyona veya düzgün olmayan hibridizasyona yol açabilecek kabarcıklara neden olabilir. Bu koşullardan herhangi biri hatalı bir sonuca yol açabilir.

Ardından, mikro hızı termal döngüleyiciye yükleyin. Alt tabakalar ısı bloğuna karşıyken, ısıtmalı kapak seçeneği kapalı olmalıdır. Evrensel PCR önlemlerini takip eden laboratuvarlar için, slayt başına birkaç amplifikasyon mikrodizisi eklemek ve aynı anda birden fazla testi işlemek daha verimlidir.

Şimdi uygun termal döngü programını çalıştırın. Bu program, yüksek görünebilecek ancak reaksiyon tarafından oluşturulan ağırlıklı olarak tek sarmallı amplikon popülasyonu nedeniyle gerekli olan 50 amplifikasyon döngüsüne sahiptir. Reaksiyon tamamlandığında, mikrodizileri çıkarın ve termal döngüleyiciyi kapatın.

Mikrodizi odasını düz ve forseps ile dikkatlice açın. Kaymayı çıkarın, kapağı ve contayı çıkarın. Mikrodizi bu adımdan zarar görebilir, bu nedenle yanlış dikkatli olun.

Conta tertibatının çıkarılması, mikrodizinin fiziksel olarak hasar görmesine neden olabilir. Kapak kızağını bükmemeye veya esnetmemeye dikkat edin ve mikrodizinin yüzeyini forseps ile çizmemek için büyük özen gösterin, Şimdi mikrodizi substratlarını bir histoloji slayt tutucusuna aktarın. Alt tabakaları yıkama tamponunda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın, yıkama solüsyonu banyosunu iki veya üç yıkama daha yapın, hepsi deiyonize suda.

Görüntülemeye devam etmeden önce mikrodizileri kurutun. Bu gösterimde bu amaç için yumuşak bir basınçlı hava akışı kullanılabilir, parametreler MDR TB testine ve bir Econ DX 2100 saha taşınabilir görüntüleyicisine özgüdür. Görüntüleyici üzerindeki mavi ışık, hazır olduğunu gösterir.

Bilgisayarı aç. Bir conni tarafından sağlanan sistem yazılımını açın ve yazılımın kamera ile bir bağlantı kurduğunu duyurmasını bekleyin. Ardından, kurutulmuş mikrodiziyi görüntüleyiciye yerleştirin.

Mikrodizi lense doğru ve kullanıcıdan uzakta olacak şekilde. Yazılım şimdi açılır menüden bir önizleme görüntüsü sağlayacaktır. MDR TB analiz komut dosyasını seçin.

100 ile 500 milisaniye arasında bir pozlama süresi girin. Aşırı pozlanmış pikseller okunacaktır. Bunları en aza indirmek için pozlamayı ayarlayın.

Doygunluk, aşırı pozlamayı en aza indirecek şekilde ayarlandığında, analizi başlatın. Yazılım, görüntü puanlarına, örneklere ve arka plan yoğunluklarına bir MDRT TB ızgarası yerleştirir ve ardından ilaç direnci ve genotipleme sonuçlarını raporlar. Analiz tamamlandıktan ve kaydedildikten sonra, çipi görüntüleyiciden çıkarın ve bir sonraki diziyi analiz etmek için yeni bir analiz oturumu başlatın.

İşlenen mikrodizilerin her biri için analize devam edin. Her seferinde verileri kaydetme. Nitel görüntü analizi, otomatik görüntü analizi yazılımı tarafından oluşturulan veri tablolarında tanımlanması zor olan deneysel gürültü veya değişkenlik kaynakları hakkında bilgi sağlayabilir.

Burada eserlerden yoksun yüksek kaliteli bir dizi görülüyor. Birkaç artefakt, haleler oluşturan baloncukların ortaya çıkmasına neden olabilir. Dizi artefaktlarına rağmen, yazılım taranan değerleri almaya devam edecektir.

Tanılama raporlama algoritması, değerleri almasına rağmen bu diziyi geçersiz olarak tanır. Yabani tip H 37 RA genomik DNA'nın bir seyreltme serisi, 1.250 hücreye eşdeğer olan 6.25 pikogramda bir mikrodizi PCR şablonu üzerinde kullanıldı. Tüm problar tespit edildi.

Üçün üzerinde bir SNR değeri pozitif bir sonuçtur ve kaydedilen değerler çok daha yüksektir. Daha sonra, Dünya Sağlık Örgütü referans izolatları genotiplendirildi. Dizide bulunan tek nükleotid polimorfizmleri, MDR TB genomunda karşılık gelen mutasyon olarak tespit edildi.

Yakın komşu mutasyonları tespit etmenin birkaç örneği de belirgindi. Metin protokolünde bir tartışma sağlanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, DNA konsantrasyonuna, spesifik tahliye, termal döngüleyicinin verimliliğine ve tekdüzeliğine ve istenen analitik veya klinik duyarlılık ve özgüllüğe bağlı olarak yaklaşık üç buçuk ila altı buçuk saat içinde yapılabilir.

Ayrıca, amplifikasyon döngülerinin sayısı ve amplifikasyon sonrası hibridizasyon süreleri, istenen performans özelliklerini elde etmek için kolayca kısaltılabilir veya uzatılabilir.