Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, dendritik dikenleri süper çözünürlükte görüntülemektir. Bu, ilk olarak bir sıçan birincil hipokampal hazırlanarak gerçekleştirilir, ikinci adım, dendritik dikenleri GFP transfeksiyonu ve boyama yoluyla görselleştirmektir. Daha sonra, GFP etiketli dendritik dikenlerin elde edilmesi, bir SIM mikroskobu kullanılarak süper çözünürlükte gerçekleştirilir.

Son adım, ham görüntü verilerini sonraki görüntü analizi için hazır hale getirmek için 3D olarak yeniden oluşturmaktır. Sonuç olarak, süper çözünürlükte görüntülenen birincil hipokampal nöronları eksprese eden GFP, dendritik omurga morfolojisindeki ince değişiklikleri göstermek için kullanılır. Bu tekniğin konvansiyonel konfokal mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, dendritik omurga morfolojisini daha ayrıntılı olarak incelemenize izin vermesidir.

Bu yöntem, dendritik dikenlerin şeklindeki moleküler ve farmakolojik bağımlı değişiklikler gibi sinirbilimde devam eden önemli soruların incelenmesine yardımcı olabilir. Yapılandırılmış eliminasyon mikroskobu, çizgi desenlerinin numune üzerine yansıtılmasına dayanır ve bu, bir bilgisayar programı tarafından çıkarılabilen ve ekstra keskin görüntüler veren ve MI mitokondri ve hücredeki diğer küçük yapılara bakmanıza olanak tanıyan ekstra bilgiler verir. Bu yöntemin görsel bir gösterimi, bir SIM görüntüsünün geçerli bir şekilde yeniden yapılandırılmasını sağlamak için önemlidir, size ham verilerin kalitesini veren adımlardan geçmek çok önemlidir.

Önemli bir hazırlık adımı, steril bir laminer başlıkta çalışarak kapak kızaklarının kaplanmasını içerir. Tek tek kapak kızaklarını 12 oyuklu bir plakanın tek oyuğuna yerleştirmek için küçük steril forseps kullanın. Ardından, kapak fişlerini batırmak için her bir oyuğa 500 mikrolitre polilisin çözeltisi ekleyin.

Kuyucukları yıkadıktan sonra, bir mililitre kaplama ortamı ekleyin ve hücreleri kaplamadan önce kapak fişlerini doku kültürü inkübatöründe 24 saate kadar bırakın. Prosedür, grubumuzda doktora öğrencisi olan HU is SH tarafından gösterilecektir. Bir sıçan embriyosunu izole ettikten sonra, beyinciği beyincikten çıkarmak ve atmak için ince forseps kullanın.

Diseksiyon mikroskobu altında orta hat boyunca sagital bir kesim yaparak iki yarım küreyi ayırın, orta beyni nazikçe tutmak ve orta beyni çıkarmak için bir çift küçük forseps kullanın. Başka bir forseps çifti ile, korteks ve hipokampusu içeren yarım kürenin geri kalanını sağlam bırakın. Daha sonra, meninksleri dikkatlice çıkarın, dokuyu hipokampus yukarı bakacak şekilde yeniden yönlendirin.

Hipokampus, karakteristik CS şekilli yapısı ile tanımlanabilir. İnce forseps kullanarak, hipokampusu inceleyin ve taze soğuk bir X-H-B-S-S içeren 30 milimetrelik yeni bir tabağa yerleştirin. Su aygırı campi'yi tüm embriyolardan çıkardıktan sonra, toplam su aygırı kampi sayısını sayın ve ardından küçük parçalara ayırın.

Parçaları, üç mililitre bir X-H-B-S-S içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Süpernatanı santrifüjledikten ve çıkardıktan sonra, hipokampus başına altı mikrolitre tripsin ekleyin. Hipokampal parçaları metin protokolünde anlatıldığı gibi inkübe ettikten ve yıkadıktan sonra, tüm doku parçaları homojen bir şekilde tek hücrelere dağılana kadar parçaları ateşle parlatılmış bir papaz pipeti ile 30 kez yavaşça tavurun.

Herhangi bir köpürmeyi önlemeye dikkat edin. Daha sonra, 37 santigrat dereceye kadar önceden uyarılmış beş mililitre kaplama ortamı ekleyin. Hücreleri bir trian mavisi hayati boyama tohumu kullanarak saydıktan sonra, toplam hacmi iki mililitre olan bir mililitre kaplama ortamında 12, kuyucuklu bir plakanın her başına 50.000 hücre.

Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı salladıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte inkübe edin. İki ila üç gün sonra, 0.5 mililitre kaplama ortamını 10 mikromolar FUDR içeren kültür ortamı ile değiştirin. Transfekte etmek için, nöronlar bir lipektomi ekler.

Damla damla A DNA karışımına karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Laminer akış başlığında, 30 dakikalık DNA lipektomi karışımının bitiminden 10 dakika önce, inkübasyon, şartlandırılmış ortamı orijinal veya birinci kültür plakasından ikinci bir 12'ye pipetleyin. Plakayı iyice kaplayın ve bu plakayı 37 santigrat derecede, ilk kültür plakasında% 5 karbondioksitte saklayın.

Hücrelerin kurumasını önlemek için şartlandırılmış ortamı hızlı bir şekilde bir mililitre ön ısıtma inkübasyon ortamı ile değiştirin. Her iki plakayı da 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit ile inkübatöre geri yerleştirin. 30 dakikalık DNA lipektomi inkübasyonunun sonunda DNA lipektomi karışımı hücrelere eklenmeye hazır hale gelir.

Her bir oyuğa yavaşça 200 mikrolitre DNA lipektomi karışımı ekleyin ve 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte 45 dakika inkübe edin. 45 dakikalık inkübasyondan sonra, nöronları tutan kapak fişlerini kaldırmak için küçük forseps kullanın. Taze, ılık nöro bazal ortam içeren üç santimetrelik bir tabağa batırarak durulayın ve bir kuyuya koyun.

İkinci 12'de, şartlandırılmış ortamı içeren kuyu plakası. Daha sonra transfekte edilen nöronları 48 saat boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte inkübe edin. İmmüno boyamaya hazırlanmak için, ortamı kapak kızaklarını içeren oyuklardan nazikçe aspire edin.

Ardından, dendritlere zarar vermemek için dikkatlice 500 mikrolitre ılık %4 PFA ekleyin. Hücre bloğunu oda sıcaklığında% 1 T-B-S-B-S-A çözeltisi ile 30 dakika inkübe ettikten ve yıkadıktan sonra, inkübasyonda seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra hafifçe çalkalayarak gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi sabah, birincil antikoru çıkarın ve buradan sonra tekrar yıkayın, kapak fişlerini ışıktan koruyun. Daha sonra, inkübasyonda seyreltilmiş ikincil floresan konjuge antikoru ekleyin. Karıştırın ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Daha sonra ikincil antikoru çıkarın ve hücreleri ince cımbız kullanarak yıkayın. Kapak fişlerini kuyucuklardan çıkarın ve fazla TBS'yi bir mendille kurulayın. Son olarak, montaj ortamını kullanarak kapak fişlerini monte edin ve oje ile kapatın.

SIM görüntülemeye başlamak için 488 nanometre lazeri, cıva lambasını, sahne denetleyicisini ve iletilen ışık için halojen lambayı açın. SIM yazılımını ve veya nsim modunda başlatın. Objektife bir damla daldırma yağı koyduktan sonra, yağ damlasında hava kabarcığı olmadığını kontrol edin.

Kapak fişini hipokampal nöronlarla birlikte mikroskop sahnesine yerleştirin. Yağ numuneye temas edene kadar objektifi yukarı doğru hareket ettirin. Numuneyi ortam ışığından korumak ve odadaki ışığı mümkün olduğunca kısmak için alım prosedürü sırasında sahnenin üzerine bir kapak yerleştirmeyi unutmayın.

SIM yazılımında, optik konfigürasyon IFI'yi seçin ve beyaz ışık ayarıyla örnek odağı ile görsel inceleme için boş bir filtre bloğu seçin. Ardından beyaz ışığı kapatın ve cıva lambasını açın. Deklanşörü açın ve yeterince parlak bir dendrit aramak için yeşil filtreyi seçin.

Yeterince parlak bir ilgi dendritiyle karşılaştığınızda ve görüş alanında bir ilgi segmentini ortaladığınızda, deklanşörü kapatın. Yazılımı optik yapılandırmaya, 3D SIM 4 88'e ve kamera ayarlarını aşağıdaki gibi ayarlayın. Okuma modunu em olarak ayarlayın.

Bir megahertz 16 bit kazanın. Pozlama süresini 100 milisaniye olarak ayarlayın. Lazer gücünü %5'e ayarlayınEM kazancını 200'e ayarlayın.

Odaklama hızı ekstra hassas olarak ayarlandığında, ilgilenilen nesneye odaklanın. Kamera ayarlarını aşağıdaki gibi hızlı bir şekilde ayarlayın. 30, 040 5, 000 arasında bir yoğunluk değeri elde etmek için lazer gücünü %0 ila %20 olarak ayarlayın Pozlama süresini 50 milisaniye ila iki saniye arasında ayarlayın.

Okuma modunu em olarak ayarlayın. Bir megahertz 16 bit kazanın. EM kazancını sıfıra 300'e ayarlayın.

Dönüşüm kazancını bir x ila 5.1 x olarak ayarlayın. Canlı formatını Benning yok olarak ayarlayın. Yakalama biçimini Benning yok olarak ayarlayın.

Ardından, ND dizisi panelindeki üç DZ yığınının ayarlarını aşağıdaki gibi yapılandırın, aralığı iki mikron olarak ayarlayın. Adım boyutunu 120 nanometre olarak ayarlayın ve başlangıç konumuna tıklayın. Ardından lambda bölümünde optik yapılandırmayı, 3D SIM 4 88'i seçin.

Çekim modu olarak 3D SIM'i seçtikten sonra, ND dizisi alımını çalıştırın ve konfokal ve sim mikroskobu ile görüntülenen ham verileri dendritler ve dendritik dikenler burada gösterilmektedir. Satın almalar, konfokal ve SIM görüntülerden yeniden yapılandırıldı. Boyun uzunluğu, boyun çapı ve kafa çapı gibi ana parametreler ayarlandıktan sonra dendritler izlendi ve omurgalar yazılım ile otomatik olarak sınıflandırıldı.

Kutulu alanlar, konfokal ve sim mikroskobu ile görüntülenen ve karşılık gelen Z yığınlarından yeniden yapılandırılan tek bir dendritik omurgayı gösterir ve sonuçta ortaya çıkan 3D rekonstrüksiyonların çözünürlük ve doğruluğundaki farklılıkları gösterir. SIM'lere göre, hem baş hem de boyun çapının daha yüksek çözünürlüklü, kantitatif analizi, sim mikroskobunun aynı dendritik omurgalar için konfokal mikroskopiden önemli ölçüde daha küçük boyutları ölçtüğünü ve SIM'in dendritik omurga morfolojisindeki daha küçük değişiklikleri tespit edebildiğini ortaya koydu. Bu prosedüre katılırken, aynı görüntünün daha geçerli bir şekilde yeniden yapılandırılması için yüksek kalitede ham görüntüler elde etmeyi unutmamak önemlidir.

Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu, canlı hücre görüntüleme için de etkili olabilir ve hela hücreleri, nöronlar veya e coli bakterileri gibi hücrelerin dinamiklerinin araştırılmasına olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, birincil hipokampal nöronlardan süper çözünürlükte standart açıklamaların nasıl hazırlanacağı, görselleştirileceği ve görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır.