Ardışık In vivo Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, kemik kırığı onarımında endojen osteojenik kök ve progenitör hücrelerin migrasyonunu, proliferasyonunu ve farklılaşmasını sıralı olarak izlemek ve ölçmektir. Bu, önce mixo virüsü, influenza virüsü direnci, bir veya MX bir pozitif hücrenin in vivo poli sinik poli sito ililik asit enjeksiyonu ile etiketlenmesi ve ardından yerleşik MX bir pozitif hematopoietik hücrelerin ışınlama ile ortadan kaldırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, vahşi tip kemik iliği hücreleri ışınlanmış farelere sistematik olarak uygulanır.

Daha sonra iğne delme ile fare Cal bölgesinde mikro kırıklar oluşturulur. Son olarak, mikro kırık onarımının ardışık intraflakon görüntülemesi yapılır. Sonuç olarak, bu intravital görüntüler, osteojenik kök ve progenitör hücre akışının dinamiklerini ve kırık bölgelerine genişlemeyi değerlendirmek için kullanılabilir.

Bu nedenle, bu tekniğin ana avantajı, kırık iyileşmesi sırasında osteojenik kök ve progenitör hücrelerin in vivo tekrarlayan görüntülenmesine izin vermesidir. Bu tekniğin anlamı, kırık iyileşmesi ve osteoporoz tedavisine kadar uzandı. Bu yöntem, kemik rejenerasyonu ve onarımında endojen osteojenik kök progenitör hücrelerin izlenmesi için yeni bir araç sunmaktadır.

Bu yöntemin görsel gösterimi, minimal doku hasarı ile mikro kırığın bir nesli olarak kritik öneme sahiptir ve ciddi yara izi oluşumuna neden olmadan kırık yaralanmasının tekrarlanan in vivo görüntülenmesi yöntem için önemlidir ve teknik olarak zordur: MX one positive hücreleri in vivo olarak etiketlemek için, günde bir kez intraperitoneal olan 20 gram MX bir Cree muhabiri fare ağırlığı başına 200 mikrolitre poliasidik poli sito ilik asit enjekte ederek başlayın 10 gün boyunca. Daha sonra, yerleşik MX'i ortadan kaldırmak için, bir pozitif hematopoietik hücre, enjekte edilen fareleri tek bir doz 9.5 gras ile ışınlar. 24 saat sonra, fare başına intravenöz olarak altıncı vahşi tip kemik iliği hücrelerine 10 kez nakledin.

Dört ila altı hafta sonra, fareyi 50 mikrolitre ketamin ksilazin ile intraperitoneal enjeksiyonla uyuşturun Ayak parmağı çimdikleme ile sedasyonu onayladıktan sonra, kemik iliği hücresi nakledilen farenin kafa derisi çiftini klipsleyin ve ardından maruz kalan cildi% 70 alkollü bir çubukla sterilize edin. Kornea dehidrasyonunu önlemek için gözyaşı jeli uygulayın ve ardından kafa derisi boyunca bir kulaktan başlayıp diğerinde biten bir santimetreden daha kısa enine bir kesi yapın. Daha sonra, hayvanı yaklaşık 60 derece çevirin ve forseps kullanarak burundan yaklaşık iki ila üç milimetreye ulaşana kadar insizyona devam edin.

Cildi ayırmak için doku flebini hayvan taraflarına doğru çekin, hem frontal kemikler hem de sagital ve koronal sütürlerin kesişimi artık net bir şekilde ortaya çıkarılmalıdır. Açık yüzeyi steril PBS ile yıkayın ve ardından kalan tüyleri pamuklu çubuklarla nazikçe silin. Daha sonra buzağı üzerinde mikro kırıklar oluşturmak için bir elinizle fare kafasını ve diğer elinizle 30 gauge iğneyi tutun.

Sagital ve koronal sütürlerin kesişme noktasına yakın frontal kemiklerin bir tarafında nazikçe bir mikro delik açmak için 30 gauge iğne ucunu kullanın. Beyne nüfuz etmesini önlemek için, daha büyük bir ölçüye geçin ve delme deliğini yaklaşık 0,5 milimetre çapa genişletmek için yeni iğneyi çevirin. Kontralateral frontal kemikte ikinci bir delinme oluşturduktan sonra, kanama durana kadar her noktaya sürekli olarak PBS'yi silin

Daha sonra kurumayı önlemek için, Vidal görüntülerini elde etmek için alanı tamamen kaplayacak şekilde kafatasına yeterince steril fizyolojik tuzlu su çözeltisi damlatın. Önce saniyede 30 kare video hızında eş zamanlı çok kanallı görüntü alımına izin vermek için poligon tabanlı lazer tarayıcıyı açın. Daha sonra, çoklu foton görüntüleme için femtosaniye titanyum safir lazeri açın.

GFP ve TD domates uyarımı için 440 nanometrede kalvarial kemiğin ikinci harmonik nesil görüntülemesi için gücü ve dalga boyunu 880 nanometreye ayarlayın, 491 nanometre ve 561 nanometre katı hal lazerlerini açın. Ve sonra her sinyal için foto çarpan tüp dedektörlerini açın: ikinci harmonik üretim için 435 artı veya eksi 20 nanometre bant geçiren filtre, GFP için 528 artı veya eksi 19 nanometre bant geçiren filtre ve TD domates için 590 artı veya eksi 20 nanometre bant geçişi. Şimdi, hayvanı 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir elektrikli ısıtma yastığının üzerine XYZ eksenli motorlu bir mikroskop tablasına yerleştirin.

Fareyi yerinde tutmak için bant kullanın ve ardından kafatasına bir damla ılık% 2 Metilselüloz bazlı jel uygulayın. Kurumasını önlemek için, görüntüleme alanına bir kapak camı koyun. Ardından, kemiklerden gelen SHG sinyalini algılamak için 0,9 sayısal açıklığa ve XY, Z ekseni denetleyicisine sahip 30 x suya daldırma hedefi kullanın.

Baldırın yüzeyini bulmak için, sagital sütürler ve koronal sütürler arasındaki kesişme noktası gibi önemli bir dönüm noktası konumunu belirleyin ve bir görüntü elde edin. Yer işaretinin XY, Z koordinatlarını işaretleyin ve ardından SHG ve flüoresan sinyallerini kılavuz olarak kullanarak yaralanma yerini aramaya devam edin. İlgilenilen her bölge bulunduğunda, ilgilenilen hücrelerden SHG ve floresan sinyallerini içeren en iyi odak düzleminin bir görüntüsünü elde edin.

Bir sonraki görüntüleme turu için kesin konumlarını tanımlamak için XY, Z koordinatlarını ve sagital ve koronal sütürlerin kesişme noktasına olan mesafeyi kaydedin. Daha sonra kırık yaralanmasının 3D hücresel ve kemik yapılarını toplamak. Görüntüleri, endo kemik yüzeyinden yaklaşık 100 mikron derinlikte yaklaşık iki ila beş mikron Z yığın aralıklarında kaydedin.

Son olarak, her iki yaralanma bölgesini de görüntüledikten sonra, %2 Metilselüloz jeli kafatasından çıkarmak için çok sayıda steril salin damlası kullanın. Şimdi yüzeyi antibiyotiklerle kaplayın ve kafatasını deri kanatlarıyla örtün, kafa derisini hipoalerjenik dikiş ipliği ile tekrar kapatın ve hayvanı yeterli bilinci geri kazanana kadar ılık bir iyileşme odasında tutun. Üç ila beş gün sonra, kırığın iyileşmesi sırasında hücresel değişikliği izlemek için İntravital görüntüleme adımlarını tekrarlayın.

Bu temsili deneyde, ışınlama ve kemik iliği replasmanından sonra genetik MX bir domates osteokalsin, GFP farelerinin ön kemiklerinde iki mikro kırık oluşturuldu, mikro kırıkların sıralı 3D intra vital görüntülemesi, domates pozitif osteojenik kök ve progenitör hücrelerin ikinci günde kırık bölgesi içinde yer değiştirdiğini gösterdi, beşinci gündeki genişlemelerinin yanı sıra. Şu anda herhangi bir GFP pozitif osteoblast tespit edilmemesine rağmen, 12. günde, kırık yüzeyine yakın bir osteo progenitör alt kümesi, okla gösterildiği gibi domates pozitif GFP pozitif osteoblastların farklılaşmasını başlattı, yeni osteoblastların birikmesi ve 21. günde yeni kemik oluşumu, osteojenik progenitör hücrelerin göçünün ve çoğalmasının, kırığı iyileştirmek için yeni osteoblastlar sağlamak için önemli bir mekanizma olduğunu gösterir. Bu yöntemin kırık iyileşmesi sırasında osteo progenitör sayılarının tutarlı ve kantitatif bir çıktısını sağlayıp sağlamadığını test etmek için, MX bir YFP pozitif osteojenik kök ve progenitör hücreler yaralanmadan sonra 14 gün boyunca izlendi.

Az sayıda progenitör, yaralanma bölgesinde üç gün boyunca tutarlı bir şekilde tespit edildi. Hücre sayıları yedinci günde sürekli olarak arttı ve 10. günde 14 günde sürdürülen en yüksek nüfusa ulaştı. Osteo progenitörlerin oluşumunun kinetiği, zaman içinde YFP sinyal yoğunluğunun ölçülmesiyle ölçüldü ve intra vital mikroskopi ile gözlemlenenle ilişkilendirildi.

Atalar ilk olarak üçüncü günde gözlemlendi, 10. günde zirveye ulaştı ve 14. güne kadar benzer şekilde yüksek bir yoğunlukta kaldı. Bu prosedürü denerken, yetenekli dikiş tekniklerinin ve minimal kanamanın yara oluşumunu azaltabileceğini ve arka plan otofloresansını azaltabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kırık onarımı sürecinde endojen osteojenik kök progenitör hücrelerin migrasyonunu, proliferasyonunu ve farklılaşmasını nasıl görüntüleyeceğinizi ve izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.