Ardışık

Bu prosedürün genel amacı, kemik kırığı onarımında endojen osteojenik kök ve progenitör hücrelerin migrasyonunu, proliferasyonunu ve diferansiyasyonunu ardışık olarak izlemek ve nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle polisinosik polisitilik asit enjeksiyonu ile in vivo olarak miksovirüs, influenza virüs direnci veya MX1 pozitif hücrelerin işaretlenmesi ve ardından yerleşik MX1 pozitif hematopoetik hücrelerin radyasyonla ortadan kaldırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, yaban tipi kemik iliği hücreleri ışınlanmış farelere sistematik olarak uygulanır.

Ardından, iğne ile delme işlemi uygulanarak farenin Cal bölgesinde mikro kırıklar oluşturulur. Son olarak, mikro kırık onarımının ardışık intravital görüntülemesi gerçekleştirilir. Nihayetinde, bu intravital görüntüler, osteojenik kök ve progenitör hücrelerin kırık bölgelerine akış ve genişleme dinamiklerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, kırık iyileşmesi sürecinde osteojenik kök ve progenitör hücrelerin in vivo tekrarlayan görüntülemesine olanak tanımasıdır. Bu tekniğin uygulama alanı, kırık iyileştirme ve osteoporoz tedavilerine kadar uzanmaktadır. Çünkü bu yöntem, kemik rejenerasyonu ve onarımında endojen osteojenik kök progenitör hücrelerin izlenmesi için yeni bir araç sunmaktadır.

Minimal doku hasarıyla mikrofraktür oluşturulması ve şiddetli skar oluşumuna yol açmadan fraktür yaralanmasının tekrarlayan in vivo görüntülemesi yöntemin başarısı için kritik olduğundan ve teknik olarak zorlayıcı olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi büyük önem taşımaktadır. MX1 pozitif hücreleri in vivo olarak işaretlemek için, her 20 gram MX1 Cre reporter fare ağırlığı başına 200 µL poliasidik polisitilik asit'i 10 gün boyunca gün aşırı bir kez intraperitonal olarak enjekte ederek başlayın. Ardından, yerleşik MX1 pozitif hematopoetik hücreleri yok etmek için enjekte edilen farelere tek doz 9.5 Gy ışınlama uygulayın. 24 saat sonra, fare başına 1 × 10⁶ wild type kemik iliği hücresini intravenöz olarak nakledin.

Dört ila altı hafta sonra, fareyi 50 µL ketamin ksilazin intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi edin. Ayak parmağı sıkıştırma testiyle sedasyonun gerçekleştiğini doğruladıktan sonra, kemik iliği hücresi nakledilmiş farenin kafa derisini tıraş edin ve ardından açığa çıkan cildi %70'lik alkollü pamukla sterilize edin. Korneadehidrasyonunu önlemek için gözyaşı jeli uygulayın ve ardından bir kulaktan başlayıp diğerinde sona erecek şekilde, kafa derisi boyunca bir santimetreden daha kısa bir transvers insizyon yapın. Ardından, hayvanı yaklaşık 60 derece döndürün ve pens kullanarak insizyonu burundan yaklaşık iki ila üç milimetre uzaklığa kadar sürdürün.

Deriyle birlikte her iki frontal kemiği ve sagital ile koronal sütürlerin kesişim noktasını açıkça ortaya çıkarmak için doku flebini hayvanın yanlarına doğru çekin. Açık yüzeyi steril PBS ile yıkayın ve ardından kalan tüyleri pamuklu çubuklarla nazikçe temizleyin. Daha sonra kalvaryum üzerinde mikro kırıklar oluşturmak için, farenin başını bir elinizle, 30 gauge bir iğneyi ise diğer elinizle tutun.

Sagital ve koronal sütürlerin kesişim noktasına yakın, frontal kemiklerin bir tarafına 30 gauge iğne ucuyla nazikçe mikro bir delik açın. Beyni delmekten kaçınmak için daha geniş gauge bir iğneye geçin ve yeni iğneyi çevirerek delik çapını yaklaşık 0,5 milimetreye kadar genişletin. Kontralateral frontal kemikte ikinci bir delik oluşturduktan sonra, kanama durana kadar her bir noktaya sürekli olarak PBS damlatın ve silin.

Ardından, kurumasını önlemek için Vidal görüntüleri elde edilecek alanı tamamen kaplayacak şekilde kafatası üzerine yeterli miktarda steril fizyolojik tuzlu su solüsyonu damlatın. İlk olarak, saniyede 30 karelik bir video hızında eş zamanlı çok kanallı görüntüleme yapılmasına olanak sağlamak için poligon tabanlı lazer tarayıcıyı açın. Sonra, çok fotonlu görüntüleme için femtosaniye titanyum safir lazeri açın.

Kafa kemiğinin (calvaria) 440 nanometrede ikinci harmonik üretimi görüntülemesi ile GFP ve TD tomato eksitasyonu için gücü ve dalga boyunu 880 nanometreye ayarlayın, 491 nanometre ve 561 nanometre katı hal lazerlerini açın. Ardından, her sinyal için fotomultipliyer tüp dedektörleri açın: ikinci harmonik üretimi için 435 ± 20 nanometre band geçiren filtre, GFP için 528 ± 19 nanometre band geçiren filtre ve TD tomato için 590 ± 20 nanometre band geçiren filtre. Şimdi, hayvanı 37 °C'ye ayarlanmış bir elektrikli ısıtma pedinin üzerindeki XYZ eksenli motorlu mikroskop tablasına yerleştirin.

Fareyi konumunda tutmak için bant kullanın ve ardından kafatasına bir damla ılık %2'lik Metilselüloz bazlı jel uygulayın. Kurumayı önlemek için görüntüleme alanına bir üzer örtü camı yerleştirin. Daha sonra, kemiklerden gelen SHG sinyalini tespit etmek için 0,9 sayısal açıklığa sahip 30x su daldırma objektifi ile XY ve Z ekseni kontrol cihazını kullanın.

Kafatasının yüzeyini bulmak için, sagital sutürler ile koronal sutürlerin kesişim noktası gibi kritik bir referans noktası belirleyin ve görüntü alın. Referans noktasının XY, Z koordinatlarını işaretleyin ve ardından SHG ile floresan sinyallerini rehber olarak kullanarak yaralanma konumunu aramaya devam edin. Her bir ilgi alanı bulunduğunda, ilgili hücrelerden gelen SHG ve floresan sinyallerini içeren en iyi odak düzleminin görüntüsünü alın.

Bir sonraki görüntüleme aşamasında kesin konumlarını belirleyebilmek için XY, Z koordinatlarını ve sagital ile koronal sütürlerin kesişim noktasına olan mesafeyi kaydedin. Ardından, kırık yaralanmasına ait 3D hücresel ve kemik yapılarını toplayın. Görüntüleri, endo kemik yüzeyinden yaklaşık 100 micron derinlikte ve yaklaşık iki ila beş micron Z stack aralıklarla kaydedin.

Son olarak, her iki yaralanma bölgesinin görüntülemesi yapıldıktan sonra, %2 Methylcellulose jeli kafatası üzerinden temizlemek için çok sayıda steril salin damlası kullanın. Ardından yüzeyi antibiyotiklerle kaplayın ve kafatasını deri flepleriyle örtün, kafa derisini hipoalerjenik sütür ipiyle yeniden kapatın ve hayvan yeterli bilinci geri kazanana kadar sıcak bir iyileşme odasında tutun. Üç ila beş gün sonra, kırığın iyileşmesi sırasındaki hücresel değişimi takip etmek için intravital görüntüleme adımlarını tekrarlayın.

Bu temsilci deneyde, radyasyon ve kemik iliği değişimi sonrası genik MX1 tomato osteokalsin, GFP farelerin frontal kemiklerinde iki mikro kırık oluşturulmuştur. Mikro kırıkların ardışık 3D intravital görüntülemesi, ikinci günde kırık bölgesinde tomato pozitif osteojenik kök ve progenitör hücrelerin yer değiştirdiğini ve beşinci günde genişlediklerini göstermiştir. Bu süre zarfında hiçbir GFP pozitif osteoblast saptanmasa da, 12. günde, okla belirtildiği üzere, kırık yüzeyi yakınındaki bir grup osteoprogenitör hücre, tomato pozitif GFP pozitif osteoblastların farklılaşmasını başlatmıştır. 21. günde yeni osteoblastların birikimi ve yeni kemik oluşumu, osteojenik progenitör hücrelerin göç ve proliferasyonunun, kırığın iyileştirilmesi için yeni osteoblastlar sağlamada temel bir mekanizma olduğunu göstermektedir. Bu yöntemin, kırık iyileşmesi sırasında osteoprogenitör sayılarına ilişkin tutarlı ve kantitatif bir çıktı sağlayıp sağlamadığını test etmek için, yaralanmadan sonra MX1 YFP pozitif osteojenik kök ve progenitör hücreler 14 gün boyunca takip edilmiştir.

Projenitörlerin küçük sayıları, üçüncü güne kadar hasar bölgesinde tutarlı bir şekilde tespit edildi. Hücre sayıları yedinci günde sürekli olarak arttı ve 14. güne kadar sürdürülen en yüksek popülasyona 10. günde ulaştı. Osteo projenitörlerin oluşum kinetiği, YFP sinyal yoğunluğunun zaman içindeki ölçümleriyle nicelendirildi ve intravital mikroskopi ile gözlemlenenlerle ilişkilendirildi.

Projenitörler ilk olarak üçüncü günde gözlemlendi, 10. günde zirveye ulaştı ve 14. güne kadar benzer şekilde yüksek bir yoğunlukta kaldı. Bu prosedürü uygularken, yetkin sütür tekniklerinin ve minimum kanamanın skar oluşumunu azaltabileceğini ve arka plan otofloresansını düşürebileceğini unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kırık iyileşmesi sürecinde endojen osteojenik kök progenitör hücrelerin migrasyonunun, proliferasyonunun ve farklılaşmasının nasıl görüntüleneceği ve takip edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.