Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması In vitro İnme Model

Bu prosedürün genel amacı, bir in vitro inme modeli oluşturmak için beyin mikro dilimlerine sitotoksik stimülasyon uygulamaktır. Bu, önce yeni izole edilmiş bir beyinden mikro dilimler hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, mikro dilimleri hafif çalkalama ile dengelemektir.

Dengelendikten sonra, mikro dilimler çeşitli deneysel manipülasyonlar almaya hazırdır. Sonuç olarak, sonuçlar mikro dilimlerin üretimden sonra en az iki saat boyunca uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Tekniğimizin birincil embriyonik, nöronal kültürler gibi diğer mevcut tekniklere göre ana avantajı, tekniğimizin birden fazla hücre tipi içeren olgun beyin dokusu dilimlerini kullanması ve bu nedenle sağlam beyin dokusunu daha iyi temsil etmesidir.

İlk adım taze beyin dokusu elde etmektir. Beyni az miktarda ılık Krebs tamponuna batırın. Kalan deriyi, kürkü veya kanı çıkarmak için, ılık Krebs tamponu ile nemlendirilmiş iki yaprak filtre kağıdı ile macle wain doğrayıcı hazırlayın.

Hazır olduğunda, beyni doğrayıcının sahnesine yerleştirin. Beynin kaymasını önlemek için çalışırken beyni ve filtre kağıdını ılık creb tamponu ile nemli tutun. Yüzeyde çok fazla sıvı birikmesine izin vermekten kaçının.

Beyni 250 mikrometre koronal bölümlere ayırın. Ardından, sahneyi 90 derece çevirin ve 250 mikrometre sagital dilimler oluşturun. Bu adımdan sonra beyin bölümleri mikro dilimler olarak adlandırılır.

Mikro dilimleri 10 ila 15 mililitre ılık krep tamponu ile yuvarlak bir alt ikiye yerleştirin. Tek tek mikro dilimler askıya alınana kadar tüpü hafifçe çalkalayın ve ardından yerçekimi altında yerleşmelerine izin verin. Asılı hücre kalıntıları nedeniyle bulanık olacak olan süpernatanı dikkatlice çıkarın ve tüpe 10 mililitre taze ılık sürünmüş tampon ekleyin.

İyice yıkandıktan sonra kalıntıların çoğunu çıkarmak için yıkama prosedürünü dört kez tekrarlayın. Mikro dilimleri 37 santigrat derecede hafifçe sallama veya ters çevirme ile dengeleyin ve Krebs tamponunu toplamda bir saat boyunca her 15 dakikada bir değiştirin. Bu süreden sonra, iki mililitre taze 37 santigrat derece Krebs tamponu ekleyin ve 15 ila 20 mikro dilimi düz tabanlı polistiren beş mililitrelik bir tüpe aktarın.

Pürüzsüz kenarlı ekstra geniş delikli bir pipet ucu kullanarak, mikro dilimleri tüpün tabanına tek bir katman halinde eşit şekilde yayın, böylece her bir mikro dilim oksijenli atmosferden birkaç milimetreden daha uzakta olmaz. Düzgün bir şekilde düzenlendikten sonra, mikro dilimlere uygun oksijenasyon sağlamak için mikro dilimleri 37 santigrat derece su banyosunda inkübe edin. En iyi sonuçları elde etmek için mikro dilimlerin gazla doğrudan temas etmek üzere mekanik olarak bozulmasını önlemek için, gaz hattı konumları yüzeyin hemen üzerindeyken karbojeni sürekli olarak mikro dilim süspansiyonunun üzerinden geçirin.

Mikro dilimlerin doğru şekilde havalandırılması çok önemlidir. Gaz hattının, mikrosite süspansiyonunun yüzeyinden doğru mesafeye yerleştirilmesi önemlidir. Birden fazla stimülasyonun oluşmasına izin vermek için birkaç çizgi birbirine kaynaştırılabilir.

Aynı zamanda, çeşitli uyaranlar kullanılabilir. Bu örnekte, mikro dilimler AMPA stimülasyonuna tabi tutulur. Mikro dilimleri tek başına sitotoksik bir uyaran veya Krebs tamponu ile tedavi edin.

Uyarılmış grup üzerinde bir kontrol için. İnkübasyon çözeltisini stimülasyondan sonra çeşitli zamanlarda çıkarın ve istenen zaman noktasında 300 mikrolitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu ile değiştirin. Stimülasyondan sonra, mikro dilimleri bir cam teflon kuş tüyü homojenizatör kullanarak buz üzerinde homojenize edin, homojeni daha fazla analiz için hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Solunum oranları, tavuğun ön beyninden toplanan mikro dilimlerin, üretimden sonra iki saate kadar canlı olduğunu göstermektedir. Mikro dilimlerde bulunan yüksek A TP ve düşük A DP seviyeleri de canlı hücrelerin karakteristiğidir. Bu örnekte, doku potasyum içeriği ölçüldü ve diseksiyondan sonra arka planın hemen üzerinde olduğu bulundu, ancak Krebs tamponu ile inkübasyon üzerine artmış olması, WABE ve EGTA'nın eklenmesi doku potasyum içeriğinin azalmasına neden oldu, bu da mikro dilimlerin normalde aktif olarak potasyum pompaladığını ve seviyelerin ölü doku veya interstisyel boşluklarda sıkışan potasyumdan kaynaklanmadığını gösterdi.

Burada erkek sıçanların striatum ve duyusal korteksinden mikro dilimler üretildi ve yüksek potasyumlu krema tamponu kullanılarak depolarize edildi. Tutkal N iki B fosforilasyon hızı korteks ve striatum arasında değişirken, tutkal a bir fosforilasyon oranı iki alan arasında benzerdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru yapılırsa yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir.