Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı fare beyin dilimlerinde nöral progenitör mitozun görüntülenmesi ve analizini yapmaktır. Bu, önce embriyolardan beyinlerin diseksiyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım, vibrato ile beyin dilimleri hazırlamaktır.

Daha sonra, beyin dilimlerinin canlı görüntülemesi yapılır. Son adım, ilgilenilen mitoz parametrelerini analiz etmek için filmlerden bilgi çıkarmaktır. Sonuç olarak, beynin progenitör popülasyonlarının gerçek zamanlı olarak nasıl bölündüğünü göstermek için hızlandırılmış mikroskopi kullanılır.

Bu tekniğin sabit analiz gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, canlı beyin dilimlerinde nöro progenitör bölünmenin zamansal dinamikleri hakkında önemli bilgiler edinilebilmesidir. Genetik bozulmaların nöro progenitör bölünmesini nasıl etkileyebileceğini anlamak için de kullanılabilir. Kortikal gelişimi anlamak için bu yöntemi kullanmamıza rağmen, tarif ettiğimiz analiz, diğer beyin bölgelerinde ve hatta beynin dışında kök hücrelerin mitoz çalışmasına uygulanabilir.

Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Louis y olacak. Bu işleme fare embriyolarını toplayarak başlayın ve arka beyinler ve iki serebral hemisfer ile dört beyin de dahil olmak üzere embriyonik beyinleri inceleyin. Bir kova buzda, gömme kalıpları için buzda bir delik açın.

Ardından, %3 aros ortamını plastik bir kalıba dökün ve bu kalıbı buzdaki deliğe yerleştirin. Sıcaklık 35 santigrat dereceye ulaşana kadar aros ortamını dijital bir termometrenin ucuyla karıştırın. Daha sonra, beyin ve aros arasındaki arayüzde fazla HBSS'yi çıkarmak için beyni derhal gömme ortamına aktarın.

Gömme solüsyonunda beyni dikkatlice ve nazikçe tekrar tekrar döndürün. Forseps ile, kalıbın dibinde buzla temas halinde bir jelleşmiş aros yastığı oluşacaktır. Beyin karıştırılırken forsepsin ucu ile yastık hissedilebildiğinde, beyni sırt tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın, beyin kalıbın en altına batmamalıdır.

Kalıbın köşelerini jiletle kesmeden önce aroların en az beş dakika buzda sertleşmesine izin verin. Beynin etrafına dikkatlice bir aros bloğu açın ve gömülü beyni rahatsız etmemek için kesik sayısını en aza indirmeye çalışın. VT 1000 s Viome ile 200 ila 250 mikronluk dilimler oluşturur.

Şimdi, cyto 11'i, büyüme faktörleri ile desteklenmiş dilim kültürü ortamında 0.5 ila bir mikromolar nihai konsantrasyona seyreltin ve 12 oyuklu bir plaka, bir beyinden dilimleri her bir kuyucukta 2.5 mililitre boyama çözeltisinde 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra dilimleri 2.5 mililitre dilim kültürü ortamında 20 dakika boyunca boyama çözeltisi olmadan yıkayın. Beyin bölümlerini monte etmek için, 35 milimetrelik cam tabanlı bir mikro kuyu kabının dibine bir damla kollajen çözeltisi yerleştirin.

Dilimin boyutuna uyacak şekilde bir pipet ucuyla yayın. Sonra bir dilimi bir damla kollajen içine aktarın. Dilimleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmeye bırakın ve onları %5 karbondioksit içeren 37 derecelik bir inkübatöre aktarın.

Toplam 1.2 mililitre dilim kültür ortamında 20 dakika sonra cam tabanlı mikroya yerleştirin, bir seferde 600 mikrolitre ortamı iyice kaplayın ve bir pipet ucu ile yayın. Dilimleri inkübatörde en az bir saat 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile geri kazanılmasına izin verin ve aynı koşullarda eğirme diski konfokal mikroskobun inkübasyon odasına aktarın. Canlı görüntülemeye gelince, 300 mikron çalışma mesafesine ve 1,3 sayısal açıklığa sahip 60 x silikon yağı objektifi kullanın.

Hücre görüntüleme görüntüsü için, 30 mikronluk bir Z yığınındaki hücreler, dilimin yüzeyinin yaklaşık 40 mikron altında bulunan Z yığınının merkezi ile birlikte yığınlanır. Gerekirse, foto ağartmayı sınırlamak için lazer gücünü ve pozlama sürelerini ayarlayın ve cyto 11 sinyalinin yoğunluğuna bağlı olarak 30 ila 200 milisaniye arasında değişen pozlama süresini kullanın. Görüntü J'deki mitotik rakamları tanımlamak için bu analizden elde edilebilecek temsili veriler aşağıda verilmiştir.Veri kümesini hiper yığın olarak bir konum için açtıktan sonra, doku ve hücrelerin sağlıklı göründüğü bir Z düzlemi seçin.

Hücrenin mitoza girdiği zaman noktasını belirlemek için zamanda geriye gidin. Hücre Z düzlemleri boyunca hareket edebilir, ancak daha önce açıklanan zamansal çözünürlük ve Zack parametreleri bu işlemi mümkün kılmak için optimize edilmiştir. Bir elektronik tabloda, mitoza girerken hiper yığındaki hücrenin dört D koordinatını kaydedin.

Bu koordinatları bilmek, aynı hücrenin birkaç kez sayılmasını önleyecektir. Zamanda ileri kaydırın ve hücrenin bir aşamadan diğerine ilerlediği zamanı kaydedin. Hücrelerin 3D rekonstrüksiyonunu ve metafaz sırasında rotasyonun niceliğini gerçekleştirmek için belirli bir hücre için her mitotik fazın süresini belgeleyin.

Birden fazla mitotik hücre tanımlandıktan sonra, bir hücrenin koordinatlarını kullanın ve başlangıca kadar zamanda ileri kaydırın. Metafaz, ventriküler sınır planya olacak şekilde tüm hiper yığını döndürür. Bu dönüş için uygulanacak açıyı belirlemek için açı aracını kullanın.

İlgilenilen hücrenin o düzlemde en görünür olduğu Z düzlemini belirleyin. Tüm hücreyi içeren bir seçim çizmek için dikdörtgen seçim aracını kullanın. Ardından, ilgilenilen hücreyi içeren Z düzlemlerini tanımlayın ve bir alt yığın oluşturmak için görüntü çoğalt komutunu kullanın.

İletişim kutusunda, yinelenen hiper yığını dilimleri işaretli bırakın. Z parametresi, tüm hücre dahil olmak üzere Z düzlemlerine karşılık gelir ve çerçeveler T parametresi geçerli zaman noktasına karşılık gelir. Bundan sonra, hücrenin 3B rekonstrüksiyonunu oluşturun.

Geçerli zaman noktasında. Dilim aralığı, mikron cinsinden Z düzlemi görüntülerinin her biri arasındaki aralığa karşılık gelir. Kaydırma çubuğunu kullanarak, elde edilen 3B rekonstrüksiyonu, metafaz plakasının kenarı görünecek şekilde döndürün.

Çerçeve numarası beta açısına karşılık gelir. Bu numarayı kaydedin. Ardından yatay ve hizalama arasındaki açıyı ölçün.

Metafaz plakasını dik olarak incelemek. Bu açı alfa kaydıdır. Bu açılar, ilgilenilen hücrenin tüm metafaz zaman noktaları için.

T ve t zaman noktaları eksi bir arasındaki dönme açısı, dorsal ventral eksen boyunca t ve t eksi bir'deki bu açı arasındaki farkın mutlak değerine eşittir. Mitozis en kolay beyin dilimlerinin dorsal bölgelerinde görüntülenir, çünkü R GC'lerin bazal süreci daha kısadır ve bu nedenle bir viyom tarafından kesilme olasılığı daha düşüktür. ROS coddle ekseni boyunca, dorsal korteksin coddle bölgelerindeki dilimler en tutarlı sonuçları verir.

Bunlar görüntüleme için iyi bir bölge ve kötü bir bölge örnekleridir. İyi bir bölgede. Çekirdekler eliptik şekillidir ve kötü bir bölgede hızlandırılmış görüntülemeden önce ventrikül sınırında birçok mitotik hücre gözlenir, ventrikül sınırında çok az mitotik hücre gözlenir ve çekirdekler yuvarlaktır.

İşte canlı görüntülemeden önce düşük büyütmeli bir mikroskopla gözlemlenen iyi bir dilim örneği ve burada mitozun farklı aşamalarında cyto 11 etiketli hücrelerin bazı örnekleri verilmiştir. Burada gösterilen, ventrikülün sınırında, iki nöral progenitörün farklı renklerle işaretlenmiş farklı mitoz evrelerinden geçtiği bir bölgenin montajıdır: Bu prosedürü takiben. DNA yapılarının nötr elektroporasyonunda olduğu gibi diğer yöntemler, bölünen hücrelerin kaderi nedir ve hücre iskeleti nasıl davranır gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Mitozu takip etmek için CY 11'in ötesinde, H iki VGFP transgenik fare gibi ikincil yöntemler kullanmak da en iyisidir. Bu videoyu izledikten sonra, beyin dilimlerini nasıl manipüle edeceğinizi, hangi eşleşen parametrelerin en iyi olduğunu ve verileri nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.