Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı fare beyin kesitlerinde nöral progenitör mitozunun görüntülenmesini ve analizini gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle embriyolardan beyinlerin diseksiyonuyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise bir vibratom ile beyin kesitlerinin hazırlanmasıdır.

Ardından, beyin kesitlerinin canlı görüntülemesi gerçekleştirilir. Son adım, ilgilenilen mitoz parametrelerini analiz etmek için videolardan bilgi çıkarmaktır. Nihayetinde, beyindeki progenitör popülasyonlarının gerçek zamanlı olarak nasıl bölündüğünü göstermek için zaman ayarlı mikroskopi kullanılır.

Bu tekniğin, fiksasyon analizi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, canlı beyin kesitlerinde nöral progenitör bölünmesinin zamansal dinamikleri hakkında önemli bilgiler elde edilebilmesidir. Ayrıca, genetik perturbasyonların nöral progenitör bölünmesini nasıl etkileyebileceğini anlamak için de kullanılabilir. Biz bu yöntemi kortikal gelişimi anlamak için kullansak da, tanımladığımız analiz diğer beyin bölgelerindeki veya hatta beyin dışındaki kök hücrelerin mitoz çalışmalarına da uygulanabilir.

Bu prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Louis y uygulamalı olarak gösterecektir. Prosedüre, fare embriyolarını toplayarak ve arka beyin ile iki serebral hemisferi içeren dört beyin parçası dahil olmak üzere embriyonik beyinleri diseke ederek başlayın. Bir buz kovasındaki buzda, gömme kalıpları için bir delik açın.

Ardından, %3'lük aros ortamını plastik bir kalıba dökün ve bu kalıbı buzun içindeki deliğe yerleştirin. Sıcaklık 35 °C'ye ulaşana kadar aros ortamını bir dijital termometrenin ucuyla karıştırın. Daha sonra, beyin ile aros arasındaki arayüzde bulunan fazla HBSS'yi uzaklaştırmak için beyni hızla gömme ortamına aktarın.

Beyni gömme solüsyonu içerisinde dikkatli ve nazik bir şekilde defalarca döndürün. Pens yardımıyla, kalıbın buzla temas eden tabanında jelleşmiş agar tabakası oluşacaktır. Beyni karıştırırken pensin ucuyla bu tabaka hissedildiğinde, beyni dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın; beyin kalıbın en dibine çökmemelidir.

Kalıbın köşelerini jiletle kesmeden önce, arosun buz içinde en az beş dakika boyunca sertleşmesini bekleyin. Gömülü beyni rahatsız etmemek için kesim sayısını minimumda tutmaya çalışarak beynin etrafındaki aros bloğunu dikkatlice oyun. VT 1000 s Viome ile 200 ila 250 mikron kalınlığında kesitler oluşturun.

Şimdi cyto 11'i, büyüme faktörleri eklenmiş dilim kültür ortamında 0,5 ila 1 µM nihai konsantrasyona seyreltin ve tek bir beyinden alınan dilimleri 12 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğunda 2,5 mL boyama çözeltisi ile 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından dilimleri, boyama çözeltisi içermeyen 2,5 mL dilim kültür ortamında 20 dakika boyunca yıkayın. Beyin kesitlerini monte etmek için, 35 mm cam tabanlı bir mikro kuyu plağının tabanına bir damla kolajen çözeltisi yerleştirin.

Pipet ucuyla, kesitin boyutuna uygun şekilde yayın. Ardından, bir kesiti bir damla kolajen içerisine aktarın. Kesitleri, %5 carbon dioxide içeren 37 degree Celsius'lik bir inkübatöre aktarmadan önce oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Cam tabanlı mikro kuyucuklu tabağa toplam 1,2 mililitre dilim kültürü ortamı ekledikten 20 dakika sonra, ortamı her seferinde 600 mikrolitre şeklinde ekleyin ve bir pipet ucuyla yayın. Dilimleri, aynı koşullara sahip döner disk konfokal mikroskobun inkübasyon haznesine aktarmadan önce, 37 °C'de ve %5 karbondioksit içeren inkübatörde en az 1 saat 30 dakika boyunca dinlenmeye bırakın. Canlı görüntüleme için, 300 mikron çalışma mesafesine ve 1,3 sayısal açıklığa sahip 60x silikon yağ objektifi kullanın.

Hücre görüntüleme için, Z yığınının merkezi kesit yüzeyinin yaklaşık 40 mikron altında olacak şekilde, 30 mikronluk bir Z yığınıyla hücreleri görüntüleyin. Gerektiğinde, fotobeyazlamayı sınırlamak için lazer gücünü ve pozlama sürelerini ayarlayın ve cyto 11 sinyalinin yoğunluğuna bağlı olarak 30 ile 200 milisaniye arasında pozlama süresi kullanın. Burada, Image J'de mitotik figürleri tanımlamak için bu analizden elde edilebilecek temsili veriler yer almaktadır. Bir konum için veri setini hiper yığın (hyper stack) olarak açtıktan sonra, doku ve hücrelerin sağlıklı göründüğü bir Z düzlemi seçin.

Hücrenin mitoza girdiği zaman noktasını belirlemek için zamanda geriye gidin. Hücre Z düzlemleri arasında hareket edebilir ancak zamansal çözünürlük ve daha önce açıklanan Zack parametreleri bu işlemi mümkün kılacak şekilde optimize edilmiştir. Bir hesap tablosuna, hücrenin mitoza girdiği andaki hiper yığındaki dört D koordinatını kaydedin.

Bu koordinatların bilinmesi, aynı hücrenin birkaç kez sayılmasını önleyecektir. Zaman çizelgesinde ileriye doğru kaydırın ve hücrenin bir evreden diğerine geçtiği zamanı kaydedin. Hücrelerin 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmek ve metafaz sırasındaki rotasyonun miktarını belirlemek için belirli bir hücrenin her bir mitotik evresinin süresini belgeleyin.

Birden fazla mitotik hücre belirlendikten sonra, bir hücrenin koordinatlarını kullanın ve başlangıca kadar zamanda ileriye doğru kaydırın. Ventriküler sınırın daha düzlemsel olması için tüm hiper yığını metafazda döndürün. Bu döndürme işlemi için uygulanacak açıyı belirlemek adına açı aracını kullanın.

İlgilenilen hücrenin en görünür olduğu Z düzlemini belirleyin. Tüm hücreyi kapsayacak bir seçim yapmak için dikdörtgen seçim aracını kullanın. Ardından, ilgilenilen hücreyi içeren Z düzlemlerini belirleyin ve bir alt yığın oluşturmak için görüntü çoğaltma komutunu kullanın.

İletişim kutusunda, yinelenen hiper yığın seçeneğini işaretli bırakın ve kesitleri seçin. Z parametresi, hücrenin tamamını ve çerçeveleri içeren Z düzlemlerine karşılık gelir; T parametresi ise mevcut zaman noktasına karşılık gelir. Ardından, hücrenin 3D rekonstrüksiyonunu oluşturun.

Mevcut zaman noktasında. Dilim aralığı, her bir Z düzlemi görüntüsü arasındaki boşluğun mikron cinsinden karşılığıdır. Kaydırma çubuğunu kullanarak, metafaz plağının kenarı görünür olacak şekilde sonuçtaki 3D yeniden yapılandırmayı döndürün.

Kare numarası beta açısına karşılık gelir. Bu numarayı kaydedin. Ardından, yatay hat ile hizalama kolları arasındaki açıyı ölçün.

Metafaz plağının diklemesine diseksiyonu. Bu, alfa kayıt açısıdır. İlgilenilen hücrenin tüm metafaz zaman noktaları için bu açılar.

t ile t eksi bir zaman noktaları arasındaki dönme açısı, dorsal ventral eksen boyunca t'deki bir açı ile T eksi birdeki bu açı arasındaki farkın mutlak değerine eşittir. Mitoz, beyin kesitlerinin dorsal bölgelerinde en kolay şekilde görüntülenir çünkü RGC'lerin bazal uzantısı daha kısadır ve bu nedenle bir viome tarafından kesilme olasılığı daha düşüktür. ROS koddle ekseni boyunca, dorsal korteksin koddle bölgelerindeki kesitler en tutarlı sonuçları verir.

Bunlar, görüntüleme için uygun olan ve olmayan bölge örnekleridir. Uygun bir bölgede, çekirdekler eliptik şekillidir ve time-lapse görüntüleme öncesinde ventrikül sınırında birçok mitotik hücre gözlemlenir; uygun olmayan bir bölgede ise ventrikül sınırında çok az sayıda mitotik hücre gözlemlenir ve çekirdekler yuvarlaktır.

Burada, canlı görüntüleme öncesinde düşük büyütmeli mikroskopla gözlemlenen iyi bir kesit örneği ve burada, mitozun farklı evrelerindeki cyto 11 ile işaretlenmiş bazı hücre örnekleri yer almaktadır. Burada, bu prosedürün ardından ventrikül sınırındaki bir bölgenin, iki nöral progenitörün farklı renklerle işaretlenmiş mitoz evrelerinden geçtiği bir montajı gösterilmektedir. Bölünen hücrelerin akıbeti nedir ve hücre iskeleti nasıl davranır gibi ek soruları yanıtlamak için, DNA konstrüktlarının nötral elektroporasyonu gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

Mitozu takip etmek için H2VGFP transgenik fareler gibi CY 11 dışındaki ikincil yöntemlerin kullanılması da en iyisidir. Bu videoyu izledikten sonra, beyin kesitlerinin nasıl manipüle edileceği, hangi eşleştirme parametrelerinin en uygun olduğu ve verilerin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.