Zebrafish Mikroenjeksiyon Teknikleri

Zebrafish embriyolarına yapılan mikroenjeksiyon, araştırmacıların gen fonksiyonlarını ve gelişimsel dinamikleri incelemek amacıyla çözeltileri doğrudan gelişmekte olan hayvana iletmelerine olanak tanır. Enjeksiyon için sıklıkla 1 ila 4 hücreli evredeki embriyolar kullanılır. Bu erken evrede hücreleri ve vitellusu ayıran membranlar bulunmadığından, tek bir hücreye veya vitellusa enjekte edilen çözeltiler organizma genelinde eşit şekilde yayılır. Mikroenjeksiyon kullanılarak, enjekte edilen materyalin türüne bağlı olarak protein üretim genleri eksprese edilebilir veya kapatılabilir. Bu video; pipet hazırlama, embriyo toplama ve mikroenjeksiyon prosedürünü gösterecek ve bu tekniğin günümüzde laboratuvarlarda kullanıldığı bazı yöntemleri tartışacaktır.

Öncelikle mikroenjeksiyon sisteminin ana bileşenlerini ele alalım: Stereoskop, mikroenjektör, pipet tutucu ve mikromanipülatör.

Mikroenjektör, kullanıcı tarafından ayarlanabilen hava basınç darbeleri aracılığıyla hassas hacimler iletir. Pipet tutucu, prosedür sırasında kullanım için pipeti sabitler ve onu enjektörün hava hattına bağlar. Genellikle pipet tutucu bir mikromanipülatöre yerleştirilir. Bu cihaz, araştırmacının enjeksiyon prosedürü sırasında pipet konumunda küçük ve hassas ayarlamalar yapmasına olanak tanır. Enjektöre bağlı bir ayak pedalı, araştırmacının ellerini serbest tutarken aynı zamanda enjeksiyon materyalinin iletimi için basınç darbesini etkinleştirmesini sağlar. Son olarak stereoskop, araştırmacının embriyoları görmesine ve mikroenjeksiyon prosedürü sırasında pipetin konumuna odaklanmasına imkan verir.

Mikroenjeksiyon işlemine başlanmadan önce cam iğneler hazırlanmalıdır. Enjeksiyon materyallerinin hassas bir şekilde iletilmesini sağlamak için mikroenjeksiyon iğneleri standart bir boyutta olmalıdır. Bir pipet çekici, her seferinde ince ve keskin pipetlerin hazırlanmasını sağlar. Çekici, cam bir kapiler tüpü ısıtırken aynı zamanda tüpü çeken bir kuvvet uygulayarak iki adet pipet iğnesi oluşturur.

Mikroskop altında, pens kullanılarak uç kısmı, zebrafish embriyosunu delmek için iğnenin keskinliğini koruyacak ancak tutarlı bir sıvı hacminin iletilmesine izin verecek şekilde kesilir.

Enjeksiyon prosedürünün görselleştirilmesine yardımcı olmak için kullanılan bir boya olan fenol kırmızısı, embriyoya başarılı enjeksiyonu takip etmek amacıyla enjeksiyon solüsyonu ile karıştırılabilir.

İğneler, kapiler etki yoluyla uç kısmından enjeksiyon solüsyonu ile doldurulabilir veya bir mikro-yükleyici şırınga ile arkadan doldurulabilir. İğne enjeksiyon için doldurulduğunda, mikromanipülatör üzerindeki pipet tutucuya yerleştirilebilir.

Enjeksiyon iğneleri hazırlandıktan sonra, her embriyoya tutarlı bir hacmin iletilmesini sağlamak amacıyla her bir iğneyi kalibre etmek için mikroenjektör basınç ve zaman ayarları düzenlenir. Stereoskop altında, lam üzerindeki bir mineral yağı damlasına az miktarda solüsyon enjekte edilir. Damlacığın boyutu ölçülür ve iğnenin dağıttığı hacim hesaplanabilir. Ardından, mikroenjektörün basıncı daha fazla ayarlanabilir ve istenilen boyutta bir damlacık düzenli olarak elde edilene kadar işlem tekrarlanır.

İğneler hazırlanıp kalibre edildikten sonra, embriyolar elde edilir ve enjeksiyon için düzenlenir.

Embriyolar dikkatlice konumlandırılmalı ve enjeksiyon sırasında bir mikroenjeksiyon odası ile sabit tutulmalıdır. Bir mikroenjeksiyon odası oluşturmak için, petri kabına kalıplar yerleştirilir ve erimiş agaroz kaba dökülerek sertleşmesi beklenir. Katılaştıktan sonra kalıp çıkarılır ve üzerine embriyo besiyeri dökülür. Embriyolar, bir transfer pipeti kullanılarak kalıbın oluşturduğu oluklara dizilebilir. Embriyoları agaroz içinde düzenlemeye alternatif bir yöntem ise, mikroenjeksiyon için bir sütun şeklinde konumlanacak şekilde mikroskop lamının kenarı boyunca dizmeleridir.

Konumlandırıldıktan sonra embriyolar enjeksiyona hazır hale gelir.

Embriyolara enjeksiyon ya vitellusa (sarısına) ya da hücre sitoplazmasına yapılabilir. Vitellusa enjeksiyon daha basit olup daha az gelişmiş bir enjeksiyon tekniği gerektirirken, sitoplazmaya yapılan enjeksiyon daha zordur ancak daha güçlü sonuçlar verir. Vitellusa enjeksiyon yapmak için, iğnenin önce koriyona ardından vitellusa nüfuz etmesini sağlayacak şekilde mikromanipülatör ile hareket ettirin. Daha sonra iğnenin içeriğinin vitellusa boşaltılması için ayak pedalına hafifçe basılır. Sitoplazmik akış ve difüzyon, enjeksiyon solüsyonunun hücre içine akmasını sağlar.

Sitoplazmaya yapılan enjeksiyon, sitoplazmanın etkili bir şekilde hedeflenebilmesi için embriyonun dikkatli bir şekilde konumlandırılmasını gerektirir.

Enjeksiyonun ardından embriyolar yeni bir kaba aktarılır ve 28.5 °C'de inkübe edilir. Ölü embriyoları ayıklamak için düzenli olarak kontrol edilirler.

Enjeksiyonun başarısını belirlemek için embriyolar; genel görünümlerine, floresan bir işaretçinin varlığına ve genotipleme yoluyla genomlarındaki değişikliklerin incelenmesine dayanarak analiz edilebilir.

Zebrafish embriyolarına nasıl enjeksiyon yapacağınızı anladığınıza göre, bilim insanlarının genlerin işlevini anlamak için bu tekniği nasıl kullanabileceklerine bakalım.

İlk olarak, bilim insanları belirli genleri aşırı ifade etmek (overexpress) ve fenotipi gözlemleyerek işlevlerini belirlemek için sentezlenmiş mRNA enjekte edebilirler. Aynı teknik, gelişim sırasında meydana gelenle sitoskeletal yeniden düzenlenmeler gibi moleküler olayları belirginleştiren proteinleri ifade etmek için de kullanılabilir.

İkinci olarak, morfolinolar enjekte edilerek genler kapatılabilir. Morfolinolar, standart nükleik asit baz eşleşmesi yoluyla belirli mRNA dizilerine bağlanacak ve translasyonu engelleyecek şekilde tasarlanabilen kararlı sentetik nükleik asit analoglarıdır. Bu durum, sonuç olarak o mRNA tarafından üretilen proteinin kaybına yol açar. Bu etki, araştırmacıların, bir genin yokluğunda gelişimin nasıl değiştiğini görerek, söz konusu genin gelişimdeki rolünü anlamalarını sağlar.

Enjeksiyon, yabancı DNA'nın zebrafish'e aktarılması için kullanılabilir. DNA modifiye edici enzimler için tanıma bölgeleri içeren diziler enjekte ederek, bilim insanları modifiye edilmiş genomlara sahip "transgenik" balıkları etkili bir şekilde üretebilirler; bu, yabancı genlerin gelecek nesillere aktarılacağı anlamına gelir. Dizinin tasarımına bağlı olarak, gen ekspresyonu belirli dokularla veya belirli gelişim zaman noktalarıyla sınırlandırılabilir.

JoVE'nin erken dönem zebrafish embriyolarına mikroenjeksiyon giriş videosunu izlediniz. Bu videoda mikroenjeksiyon düzeneği tanıtıldı, mikroenjeksiyon iğnelerinin nasıl hazırlanacağı gösterildi, embriyoların mikroenjeksiyona nasıl hazırlanacağı ve mikroenjeksiyon tekniğinin nasıl uygulanacağı anlatıldı ve mikroenjeksiyonun bazı uygulamaları sunuldu. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!