Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu kanser modellerinde hücre dışı matrisin mekanik özelliklerindeki boylamsal değişimleri ölçmektir. Bu işlem, öncelikle kanser hücrelerinin hasat edilmesi ve tümör steroidinin istenen boyuta ulaşana kadar uygun bir yöntemle büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise tümör steroidinin kolajene veya uygun başka bir hücre dışı matrise gömülmesidir.

Ardından, örnekleme noktalarının oluşturduğu ızgara yapılandırılır ve her noktada bir video çekilir. Son adım, video verilerini analiz etmek ve her mekansal noktadaki gerçek lojik özellikleri hesaplayıp birlikte kaydırmaktır. Nihayetinde bu protokol, hücre dışı matris mekaniğindeki mekansal değişiklikleri tahribatsız bir şekilde boylamsal olarak nicelleştirmek için izleyici prob yörüngelerinin analizini kullanır.

Buradaki temel fikir; hücre dışı matris radyolojisinin görüntüleme tabanlı ölçümlerini, hücre dışı matris etkileşimlerini yeniden kuran in vitro 3D tümör modelleriyle bir araya getirerek, tümör büyümesi, invazyon süreçleri ve tedaviye yanıta eşlik eden mekanik mikroçevredeki zamana bağlı değişikliklere ilişkin nicel bir içgörü sağlamaktır. Bu videoda gösterilen yöntem, yerleşik pankreas kanseri hücre hattı PAN-1'den yapışkan olmayan 3D organoidler (OID'ler) üretmek için bir Agarose overlay yaklaşımı benimsemektedir. Başlamak için, %1'lik bir Agarose çözeltisi elde etmek amacıyla 10 mL hücre kültürü sınıfı suyu 0,1 g Agarose ile karıştırın.

Aros çözeltisini ekleme işleminden önce 70 °C'nin üzerine ısıtın. Çözeltiden 40 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın, plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin, kanser hücrelerini tripsin ile toplayın ve hücre süspansiyonunu mL başına 1000 hücre olacak şekilde seyreltmeden önce tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Bu dilüsyonun 100 µL'sini kürlenmiş aros yatağını içeren kuyucuğa ekleyin.

İnkübasyonun ardından numuneyi, 37 °C ve %5 CO2 olarak ayarlanmış bir inkübatördeki çalkalayıcıya yerleştirip gece boyunca bekletin. Numuneyi çalkalayıcıdan çıkarın, 100 µL hücre kültür medyumu ekleyin ve oluşan steroid desired çap değerine ulaşana kadar inkübasyona devam edin. Örneğin, dokuz gün sonra, bir pan, bir steroid yaklaşık 450 µm çapında olacaktır.

Başlamak için, laminar akışlı bir kabin içerisinde iki adet iki mililitrelik flakon ile bir çalışma alanı hazırlayın. Birinci flakon tümör steroidini, ikinci flakon ise hücresiz kontrolü içerecektir. İki birim stok probu 25 birim steril suya ekleyerek, karboksilat modifiyeli bir mikron çaplı floresan izleyici problardan oluşan seyreltilmiş bir karışım hazırlayın.

Buzdolabından 3,1 mg/mL'lik bir şişe sığır kolajeni çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Birinci viyale 125 µL kolajen, ardından 50 µL seyreltilmiş izleyici prob çözeltisi ekleyin; probların dağılması için kısa süreliğine vorteksleyin. Daha sonra, toplam hacim 410 µL olacak şekilde fenol kırmızısı içeren 235 µL uygun hücre kültürü ortamı ekleyin ve 205 µL'sini alıp ikinci viyale yerleştirmeden önce kısa süreliğine vorteksleyin. Sonrasında, viyale yaklaşık 2 µL 1 M sodyum hidroksit ekleyin.

Çözeltiyi tekrar nötr pH'a getirmek için kısa süreliğine vorteksleyin. Ardından, karışımın kürlenmeye başlamaması için hemen buz rafına geri yerleştirin. Tümör steroidini içeren kuyucuktan nazikçe 40 µL besiyeri alın.

Bir sonraki adımı gerçekleştirirken bu 40 µL'yi saklayın. Steroidin önceki adımda uzaklaştırılıp uzaklaştırılmadığını anlamak için kuyucuğu kontrol edin. Eğer uzaklaştırılmadıysa, 40 µL'yi tekrar kuyucuğa yerleştirin ve önceki adımı tekrarlayın.

Eğer öyleyse, steroid içeren 40 µL'yi tüpe ekleyin. Karışımı bir 96 kuyucuklu plakadaki üç ayrı kuyucuğa 60 µL'lik porsiyonlar halinde aktarmadan önce tüpü nazikçe çalkalayın; steroidin hangi kuyucukta olduğunu belirlemek için karışımı ekledikten sonra her kuyucuğu mikroskopla inceleyin. Ardından, ikinci tüpe yaklaşık 2 µL 1 M sodyum hidroksit ve 40 µL hücre kültürü medyumu ekleyin ve ekleme yapmadan önce vorteksleyin.

Bu karışımdan 60 µL'yi 96 kuyucuklu plaktaki boş bir kuyucuğa aktarın ve hücre içermeyen kontrol olarak etiketleyin. Örnek noktalarından oluşan bir ızgara oluşturmak için plakayı en az bir saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde bekletin. İlk olarak, örnek plağını inkübatörden mikroskop tablasına transfer edin.

Isıtmalı bir tabla mevcut değilse, numunenin oda sıcaklığına dengelenmesi için 10 dakika bekleyin. Numunenin sağlam olduğundan ve görüntülemeye hazır olduğundan emin olmak için düşük büyütmeli objektif lenslerle gözlemleyin. Tümörün kuyucuk içindeki konumunu belirleyin ve sonraki mekansal ko-kayıt işlemi için bunu bir iletim ışığı görüntüsü ile belgeleyin.

Genellikle, her kuyucukta S sferoidinin etrafındaki konsentrik halkalar şeklinde dağıtılmış 20 örnekleme noktası, yeterince ayrıntılı sonuçlar verecektir. Sahneyi istenen her bir konuma getirin ve XNY koordinatlarını kaydetmek için mikroskop arayüz yazılımını kullanın. Mikroskobu yüksek güçlü bir objektife geçirin ve izleyici probların eksitasyon dalga boyu için uygun filtre küpünü seçin.

Oluşturulan noktaların listesini kullanarak ızgaradaki ilk noktaya gidin. Yukarı hareket etmeden önce kuyucuğun tabanını bulmak için odağı ayarlayın. Odakta birden fazla izleyici prob içeren bir görüş alanı bulun.

Yoğunluk histogramını gözlemleyin ve görüntünün doyuma ulaşmadığından emin olarak mümkün olan en geniş dinamik aralığı sağlayacak şekilde pozlama yoğunluğunu ve süresini ayarlayın. Kare başına 20 ila 30 milisaniye kare hızında bir video dizisi elde edin ve uygun bir adlandırma kuralıyla kaydedin. Kayıt sırasında mikroskoba veya masaya dokunmayın.

Kayıt işlemini ızgaradaki her bir örnekleme noktası için tekrarlayın. Ardından, deneydeki her bir kuyucuk için bir ızgara oluşturmak üzere işlemi tekrarlayın ve tüm süreci boylamsal izleme süresindeki her bir zaman noktası için yeniden uygulayın.

Veri analizine başlamak için tüm video verilerini bir analiz klasörüne kopyalayın. Görüntü verilerini MATLAB'a veya başka bir analiz yazılımına aktarın.

Prob merkez konumlarını belirlemek için seçim ve reddetme parametrelerini uygun şekilde saptamak amacıyla videonun birkaç karesini analiz ederek yazılımı kalibre edin. Ardından, tüm video kareleri için her bir prob konumunu otomatik olarak belirlemek için yazılımı kullanın ve bu konumları yörüngelere bağlayın. Gecikme süresinin bir fonksiyonu olarak ortalama kare yer değiştirmeyi veya MSD'yi hesaplamak için yörünge verilerini kullanın; bu sırada kullanılan objektif lensine veya herhangi bir piksel birleştirmeye (binning) uygun uzaysal kalibrasyon faktörünü uyguladığınızdan emin olun.

Belirli bir numune için genelleştirilmiş Stokes Einstein bağıntısının uygulanabilirlik sınırlarını göz önünde bulundurarak G Star değerini genelleştirilmiş Stokes Einstein bağıntısını kullanarak hesaplayın. Analiz adımlarını deneydeki her bir görüş alanı için tekrarlayın. Kullanılan mikroskobun üreticisine bağlı olarak, konum verilerini ilgilenilen belirli bir frekanstaki viskoelastik mod I ile birlikte eş kaydın (coregister) yapın.

Bu adım, mikroskop metadata'sını veya konum verilerini okuyan özel bir rutin ile kolaylaştırılabilir veya veriler manuel olarak tablolaştırılabilir. Video dizileri, 3D tümör nodülü içeren temsili bir kuyucuk içindeki birden fazla mekansal konumdan elde edilir ve panın çevresindeki hücre popülasyonları boylamsal olarak izlendiğinde örneğin mekansal bir mikro radyoloji haritasını sağlamak için birbirine bağlanır. Bu örnekte kullanılan bir steroid, çevredeki kollajen liflerini kendiliğinden degrade edecek ve birkaç gün içinde hücre dışı matrise invaze olacaktır.

Bu örnekte, mikroskobinin eş-kaydı, steroidin solunda meydana gelen ancak sağında görülmeyen belirgin matriks invazyonunun kantitatif bir okumasını sağlamaktadır. Bu farklı uzamsal bölgelerin boylamsal izlemi, invazyonla eş zamanlı olarak kompleks viskoelastik kayma modülünün reel bileşeninde yaklaşık dört mertebe büyüklüğünde bir düşüş olduğunu göstermektedir. Dördüncü gündeki birinci bölge ve ikinci bölgedeki materyalin reolojik özelliklerini karşılaştıran tam frekans bağımlı veriler gösterilmiştir.

Bu prosedür uygulanırken, prob yörüngelerinin analizi sırasında hatalı sonuçlara yol açan yaygın tuzaklardan kaçınmak için dikkatli olunması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Okuyucuları, örnek kayması ve heterojenliğin yorumlanması gibi hususları ele alan, burada atıfta bulunulan PTM literatürüne başvurmaya teşvik ediyoruz. Bu prosedür, mekanik yeniden şekillenmenin temel sinyalizasyon olaylarıyla veya bir müdahaleye verilen sitotoksik yanıtla nasıl ilişkili olduğu gibi diğer soruları yanıtlamak için ek boylamsal veya terminal floresan görüntüleme ile birleştirilebilir.