Name: Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Öğrenin, partikül izleme mikroroloji kullanarak 3D tümör modellerinde ekstraselüler matriks rijitliğinin boyuna ölçümünü. Bu yıkıcı olmayan yöntem, kanser ilerlemesinin mekanik özelliklerini zamana bağlı olarak nicelendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz minnetle (Maria Kilfoil tarafından sağlanan MATLAB partikül izleme kodu açık kaynak paylaşımını kabul <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), John C. Crocker ve Eric tarafından sağlanan erken IDL kodu ve kapsamlı belgeler ile birlikte R. Weeks. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI / NIH), K99CA155045 ve R00CA155045 (: JPC PI) fon tarafından mümkün olmuştur.

1.. Kültürleme Tümör küremsileri <ol><li> Bir% 1 agaroz çözelti elde etmek için 0.1 g agaroz ile hücre kültürü dereceli su 10 ml karıştırın. </li><li> 96 oyuklu bir plaka üzerinde bir kuyuya agaroz çözeltisi 40 ul aliquoting önce 70 ° C&#39;nin üzerinde (standart mikrodalga ya da bir ısıtma plakası kullanılarak yaklaşık 14 saniye) için ısı agaroz çözüm. </li><li> Standart teknikler kullanılarak hücreler hasat sırasında en az 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin konsantrasyonunu belirlemek için bir hemasitometre kullanarak. </li><li> 1000 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltilir ve de tedavi agaroz yatak içeren, bu seyreltme 100 ul ilave edin. </li><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 de ayarlanan bir inkübatör içinde gece boyunca bir karıştırıcıda örnek yerleştirin. </li><li> Çalkalayıcı dan bir numune alın ve hücre kültür ortamı içinde 100 ul ilave edin. </li><li> İstenen çapı ulaşılana kadar küremsilerin inkübe edin. Örneğin, sonra 9 gün, spheroid çap olarak yaklaşık 450 mikron olacaktır. Bu süre boyunca, taze büyüme ortamı, oyuklara ilave edilebilir, ancak bu, sfero çıkarılmasıyla neden olacaktır çünkü aspirasyon kaçınılmalıdır. </li></ol> 2.. ECM Gömülü 3D Tümör sferoidler hazırlanıyor <ol><li> Laminar akış içinde gerekli malzemeleri ile bir iş istasyonu hazırlayın. </li><li> 25 parça steril su ile 2 kısım stok sondalar (% 2 katı) ekleyerek karboksilat-modifiye 1 mikron çapında floresan probları tracer seyreltilmiş bir karışım hazırlayın. </li><li> Buzdolabından 3.1 mg / ml sığır kollajeni bir şişe kaldırma ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> Kısım 125, boş bir şişe içine 2 ml kolajen ul. </li><li> Probları dağıtmak için kısaca kolajen ve vorteks içeren şişeye seyreltilmiş tracer sondası çözeltisinin 50 ul ekle. </li><li> Uygun hücre kültür ortamı 41 toplam hacim fenol kırmızı (ki sarı dönecek) içeren 235 ul ekleyinKısaca 205 ml (yarım toplam hacim) kaldırılması ve yeni bir 2 ml&#39;lik cam şişede yerleştirmeden önce 0 ml ve vorteks. Vial 1 tümör sfero içerir ve Vial 2, bir kontrol karışımı olacaktır. </li><li> Nötr pH (fenol kırmızısı içeren kültür ortamı kırmızı dönmelidir) geri çözüm getirmek için 1 flakon 1 M NaOH ~ 2 ul ekleyin. Bu karışım, buz üzerinde tutulur değilse kür başlamak neden olacağını not edin. Karıştırmak için vorteks kısaca, sonra hemen buz rafa dönmek. NOT: sfero kültür ve agaroz yataktan çıkartılmasını 9 gün sonra hassas bir iştir çıplak gözle zorlukla görülebilir. Diseksiyon mikroskop kullanımı, bazı kullanıcılar için yararlı olabilir. Transfer sırasında sfero bütünlüğünü korumak önemlidir. </li><li> Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, yavaşça de tümör sfero ihtiva eden ikinci medya 40 ul çıkarın. Sonraki adımı yürütürken bu 40 ul saklayın. </li><li> Görmek için kuyu kontrol edin spheroidÖnceki adımda çıkarıldı. Eğer öyle olsaydı, 1 flakon için sfero içeren 40 ul ekleyin. Değilse, geri kuyuya 40 ul yerleştirin ve önceki adımı tekrarlayın. </li><li> Yavaşça, 96 oyuklu bir plakanın üç ayrı oyuklarına 60 ul kısımlar halinde karışımın aktarmadan önce (bu küremsi zarar verebilir, vorteks riski yoktur) Vial 1 karıştırın. Iyi küremsi içeren belirlemek için karışımın ilave edildikten sonra bir mikroskop ile de, her kontrol edin. </li><li> Ekle ~ 2 ul 1 M NaOH ve 40 Vial 2 hücre kültür ortamı ul ve bir kontrol olarak 96 oyuklu plaka ve etiketleme iyi boş bu karışım 60 ul aliquotting önce girdap. </li><li> En az 1 saat boyunca tedavi etmek için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde plaka koyun. </li></ol> 3.. Örnek Noktalar Izgara Construct ve her noktada bir video atın <ol><li> Mikroskop sahneye inkübatör örnek plaka aktarın. Numune için 10 dakika Equil izin verısıtılmış bir sahne mevcut değilse, oda sıcaklığı ile ibrate. </li><li> Emin sağlam ve görüntüleme için hazır hale getirmek için düşük güçlü objektifler ile örnek gözlemlemek. Kuyunun içindeki tümör konumunu belirler. </li><li> Almak için kaç puan örnek karar verin. Tipik olarak, sfero etrafında konsantrik halkalar dağıtılan her kuyuda 20 numune noktaları, yeterince ayrıntılı sonuçlar üretecektir. </li><li> Her istenen pozisyona sahne taşımak ve x ve y koordinatları (veya yazılımı arayüzü kullanılamıyor ise rekor elle koordinatları) kaydetmek için mikroskop arayüz yazılımı kullanın. </li><li> Yüksek enerjili objektif lens (genellikle 100X) için mikroskop geçin ve izleyici probları uyarma dalga boyu için uygun filtre küpü seçin. Kılavuzdaki ilk noktaya taşımak için adım 3.4 oluşturulan noktaların listesini kullanın. </li><li> Kuyunun dibini bulmak için odağı ayarlayın, sonra (FOV) birkaç odakta trac içeren bir görüş alanına bulmak için yukarı taşımaksondalar er. </li><li> Yoğunluk histogram gözlemlemek ve görüntü doymuş hale gelmez sağlarken en dinamik aralığı vermek için mümkün maruz kalma yoğunluğu ve zaman ayarlayın. </li><li> Kare başına 20-30 msn bir kare hızında video dizisini elde (yaklaşık 800 kare veya uzunluğu 16-24 sn her uzamsal ızgara noktada toplama süresini en aza indirmek için ihtiyacı ile dengeli sağlam MSD hesaplanması için yeterli istatistik sağlamak için tavsiye edilir) ve uygun bir kongre ile kaydedin. Kayıt sırasında, mikroskop veya tabloyu dokunmayın. </li><li> Tekrar Kılavuzdaki her numune noktası için 3,6-3,9 adımları. </li><li> Tekrar deneyde her bir kuyu için 3,3-3,10 adımları. </li></ol> 4. Her örnek Noktasında Reolojik Properties hesapla Video Veri Analiz <ol><li> (Belki farklı bir bilgisayarda) bir analiz klasöre tüm video verilerini kopyalayın. </li><li> MATLAB içine ithal görüntü verileri ya da diğer analiz yazılımı. HAYIRTE: Burada benimsenen MATLAB parçacık izleme rutinleri kümesi ilişkin kapsamlı belgeler mevcuttur <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Farklı pozisyonlarda birden fazla dosya işleme otomasyonu için özel bir arama işlevinin kullanılması tavsiye edilir. </li><li> Uygun prob merkezi pozisyonları belirlenmesi için seçme ve reddetme parametreleri (boy, bant geçiren, vb) belirlemek için videonun çeşitli karelerini analiz ederek yazılımı kalibre. Bu önemli adımlar için kapsamlı plan Crocker ve Grier tarafından açıklanmıştır. </li><li> Otomatik olarak tüm video karelerinin her sonda konumunu belirlemek ve daha sonra yörüngeleri içine bu pozisyonları bağlantı yazılımını kullanın. </li><li> Vb özel objektif lens, herhangi bir piksel binning için uygun mekansal kalibrasyon faktörü (piksel başına mikron) uygulamak için emin olmak, gecikme zamanın bir fonksiyonu olarak ortalama kare yer değiştirmesini (MSD) hesaplamak için yörünge verileri kullanarak (genellikle taşınanmeta-veri). </li><li> Belirli bir numune 24,28,43 için GSER uygulanabilirlik sınırları. Alternatif olarak, kullanıcıları sadece güç kanunu ölçekleme, plato karşılaştırarak MSD doğrudan ECM özelliklerini yorumlamak isteyebilirsiniz dikkate alınır genelleştirilmiş Stokes-Einstein ilişkisini kullanarak G * (hesaplayın heterojenlik ve diğer parametrelerin değerleri, endeksleri. </li><li> Tekrar deneyde her FOV için 4,6 ile 4,2 adım. </li><li> Ilgi belirli bir frekansta viskoelastik modül kullanılmasına ile adım 3.4 konum verilerini co-kayıt. Kullanılan mikroskop üreticisine bağlı olarak, bu adım mikroskop meta veya konumunu veri elle tablo olabilir okur özel bir rutin kolaylaştırılabilir. </li><li> ECM bir mekansal reolojisi harita oluşturmak için 3D interpolasyon fonksiyonları kullanın. </li></ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokolde boylamasına 3D tümör modelleri ECM katılık yerel değişiklikleri izleme için güçlü ve yaygın olarak uygulanabilir bir strateji tanıtmak. Bu metodoloji, tümör büyümesi ve işgali süreçlerinde matris yeniden karıştığı mechanosensitive davranış ilgilenen kanser biyologlar ve fizikçinin tarafından kabul edilebileceğini öngörülüyor. Matris bozulması kinetiği kesin miktar, doğrudan matris yeniden bağlantılıdır 3B tümör modellerinde matris metaloproteazların, lisil oksidaz ya da diğer ilgili biyokimyasal tür aktivi...

Bu, kanser hücreleri, habis olmayan memeli epitel hücreleri ile olduğu gibi, çevreleyen hücre dışı matrisin (ECM) ve diğer mikro-ortam bileşenleri 1-9 mekanik ve biyofiziksel özelliklerini son derece duyarlı olduğu literatürde kanıtlar giderek artan bir gövdeden açıktır. Zarif mekanik çalışmalar malign büyüme davranışı ve morfogenetiğine 2,3,10,11 düzenleyen karmaşık bir mechanosensitive sinyal ortağı olarak hücre dışı sertlik rolüne anlayışlar sağladı. Bu çalışma, biyolojik olarak ilgili doku mimarisinin yeniden ayarlanabilir ve mekaniği ile iskele malzeme yetiştirilen ve optik mikroskopi ile görüntülenmiştir 12-19 edilebilir vitro tümör modellerinde 3D ​​geliştirilmesi ile, özellikle kolaylaştırılmıştır. Bununla birlikte, tümör ve sırayla kanser hücrelerinin çevrelerini reolojisini değiştirmek, üzerinden mikro arasında, bu mechanoregulatory iletişim diğer tarafında, bir miktar kalırçalışmak daha zor. Örneğin istilası işlemler sırasında, bir tümörün çevresinde hücreler sırayla arasında mechanosensitive büyüme davranışını etkiler ECM 20-22, yerel olarak bozulmasına neden olduğu mezenkimal geçiş (EMT) epitel geçmesi ve matris metaloproteazların (MMPler) ekspresyonunu artırabilir Diğer yakın tümör hücreleri. Biyokimyasal süreçlerin çeşitli aracılığıyla, kanser hücreleri sürekli olarak farklı zamanlarda farklı süreçleri uygun yukarı ve aşağı çevrelerinin yerel sertliğini çevirin. Burada açıklanan metodoloji 3D tümör modelleri ile entegre ve kültürünü sonlandırma olmadan biyokimyasal ve fenotipik değişiklikler ile uzunlamasına deneþtirilebilir büyümesi sırasında sertlik ve ECM uygun olarak yerel değişiklikleri, rapor analitik araçlar için ihtiyaç tarafından motive edilir. Bu bağlamda uygulamak için uygun bir teknik arayışı içinde, partikül izleme microrheology (PTM) güçlü bir aday olarak ortaya çıkmaktadır.Bu yöntem, Mason ve Weitz 23,24 ile başlangıçta öncülüğünü, mikron uzunluk ölçeklerinde frekans-bağımlı karmaşık viskoelastik kesme modülü, G * (ω) bildirmek için karmaşık bir sıvı içinde gömülü izleyici sondaları hareketini kullanır. Bu genel yaklaşım, yumuşak yoğunlaştırılmış madde, kolloidler, biyofizik ve polimer fizik 25-31 farklı uygulamalar için uygun çok sayıda varyasyonları ile geliştirilmiştir. Yerel viskoelastisite okumalar kültür hazırlama sırasında dahil büyüme ve uzun süreler boyunca yerinde kalması olan biyokimyasal olarak aktif olmayan tracer sondaların tahribatsız bir video görüntüleme ile sağlanan bu yana PTM, diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Bu, zorunlu olarak kültür sonlandırma gerektirir ve kompleks 3 boyutlu tümör microenvir içinde noktası ölçümleri yerine, numunenin kütle makroskopik reolojiye bildiren bir osilatör kesme yığın reometre, altın standart ölçümlere aksine bironment. Gerçekten de bir takım çalışmalar hücre göçü 32, genişleyen bir sferoit 33, hücre içi Reolojinin 34,35 tarafından oluşturulan mekanik stres ile ilişkili deformasyonlar ölçmek için veya kanser ya da kanser olmayan hücrelerin etrafında izleyici sonda hareketlerinin ölçümleri yorumlama programı resimli, ve var mekanik gerilmeler ve suşları mühendislik dokularının 36, ve gözenek boyutu ve işgali hızı 37 arasındaki ilişkiyi haritasına. Böyle atomik kuvvet mikroskobu (AFM) olarak microrheology uygun diğer teknikler, uygulanabilir, ama öncelikle de numune yüzeyinde puan sondalama ve için uzunlamasına ölçümler 38 zorlaştırıyor kültür kısırlık sorunları oluşturabilecek. Burada, biz güvenilir mekansal haritalama video partikül izleme ve analiz yöntemleri için gömülü floresan problar ile ECM içine transferi için uygun 3D tümör sferoidlerin büyümesi için yöntemleri içeren kapsamlı bir protokol açıklarkültür içinde zamanla microrheology olarak değişir. Mevcut uygulamada, 3D tümör modelleri bu biçim için elverişli diğer geleneksel deneyler (örneğin, sitotoksisite) ile microrheology ölçümleri dahil sağlayacak bir şekilde çok-yuvalı formatta büyütülür. PANC-1 hücreleri kullanılarak bu yöntem biz kültür in vitro 3D küremsi Bu temsili örnek olarak, sferoidler 39, ancak bu tarifnamede tarif edilen bütün ölçümler oluşturmak için bilinen bir kurulan pankreas kanseri hücre soyu hücre çizgileri, çeşitli kullanılarak katı tümörlerin incelemek için geniş çapta uygulanabilir olduğunu 3D kültür için uygundur. Bu yöntem, doğal görüntüleme bazlı olduğundan bu ideal hücre büyümesi, göç ve fenotip değişiklikleri bildirmek büyük görüş iletilen ışık alanları ile yüksek çözünürlüklü microrheology veri co-kayıt için uygundur. PTM uygulanması mikroskop sahne WH tekrarlanabilir konumlandırma varsayar bu şekilde iletilen ışık mikroskobu ile entegreich motorlu ticari widefield epifluorışıma biyolojik mikroskopları üzerinde genellikle mevcuttur. Aşağıda geliştirilen protokol herhangi bir makul donanımlı otomatik floresan biyolojik mikroskop ile uygulanabilir. Bu çevrimdışı işleme için dijital video mikroskopi gigabayt veri edinimini gerektiren bir doğal veri-yoğun bir yöntemdir. Aşağıdaki protokolde, Protokol 1 agaroz üzerinde kalıbı kullanılarak burada tarif edilmiştir, fakat bu asılı damla 40 ya da 41 döner kültür teknikleri gibi çeşitli yöntemler ile ikame edilmiş olabilir, tümör küremsiler başlangıç ​​hazırlanması ile ilgilidir. Protokol 2 alternatif olarak, in vitro 3B tümörler, kapsülleme ya da yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler ECM 12,15 gömülmesi de, yerine tek bir önceden oluşturulmuş yapışmayan sferoitler tarafından yetiştirilen edilebilir olsa da, bir kollajen iskele sferoidler gömme işlemi tarif eder. Müteakip protokoller o prosedürleri tarifsırasıyla, Video mikroskopi veri edinme ve işleyerek zaman çözüme microrheology ölçümleri btaining. Veri işleme (bkz. http://www.physics.emory.edu/, MATLAB kullanarak orjinal da yoğun farklı yazılım platformları için geliştirilmiş olan Crocker ve Grier 42, tarafından açıklanan algoritmalar üzerine inşa PTM&#39;sinden açık kaynak rutinleri yararlanarak tarif edilir ~ hafta / Idl /).

<table><tbody><tr><td>Sığır tip 1 kollajen</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>Amerikan Tipi Hücre Kültürü, Manassas, VA</td><td>CRL1469</td><td>veya diğer uygun hücre tipi</td></tr><tr><td>Floresan Mikroküreler</td><td>Yaşam Teknolojileri, Carlsbad, CA</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biyobilimleri, Bedford, MA</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Balıkçısı Biyoreaktifler, Waltham, MA</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Biyoreaktifleri, Waltham, MA</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Görüntüleme plakaları</td><td>Corning Inc., Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone, Waltham, MA</td><td>SH30243.01</td><td>veya uygun hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObsever Mikroskop</td><td>Zeiss, Oberkochen, Almanya</td><td></td><td>yüksek hızlı kamera içerir ve görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>MATLAB yazılımı</td><td>The Mathworks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

partikül izleme microrheology kullanarak 3d tümör modelleri ekstrasellüler matriks rijitliğinin boyuna Ölçümü

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Mekanik mikro çevre kendisi yenilenmiş ve karmaşık, iki yönlü mechanosensitive etkileşimlerinin bir kümesinin bir parçası olarak modifiye edilir tümör büyümesi davranış ve sinyallemenin önemli bir düzenleyicisi olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Biyolojik ilgili 3D tümör modellerinin geliştirilmesi, tümör büyümesi üzerindeki matris reolojinin etkisi üzerinde mekanik çalışmalar kolaylaştırmış olsa da, tümörlerin yol açtığı mekanik çevre haritalama değişikliklerin ters problem zorlu kalır. Burada, uzunlamasına yerinde, tümör mikro-fiziksel değişiklikleri izlemek için, sağlam ve uygun bir yaklaşım bir parçası olarak pankreas kanseri 3D modelleri ile bağlantılı olarak parçacık izleme microrheology (PTM) &#39;nin uygulanmasını tarif etmektedir. Burada tarif edilen metodoloji ile, floresanla işaretlenmiş problar muntazam po için dağıtılmış bir model hücre dışı matrisin tip I kollajenin (ECM) iskele gömülü in vitro 3D modeller hazırlamak için bir sistem entegrenoktası pozisyonu ve numune boyunca zamana bağlı microrheology ölçümleri. In vitro tümörler kaplama ve çok-yuvalı plakalar kullanılarak görüntüleme paralel koşullarda sondalandı. Kurulan yöntemleri Çizim, izleyici sonda hareketlerin videoları karmaşık frekans-bağımlı viskoelastik kesme modülü, G * (ω) rapor Genelleştirilmiş Stokes Einstein İlişkisi (GSER) üzerinden dönüşür. Bu yaklaşım, görüntüleme-tabanlı olduğundan, mekanik karakterizasyonu aynı anda 3D tümör boyutu ve fenotip niteliksel değişiklikleri bildirmek için büyük iletilen ışık mekansal alanlar üzerine eşleştirilir. Lokalize işgali kaynaklı matriks bozulması yanı sıra sistem kalibrasyon ile ilişkili alt bölgelerde mekanik tepki zıt gösteren Temsilcisi sonuçları doğrulama verileri sunulmaktadır. Yaygın deneysel hatalar ve bu konularda sorun giderme istenmeyen sonuçları da sunulmuştur. Bu protokol uygulanan 96-kuyu 3D kültür kaplama biçimidir cterapötik tarama deneyleri veya mekanik mikro üzerinde tedaviler veya biyokimyasal uyaranlara etkisini içine yeni anlayışlar kazanmak için moleküler görüntüleme ile microrheology ölçümlerin korelasyon onducive.

G * Karmaşık bir modeli tümör mikro içinde lokalize pozisyonlarda (ω) ölçümleri geçerliliğini doğrulamak için, iki ilk doğrulama deneyleri gerçekleştirilmiştir. Öncelikle, biz toplu osilatör kesme reometri &quot;altın standart&quot; karşı ölçümleri doğrulamak için çalıştı. Bu, 1.0 mg / ml kolajen konsantrasyonunda (hücreler olmadan) Kolajen matrisin aynı numuneler hazırlandı. Bu örnekler (&quot;(bu protokol boyunca aynı parametreler kullanılarak) ve G elde edilen ölçümler &#39;(ω) ve G, bir toplu rheom...

Parçacık izleme microrheology olmayan yıkıcı ölçmek ve 3 boyutlu uzamsal tümör modellerinde hücre dışı matris mekanik özelliklerinde değişiklikler eşlemek için kullanılabilir.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu kanser modellerinde hücre dışı matrisin mekanik özelliklerindeki boylamsal değişimleri ölçmektir. Bu işlem, öncelikle kanser hücrelerinin hasat edilmesi ve tümör steroidinin istenen boyuta ulaşana kadar uygun bir yöntemle büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise tümör steroidinin kolajene veya uygun başka bir hücre dışı matrise gömülmesidir.Ardından, örnekleme noktalarının oluşturduğu ızgara yapılandırılır ve her noktada bir video çekilir. Son adım, video verilerini analiz etmek ve her mekansal noktadaki gerçek lojik özellikleri hesaplayıp birlikte kaydırmaktır. Nihayetinde bu protokol, hücre dışı matris mekaniğindeki mekansal değişiklikleri tahribatsız bir şekilde boylamsal olarak nicelleştirmek için izleyici prob yörüngelerinin analizini kullanır.Buradaki temel fikir; hücre dışı matris radyolojisinin görüntüleme tabanlı ölçümlerini, hücre dışı matris etkileşimlerini yeniden kuran in vitro 3D tümör modelleriyle bir araya getirerek, tümör büyümesi, invazyon süreçleri ve tedaviye yanıta eşlik eden mekanik mikroçevredeki zamana bağlı değişikliklere ilişkin nicel bir içgörü sağlamaktır. Bu videoda gösterilen yöntem, yerleşik pankreas kanseri hücre hattı PAN-1'den yapışkan olmayan 3D organoidler (OID'ler) üretmek için bir Agarose overlay yaklaşımı benimsemektedir. Başlamak için, %1'lik bir Agarose çözeltisi elde etmek amacıyla 10 mL hücre kültürü sınıfı suyu 0,1 g Agarose ile karıştırın.Aros çözeltisini ekleme işleminden önce 70 °C'nin üzerine ısıtın. Çözeltiden 40 µL'yi 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın, plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin, kanser hücrelerini tripsin ile toplayın ve hücre süspansiyonunu mL başına 1000 hücre olacak şekilde seyreltmeden önce tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Bu dilüsyonun 100 µL'sini kürlenmiş aros yatağını içeren kuyucuğa ekleyin.İnkübasyonun ardından numuneyi, 37 °C ve %5 CO2 olarak ayarlanmış bir inkübatördeki çalkalayıcıya yerleştirip gece boyunca bekletin. Numuneyi çalkalayıcıdan çıkarın, 100 µL hücre kültür medyumu ekleyin ve oluşan steroid desired çap değerine ulaşana kadar inkübasyona devam edin. Örneğin, dokuz gün sonra, bir pan, bir steroid yaklaşık 450 µm çapında olacaktır.Başlamak için, laminar akışlı bir kabin içerisinde iki adet iki mililitrelik flakon ile bir çalışma alanı hazırlayın. Birinci flakon tümör steroidini, ikinci flakon ise hücresiz kontrolü içerecektir. İki birim stok probu 25 birim steril suya ekleyerek, karboksilat modifiyeli bir mikron çaplı floresan izleyici problardan oluşan seyreltilmiş bir karışım hazırlayın.Buzdolabından 3,1 mg/mL'lik bir şişe sığır kolajeni çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Birinci viyale 125 µL kolajen, ardından 50 µL seyreltilmiş izleyici prob çözeltisi ekleyin; probların dağılması için kısa süreliğine vorteksleyin. Daha sonra, toplam hacim 410 µL olacak şekilde fenol kırmızısı içeren 235 µL uygun hücre kültürü ortamı ekleyin ve 205 µL'sini alıp ikinci viyale yerleştirmeden önce kısa süreliğine vorteksleyin. Sonrasında, viyale yaklaşık 2 µL 1 M sodyum hidroksit ekleyin.Çözeltiyi tekrar nötr pH'a getirmek için kısa süreliğine vorteksleyin. Ardından, karışımın kürlenmeye başlamaması için hemen buz rafına geri yerleştirin. Tümör steroidini içeren kuyucuktan nazikçe 40 µL besiyeri alın.Bir sonraki adımı gerçekleştirirken bu 40 µL'yi saklayın. Steroidin önceki adımda uzaklaştırılıp uzaklaştırılmadığını anlamak için kuyucuğu kontrol edin. Eğer uzaklaştırılmadıysa, 40 µL'yi tekrar kuyucuğa yerleştirin ve önceki adımı tekrarlayın.Eğer öyleyse, steroid içeren 40 µL'yi tüpe ekleyin. Karışımı bir 96 kuyucuklu plakadaki üç ayrı kuyucuğa 60 µL'lik porsiyonlar halinde aktarmadan önce tüpü nazikçe çalkalayın; steroidin hangi kuyucukta olduğunu belirlemek için karışımı ekledikten sonra her kuyucuğu mikroskopla inceleyin. Ardından, ikinci tüpe yaklaşık 2 µL 1 M sodyum hidroksit ve 40 µL hücre kültürü medyumu ekleyin ve ekleme yapmadan önce vorteksleyin.Bu karışımdan 60 µL'yi 96 kuyucuklu plaktaki boş bir kuyucuğa aktarın ve hücre içermeyen kontrol olarak etiketleyin. Örnek noktalarından oluşan bir ızgara oluşturmak için plakayı en az bir saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde bekletin. İlk olarak, örnek plağını inkübatörden mikroskop tablasına transfer edin.Isıtmalı bir tabla mevcut değilse, numunenin oda sıcaklığına dengelenmesi için 10 dakika bekleyin. Numunenin sağlam olduğundan ve görüntülemeye hazır olduğundan emin olmak için düşük büyütmeli objektif lenslerle gözlemleyin. Tümörün kuyucuk içindeki konumunu belirleyin ve sonraki mekansal ko-kayıt işlemi için bunu bir iletim ışığı görüntüsü ile belgeleyin.Genellikle, her kuyucukta S sferoidinin etrafındaki konsentrik halkalar şeklinde dağıtılmış 20 örnekleme noktası, yeterince ayrıntılı sonuçlar verecektir. Sahneyi istenen her bir konuma getirin ve XNY koordinatlarını kaydetmek için mikroskop arayüz yazılımını kullanın. Mikroskobu yüksek güçlü bir objektife geçirin ve izleyici probların eksitasyon dalga boyu için uygun filtre küpünü seçin.Oluşturulan noktaların listesini kullanarak ızgaradaki ilk noktaya gidin. Yukarı hareket etmeden önce kuyucuğun tabanını bulmak için odağı ayarlayın. Odakta birden fazla izleyici prob içeren bir görüş alanı bulun.Yoğunluk histogramını gözlemleyin ve görüntünün doyuma ulaşmadığından emin olarak mümkün olan en geniş dinamik aralığı sağlayacak şekilde pozlama yoğunluğunu ve süresini ayarlayın. Kare başına 20 ila 30 milisaniye kare hızında bir video dizisi elde edin ve uygun bir adlandırma kuralıyla kaydedin. Kayıt sırasında mikroskoba veya masaya dokunmayın.Kayıt işlemini ızgaradaki her bir örnekleme noktası için tekrarlayın. Ardından, deneydeki her bir kuyucuk için bir ızgara oluşturmak üzere işlemi tekrarlayın ve tüm süreci boylamsal izleme süresindeki her bir zaman noktası için yeniden uygulayın.Veri analizine başlamak için tüm video verilerini bir analiz klasörüne kopyalayın. Görüntü verilerini MATLAB'a veya başka bir analiz yazılımına aktarın.Prob merkez konumlarını belirlemek için seçim ve reddetme parametrelerini uygun şekilde saptamak amacıyla videonun birkaç karesini analiz ederek yazılımı kalibre edin. Ardından, tüm video kareleri için her bir prob konumunu otomatik olarak belirlemek için yazılımı kullanın ve bu konumları yörüngelere bağlayın. Gecikme süresinin bir fonksiyonu olarak ortalama kare yer değiştirmeyi veya MSD'yi hesaplamak için yörünge verilerini kullanın; bu sırada kullanılan objektif lensine veya herhangi bir piksel birleştirmeye (binning) uygun uzaysal kalibrasyon faktörünü uyguladığınızdan emin olun.Belirli bir numune için genelleştirilmiş Stokes Einstein bağıntısının uygulanabilirlik sınırlarını göz önünde bulundurarak G Star değerini genelleştirilmiş Stokes Einstein bağıntısını kullanarak hesaplayın. Analiz adımlarını deneydeki her bir görüş alanı için tekrarlayın. Kullanılan mikroskobun üreticisine bağlı olarak, konum verilerini ilgilenilen belirli bir frekanstaki viskoelastik mod I ile birlikte eş kaydın (coregister) yapın.Bu adım, mikroskop metadata'sını veya konum verilerini okuyan özel bir rutin ile kolaylaştırılabilir veya veriler manuel olarak tablolaştırılabilir. Video dizileri, 3D tümör nodülü içeren temsili bir kuyucuk içindeki birden fazla mekansal konumdan elde edilir ve panın çevresindeki hücre popülasyonları boylamsal olarak izlendiğinde örneğin mekansal bir mikro radyoloji haritasını sağlamak için birbirine bağlanır. Bu örnekte kullanılan bir steroid, çevredeki kollajen liflerini kendiliğinden degrade edecek ve birkaç gün içinde hücre dışı matrise invaze olacaktır.Bu örnekte, mikroskobinin eş-kaydı, steroidin solunda meydana gelen ancak sağında görülmeyen belirgin matriks invazyonunun kantitatif bir okumasını sağlamaktadır. Bu farklı uzamsal bölgelerin boylamsal izlemi, invazyonla eş zamanlı olarak kompleks viskoelastik kayma modülünün reel bileşeninde yaklaşık dört mertebe büyüklüğünde bir düşüş olduğunu göstermektedir. Dördüncü gündeki birinci bölge ve ikinci bölgedeki materyalin reolojik özelliklerini karşılaştıran tam frekans bağımlı veriler gösterilmiştir.Bu prosedür uygulanırken, prob yörüngelerinin analizi sırasında hatalı sonuçlara yol açan yaygın tuzaklardan kaçınmak için dikkatli olunması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Okuyucuları, örnek kayması ve heterojenliğin yorumlanması gibi hususları ele alan, burada atıfta bulunulan PTM literatürüne başvurmaya teşvik ediyoruz. Bu prosedür, mekanik yeniden şekillenmenin temel sinyalizasyon olaylarıyla veya bir müdahaleye verilen sitotoksik yanıtla nasıl ilişkili olduğu gibi diğer soruları yanıtlamak için ek boylamsal veya terminal floresan görüntüleme ile birleştirilebilir.

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Bu protokol, parçacık izleme mikroreolojisi (PTM) kullanarak hücre dışı matris sertliği değişikliklerini izlemek için bir tekniği açıklar. Bu, 3D pankreas tümör sferoidlerinin, video parçacık izleme ve analizi için gömülü floresan problarla ECM'ye kültürlenmesiyle yapılır.

PTM Tabanlı Tümör Mikroçevre İzleme: Tümör Sferoidleri Kullanılarak ECM Rijiditesindeki Değişiklikleri İzlemek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, hücre dışı matris sertliğine bağlı Listeria monocytogenes'in endotel hücreleri yoluyla yayılımını değerlendirmek için kantitatif hızlandırılmış mikroskopi gösterilmektedir. Daha yumuşak bir hidrojel, daha sert muadillerine kıyasla endotel hücreleri yoluyla daha hızlı bakteri yayılımını kolaylaştırır ve matris sertliğinin bakteri yayılımı üzerindeki etkisini vurgular.

Hücre Dışı Matriks Sertliğine Bağlı Bakteri Yayılımını Değerlendirmek için Kantitatif Hızlandırılmış Mikroskopi

Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Tümörün mikro mekanik sertliği invadopodia aktivitesini artırarak ve kasılma actomyosin ile malign davranış sürüş önemli bir rol oynar. Kullanma poliakrilamid jelleri (PAAS) invadopodia ve çekiş kuvveti deneyleri bükülmezlik matris yanıt olarak kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini incelemek için kullanılabilir.

Kanser Hücreleri üzerindeki Invadopodia ve Çekiş Gücü Tahliller için poliakrilamid jeller

Parçacık izleme mikroreolojisi, malzemelerin viskoelastisitesini araştırır. Burada teknik, bir bakteri biyofilminin farklı matris bileşenlerinin viskoelastisite, sürünme uyumu ve etkili çapraz bağlama rollerini belirlemek için kullanılır. Matris, bakteriler tarafından salgılanan polimerik maddelerden oluşur ve bileşenleri biyofilm yapısını ve mekanik özelliklerini belirler.

Parçacık izleme Microrheology tarafından Biyofilmler Mekanik Özelliklerinin Yerinde Haritalama

Burada çapraz ve ileri glikasyon nihai ürünlerin (AGE) tarafından uyarılan bazal membran (BM) artan sertlik patolojik ilgisi biyofiziksel mikro modelleme için bir protokol açıklar.

Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl

Bakteriyel enfeksiyon yapisan hücre hücre dışı matriks sertlik etkisi problama için çok iyi biçim polyacrylamide tabanlı tahlil geliştirdik. Bu tahlil akış sitometresi, immunostaining ve çekiş kuvvet mikroskobu, hücreler, hücre dışı matriks ve patojen bakteriler arasında biyomekanik etkileşimlerin nicel ölçümler için izin ile uyumludur.

Hücre dışı matriks sertlik etkisi yapışık hücreleri bakteriyel enfeksiyon türleri çalışmak için çok iyi Format Polyacrylamide tabanlı tahlil

Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Burada, connexin 43 arasındaki boşluk kavşağını bozacak ve bunun endotel biyomekaniği üzerindeki etkisini çekişler ve hücreler arası gerilimlerin gözlemi yoluyla ölçmek için mekanik tabanlı bir protokol salıyoruz.

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

Öğrenin, partikül izleme mikroroloji kullanarak 3D tümör modellerinde ekstraselüler matriks rijitliğinin boyuna ölçümünü. Bu yıkıcı olmayan yöntem, kanser ilerlemesinin mekanik özelliklerini zamana bağlı olarak nicelendirir.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

Daha fazla video keşfet