Name: Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Öğrenin fare makrofajlarında RNA girişimi ile doğuştan bağışıklık tepkisini incelemeyi. Amaxa Nucleofector sistemi kullanılarak siRNA transfeksiyonu ve sitokin üretimi değerlendirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu el yazmasında açıklanan tekniklerden bazılarını optimize etmedeki yardımı için Brad Lackford'a teşekkürler.

Makrofaj Hücre Hatları 1. Bakım <ol><li> RAW264.7 Büyüme ve DMEM içinde J774A.1 hücre hatları,% 5 CO2 varlığında 37 ° C&#39;de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. , Kısırlık korumaya yardımcı (bu kesinlikle gerekli olmasa da) medyaya% 1 penisilin / streptomisin (pen / strep) ekleyin. </li><li> Kritik adım: makrofajlar verimli nakil ve siRNA kaynaklı gen demonte için sağlıklı bir durumda büyüyen emin olun. Bu makrofaj soylarında altında en iyi transfeksiyon verimi sergiler ve bu aşamada sağlam post-transfeksiyon yaşamının devam taze, çözüldükten sonra geçitler 3 ve 10 arasında hücreleri kullanmak; de büyük ölçüde azalır demonte transfeksiyon verimi ve gen gibi, daha yüksek bir geçiş numarası (&gt; 20) kullanmayın. </li><li> Hücreler, en fazla% 80 kaynaşmaya eriştikten kadar optimize siRNA Transfeksiyon için, levha 20% konfluansta pleytlendi hücreleri ve bir ya da iki gün büyür. Büyümüş hücreleri effic transfekte olmaziently. </li></ol> 2. Transfeksiyon için 96 oyuklu servisi sistem programlama <ol><li> Mekik bağlı bilgisayarda 96-iyi servis yazılımını başlatın. Sol üst dosya menüden yeni bir parametre dosyayı seçin. </li><li> Görüntülenen 96 oyuklu plaka şekil üzerine transfekte edilecek kuyu Vurgu. Yeşil bir kutu seçilir hangi kuyular gösterecektir. </li><li> Diagramed 96-plaka altında bulunan (J774A.1 için RAW264.7 veya DS-130 DS-136) kullanılan ve uygulamak seçeneğini makrofaj hücre hattı, karşılık programı seçin. Bir programı seçtikten sonra, şematik plaka üzerinde kuyu koyu mavi renkli olacaktır unutmayın. Boş çevreler bir program atanmış değil ve şok olmayacaktır kuyu gösterir. </li></ol> 3. Transfeksiyon için, reaktiflerin hazırlanması <ol><li> SF hücre hattı karıştırılarak çalışma Nucleofector ™ çözeltisi hazırlayın 96 oyuklu Nucleofector ™ çözümükapalı ek tüpün tüm içeriği ile. Karışık reaktifler, kullanılmadan önce oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. Ileride kullanmak üzere 3 aya kadar 4 ° C&#39;de aşırı komple Nucleofector ™ çözümü saklayın. </li><li> Ön sıcak transfeksiyonu için makrofajlan hazırlamadan önce 37 ° C&#39;de DMEM, RPMI-1640,% 0.25 tripsin / EDTA, ve fosfat tamponlu tuz (PBS). </li><li> Buz üzerinde eritilmesi ile transfeksiyonu için siRNA hazırlayın. SiRNA donma çözülür sayısını en aza indirmek için, alikotlarda kullanıldıkları ilk kez yeni siRNA&#39;ları dondurmak. </li><li> Başlangıç ​​deneylerinde, (20 uM stoktan 1:10 seyreltilmiş) 2 uM nispeten yüksek bir dozda siRNA kullanın. Tipik olarak daha yüksek dozlar diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında, makrofajlarda etkili gen demonte için gerekli olmasına rağmen sonra, daha düşük dozlar aşağı doğru demonte sağlam genini endüklemese siRNA&#39;lar titre edilir. NOT: siRNA&#39;lar birçok kaynaktan mevcuttur; Oldukça sağlam gen demonte elde edilebilirHer genini hedefleyen dört siRNA&#39;ların havuzları siGenome SMARTPOOLs kullanarak. Bir negatif kontrol olarak, çeşitli non-hedefleme siRNA havuzları veya siRNA&#39;lar herhangi birini kullanabilirsiniz. </li><li> , Transfeksiyon verimini izlemek deney siRNA&#39;lar paralel pmaxGFP kontrol (Amaxa kitlerinde) plazmid veya floresan ile etiketlenmiş siRNA&#39;lar ya da transfekte etmek. GFP plazmidi% 30-50 transfeksiyonu (mikroskopi ile analiz edilir veya transfeksiyondan bir gün sonra akış sitometrisi) ve (transfeksiyon ve geri kazanımdan sonra sitometrisi hemen akış ile tahlil), flüoresan-işaretli siRNA&#39;nın&gt;% 99 transfeksiyon bekliyoruz. </li></ol> 4. Transfeksiyonu için makrofajlan hazırlanması <ol><li> Tripsinizasyon ile hücre kültür tabaklarından yapışkan makrofajlar ayırın. Ortamı aspire ve 10 ml PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. PBS uzaklaştırıldıktan sonra, hücreler ile inkübe hücreleri ayırmak alıncaya kadar 1-2 dakika boyunca% 0.25 tripsin / EDTA (1 mi / 10 cm plaka), önceden ısıtılmış. Yavaşça plaka dokunun ve Solu hareketinkübasyon sırasında siyon tripsinizasyon maksimize etmektir. </li><li> İnkübasyondan sonra, steril bir tüpe pipetleme hücreleri, 9 mi DMEM FBS ortamı ilave yukarı ve aşağı, yavaşça karıştırın ve toplayın. </li><li> Hemasitometre kullanarak izole makrofajlar sayısını. 10 cm plaka başına kabaca 10 milyon makrofajlar bekliyoruz. Gerekli makrofaj sayısı hesaplanır; iyi 96 kuyu mekik her 200.000 hücreleri gerektirir. Pipet kayıplar için izin vermek hücrelerin fazladan birkaç kuyu değerinde eklemeyi unutmayın. </li><li> Bir santrifüj tüpüne hücre hesaplanan sayısı Pipet. Oda sıcaklığında, 150 x g&#39;de 10 dakika boyunca hücreler santrifüjleyin. Bu makrofaj sağlık ve transfeksiyon verimliliği azaltacak gibi çok hızlı santrifüj etmeyin. </li></ol> SiRNA ile Makrofagların 5. Nucleofection <ol><li> (Tepkin madde kaybını minimize ederken karışmasını kolaylaştırır), steril bir 96-gözenekli yuvarlak tabanlı bir plaka kullanarak, her bir oyuğa olduğu transf her siRNA 2 ul ekleandırılmaktadır. Not: siRNA&#39;lar sayısına bağlı olarak, bu makrofaj santrifüj aşaması esnasında gerçekleştirilebilmektedir. </li><li> Santrifüj hücrelerden ortam aspire. Yavaşça peletlendi 200.000 hücre başına 20 ul kullanarak, (ek solüsyon içeren) Nucleofector ™ çözümü SF hücreleri tekrar süspansiyon. Yeniden süspansiyon haline sonra, en iyi transfeksiyon için hemen hücreleri kullanır. </li><li> Steril bir çukur içine süspanse hücreler aktarın; siRNA&#39;lar ihtiva eden 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna transfer yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücre karışımı 20 ul, bir çok kanallı pipet kullanarak. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> Transfer 96 oyuklu Nucleocuvette ™ plaka içine hücre / siRNA karışımı 20 ul Kritik adım.: Bu nucleofection sırasında hataları indükleyebileceği transfer adımı sırasında kabarcıkları sakınmayı. </li><li> Transfeksiyon plakasında Deney örneklerinin her yerleştirildikten sonra, Resim kapak ve ver 96 oyuklu plaka kapağıy yavaşça örneklerinde herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için sert bir yüzeye dokunun. </li><li> Program ekranın sağ alt &#39;upload ve start&#39; 96 kuyu Nucleofector mekik içine kapaklı 96-plaka yerleştirin ve seçin. Nucleofection önce, sonuçları kaydetmek için program istemini izleyin. Not: Nucleofection sürecinde, başarıyla tranfected kuyular bir artı işareti ile yeşil bir daire ile ekranda 96-kuyu şematik tasvir edilecektir. Eksi işaretleri ile kırmızı bir daire kabarcıkların veya mis-pipetlenmesinden reaktiflerin doğru hacmi için, büyük olasılıkla bir hata gösterir. </li></ol> 6. Kurtarma ve Makrofagların Kaplama <ol><li> Hemen nucleofection sonra, çok kanallı bir pipet kullanılarak, her bir oyuğa RMP1-1640 ortamı önceden ısıtılmış (37 ° C) 80 ul ekle. Ortam yavaş yavaş bu aşamada çok hassas olan transfekte edilmiş hücreler ile karışmasına imkân verilmesi, her bir oyuğa tarafına ortam ekleyin. Bu irade gibi, çok hızlı ortam eklemeyinbüyük ölçüde canlılığını azaltır. </li><li> 2 dakika boyunca% 5 CO2 içeren bir 37 ° C inkübatör içine transfekte edilmiş numuneleri ile RPMI-1640 ile 96 oyuklu plakalar yerleştirin; Bu hücrelerin manipülasyonu daha ileri önce kurtarmak için sağlamak açısından önemlidir. </li><li> Inkübatör 96 oyuklu plaka çıkarın ve dikkatli bir şekilde bir çok kanallı pipet kullanılarak 96 oyuklu bir doku kültür plakasının her bir kuyudan karışımı aktarın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, her bir oyuğa önceden ısıtılmış (37 ºC), DEM + FBS orta 100 ul ekleyin. </li><li> 24-36 saat boyunca% 5 CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde örnekleri ile 96 oyuklu doku kültürü plakası (bu zaman aralığı genel olarak iyi çalışmasına rağmen, tek tek siRNA&#39;lar için tam zamanlama optimize) inkübe edin. </li></ol> LPS ile Makrofagların 7. uyarılması <ol><li> 24-36 saat sonra-Nucleofection inkübe edildikten sonra, taze ortam içinde LPS ile (ya da diğer üzerine durmaktadır) maddesinin hazırlanması. Edilen kuyuların tümü için yeterli taze ortam hazırlayın (200 ul m,edia / oyuk, 96 oyuklu plaka artı pipetleme için fazladan). DMEM FBS içinde 20 ng / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar LPS seyreltin. </li><li> 96 gözlü levhadan dikkatlice aspire ortam ve hücreler LPS içeren taze ortam ilave edin. </li><li> Stimülasyon sonrasında çeşitli zamanlarda LPS veya diğer üzerine durmaktadır yanıtı izlemek. 6 saat, IL-6 veya TNFa gibi sitokinler için sağlam bir enflamatuar sitokin tepkisi meydana getirmek için yeterlidir. </li></ol> 8. Makrofagların yılında Başlatılan Doğuştan Bağışıklık Tepkisi, Gen demonte ve canlılık İzleme <ol><li> LPS-kaynaklı sitokin üretimini izlemek için, 96-çukurlu bir depolama plakasına hücrelerden süpernatant pipetle. Sitokin üretimi daha sonra ELISA ile ölçülebilir. </li><li> Süpernatan kaldırıldıktan sonra, floresan diasetat kullanılarak hücre yaşamı sürdürme kabiliyetini izlemek (canlı hücrelerde hücresel esterazlarla ayrılır zaman, bu bileşik, flüoresan hale gelir). T kullanılarak hücre canlılığı kontrol eden genleri hedef siRNA&#39;ları tespitOnun yaklaşımı. Not: düzgün yapıldığı takdirde transfeksiyon sürecinin kendisi canlılığı üzerinde çok az etkiye sahip olması gerekmektedir. <ol><li> (: 100, PBS içinde nihai sulandırma 1), her bir sıra için floresan diasetat (aseton içinde 5 mg / ml stok) ilave et. </li><li> Beş dakika için bir oda sıcaklığında inkübe edin ve bir plaka okuyucusu (460 nm eksitasyon, 515 nm emisyon) kullanılarak hücrelerdeki floresan izler. </li><li> İsteğe bağlı: kuyularda floresan homojen olduğundan emin olmak üzere, bu gibi RIPA gibi tamponlar kullanılarak lize hücreleri; Bazı levha okuyucular de sadece küçük bir bölümünü izlemek için yapılandırılmış olan bu, kuyunun içinde üniform floresan sinyali sağlar; hücreler eşit kaplama değilse, floresandiasetat bir yanlış okuma verebilir. </li></ol></li><li> Hücre canlılığı izlenmesi için bir alternatif olarak, yapışan hücrelerden türetilen RNA kullanılarak qPCR demonte siRNA teşvik etmiş geni izler. <ol><li> Süpernatanı, hücrelerden çıkarılır sonra reklam (yukarıda 8.1 adım a)bunları eritmek doğrudan yapışık hücrelere (liziz ve RNA korunması için kullanılır) D RLT tamponu. </li><li> Örneğin, RNeasy Mini kit gibi bir RNA hazırlama kiti kullanılarak RNA izole edilir ve gen siRNA tedavi kontrolü için demonte göreceli izlemek için gen spesifik primerler ile qPCR kullanın. Normalleşmesi için Βactin için astar veya GAPDH kullanın. </li></ol></li><li> Başka bir alternatif ise, doğal immun cevabın başka yönlerini izlemek için de, sonra ya FITC-etiketli E. ekleyerek makrofagların fagositik yeteneği izlemek doğrudan bir kit kullanılarak yapışık hücreler üzerine E. coli parçacıklar. Sadece birkaç saat sürer üreticinin protokolünü takiben, bir plaka okuyucu veya mikroskopi kullanılarak fagositik alımını izlemek. </li></ol>

<ol><li>Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufmann%2C+SHE+%22The+innate+immune+response+to+infection%22">The innate immune response to infection</a>. , ASM Press. (2004).</li>
<li>Adams, D. O., Hamilton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of macrophage activation.</a> Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).</li>
<li>Fujiwara, N., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammation.+Current+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+allergy%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammation. Current drug targets.</a> Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Martinez, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+mechanism+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: mechanism and functions.</a> Immunity. 32, 593-604 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+an+immunologic+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective.</a> Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).</li>
<li>Fairweather, D., Cihakova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophages+in+infection+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity.</a> Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23, 344-346 (2005).</li>
<li>Burke, B., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+B+%22The+macrophage%22">The macrophage</a>. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+methodologies+for+the+functional+study+of+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages%3A+a+case+study+for+optimization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).</li>
<li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+innate+immunity+genes+and+pathways+using+a+comparative+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach.</a> ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).</li>
<li>De Arras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+innate+immunity+protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bio.+Chem%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network.</a> J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+the+systemic+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+innate+immune+genes+by+transcriptional+profiling+of+macrophages+stimulated+with+TLR+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands.</a> Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+that+mediate+innate+immunity+using+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice.</a> Genetics. 183, 1535-1544 (2009).</li>
<li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li>
<li>Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme+synthesis+by+established+human+and+murine+histiocytic+lymphoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines.</a> The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).</li>
<li>Zumbansen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+siRNA+library+screening+in+hard-to-transfect+HUVEC+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+RNAi+and+gene+silencing%22%5BJournal%5D)">First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells.</a> Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li>
<li>Aliprantis, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+activation+and+apoptosis+by+bacterial+lipoproteins+through+toll-like+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2.</a> Science. 285, 736-739 (1999).</li>
<li>Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+double-stranded+RNA+and+activation+of+NF-kappaB+by+Toll-like+receptor+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.</a> Nature. 413, 732(2001).</li>
<li>Conforti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+toll-like+receptor+%28TLR3%29+signaling+in+tumors+can+be+therapeutically+uncoupled+to+optimize+the+anticancer+efficacy+of+TLR3+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands.</a> Cancer Res. 70, 490-500 (2010).</li>
<li>Fernandez-Botran, R., Větvička, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFernandez-Botran%2C+R+%22Methods+in+Cellular+Immunology%22">Methods in Cellular Immunology</a>. 8, CRC Press. 8(2001).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim. Bu makale Lonza&#39;nın, Inc. tarafından sponsor oldu

Çok sayıda çalışma, burada tek tek genler sıçangil makrofaj siRNA tarafından hedef alınmıştır yayınlanmıştır. Lipit aracılı transfeksiyon bireysel olarak makrofaj hücre hatlarına siRNA teslim etmek için kullanılmış olsa da, bu yöntemler, bir genden genine canlılığı, sınırlı gen demonte ve değişkenlik olası etkileri muzdarip. Orta veya yüksek verimli bir şekilde genlerin hedeflenmesi için kullanılabilecek daha sert tahlilleri geliştirmek için, gen demonte içinde daha fazla kıvam ve yaşamlarını sürdürmeleri üzerindeki etk...

Bu protokol, biz siRNA&#39;ları kullanarak fare makrofaj hücre hatlarında genleri inhibe ve doğal immün yanıt üzerindeki bu tedavilerin etkilerinin izlenmesi için etkin yöntemler açıklanmaktadır. Bu prosedürler, orta ya da yüksek verimli bir şekilde RNAi ekranlar için izin veren, 96-kuyu formatında gerçekleştirildi. Enfeksiyona yanıt olarak, insanlar hemen doğuştan gelen bağışıklık tepkisini daha yavaş olan ancak daha özel bir uyum sağlayıcı bağışıklık tepkisi. Bu hızlı doğal immün yanıt makrofajlar 1 olmak üzere fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri toplanmasını ve aktivasyonunu içerir. Klasik olarak aktif makrofajlar, akut enflamatuar yanıtlarda rol oynayan ve antimikrobiyal proteinlerin ve bileşiklerin, sitokinler ve kemokinleri ve antijenlerini 2,3 üretirler. Alternatif aktive makrofajlar hoşgörüyü, doku onarımı bakımı, bağışıklık düzenlenmesinde rol oynar ve 4-8 yara iyileşmesi. Çünkü işlevleri onların geniş dizi, Makrofajlar ateroskleroz, arterit, kanser ve 9 da dahil olmak üzere pek çok hastalıkta önemli bir rol oynayabilir. Bu nedenle, makrofajların çalışma hastalık alanları arasında bir yelpazede bir süre için bir araştırma anahtar alanı olmuştur. Doğuştan gelen bağışıklık tepki olarak önemine rağmen, makrofajlar ile çalışmak için hücreler zor olabilir. Özellikle, toksisitesi, 10,11 makrofajların lipid reaktifler kullanılarak verimli transfeksiyona elde etmek zordur. Ayrıca, siRNA verimli makrofajlar teslim olduğunda bile, genellikle demonte RNAi neden geninin sağlamlığı oldukça ılımlı olabilir ve gen için gen arasında değişebilir. Bu teknik zorlukları aşmak için, iki fare makrofaj hücre hatları, RAW264.7 17 ve J774A.1 18 transfeksiyonuna ve demonte teknikleri 12-16 optimize ettik. Bu yaklaşım, transfeksiyon için Amaxa Nucleofector 96 oyuklu Servisi Sistemi kullanır; bu sistemin96-çukurlu formatta 19 hücreleri transfekte etmek için özel reaktifler ve elektroporasyon bir kombinasyonunu kullanır. Transfeksiyondan ardından, yöntem hücresi geri kazanımı ve canlılığı maksimize etmek ve daha sonra, siRNA ile uyarılan gen demonte üst düzeye çıkarmak için tarif etmektedir. Bu yaklaşımın faydasını göstermek için, lipopolisakkarit (LPS) ile bu hücreleri uyarır ve çeşitli pro-enflamatuar sitokinlerin üretim düzeyinde doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin izlenmesi, aşağıdaki makrofaj hücre hatlarına siRNA taşınması için bir protokol açıklar. Biz üyeleri LPS ve diğer patojen ilişkili moleküler şekilleri (üzerine durmaktadır) duygusu, doğuştan gelen bağışıklık düzenleyen Toll-benzeri reseptör (TLR) ailesi, hangi hedef örnek veri sağlar.

<table><tbody><tr><td>Amaxa nükleofektör 96 oyuklu mekik sistemi</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa SF hücre hattı 96 kuyulu nükleofektör kiti</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 fare makrofaj hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 fare makrofaj hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>bağlı olarak değişir gen</td><td></td>üzerinde</tr><tr><td>Hedeflemeyen kontrol siRNA havuzu</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon için Block-iT floresan oligo</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111:B4 LPS</td><td>Listesi Biyolojik Laboratuvarlar</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin çözeltisi (Pen/Strep)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu yuvarlak tabanlı steril plakalar (kaplanmamış)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Fare IL-6 Duoset ELISA kiti</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Fare TNF ve alfa; Duoset ELISA kiti</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Floresein diasetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>RLT tamponu</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kiti</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant Fagositoz Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

fare makrofagların yılında doğuştan bağışıklık tepkisi soruşturma rna girişimi kullanma

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Makrofajlar anahtar fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir. Makrofajlar bir patojenle karşılaştıklarında, patojeni öldürmek için antimikrobiyal proteinler ve bileşikler üretirler, diğer bağışıklık hücrelerini işe almak ve uyarmak için çeşitli sitokinler ve kemokinler üretirler ve adaptif bağışıklık tepkisini uyarmak için antijenler sunarlar. Bu nedenle, RNA-interferans (RNAi) gibi tekniklerle makrofajları verimli bir şekilde manipüle edebilmek, bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücresini araştırma yeteneğimiz için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, makrofajların transfekte edilmesi teknik olarak zor olabilir ve verimsiz RNAi kaynaklı gen yıkımı sergileyebilir. Bu protokolde, Amaxa Nükleofektör 96 oyuklu Mekik Sistemini kullanarak iki fare makrofaj hücre hattını (RAW264.7 ve J774A.1) siRNA ile verimli bir şekilde transfekte etmek için yöntemleri açıklıyoruz ve siRNA'nın gen yıkımı üzerindeki etkisini en üst düzeye çıkarmak için prosedürleri açıklıyoruz. Ayrıca, açıklanan yöntemler 96 kuyulu formatta çalışacak şekilde uyarlanarak orta ve yüksek verimli çalışmalara olanak tanır. Bu yaklaşımın faydasını göstermek için, lipopolisakkarit (LPS) ile indüklenen sitokin üretimini düzenleyen genleri inhibe etmek için RNAi'yi kullanan deneyleri açıklıyoruz.

Bu yaklaşımı kullanarak transfeksiyon etkinliğini göstermek için, bir akış sitometresi (Şekil 1) kullanılarak, FITC-işaretli siRNA&#39;nın alımını izlenir. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı izlemek için bir yaklaşım kullanışlılığını tasvir etmek için, biz, RAW264.7 makrofaj hücre hattı bilinen doğuştan gelen bağışıklık düzenleyici genler hedef siRNA&#39;lar transfekte LPS ile stimüle edilen hücreler, daha sonra pro-enflamatuar sitokinlerin üretimini takip IL 6 ve TNFa. TLR3 <...

Bu protokolde, Amaxa Nucleofector 96 kuyulu Mekik Sistemini kullanarak murin makrofaj hücre hatlarını siRNA'larla verimli bir şekilde transfekte etmek, makrofajları lipopolisakkarit ile uyarmak ve inflamatuar sitokin üretimi üzerindeki etkileri izlemek için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Bu prosedürün genel amacı, aday genlerin doğuştan gelen bağışıklık yanıtı üzerindeki etkisini araştırmak için RNA interferansını kullanmaktır. Fare makrofajlarında bunu gerçekleştirmek için, fare makrofaj hücre hatları tripsinize edilir ve transfeksiyon solüsyonu ile ilgili siRNA'lar ile birleştirilir; ardından karışım 96 kuyucuklu bir NucleoVETTE plakasına aktarılır ve siRNA'ların makrofajlara transfekte edilmesi için Maxa 96 Well transfeksiyon sistemi kullanılır. Hücre kültür ortamında inkübasyonun ardından, transfekte edilmiş makrofajları stimüle etmek için LPS veya diğer doğuştan gelen bağışıklık aktivatörleri uygulanır. Son olarak, sitokin üretimini izlemek ve siRNA işleminin doğuştan gelen bağışıklık yanıtı üzerindeki etkisini değerlendirmek için ELISA testleri gerçekleştirilir.Bu tekniğin lipid aracılı transfeksiyona göre temel avantajı, analizimizin sağlam olması ve yüksek kapasiteli bir şekilde birçok gene uygulanabilmesidir. Bu yöntemin püf noktası, sağlıklı hücrelerle çalışmak, onlara nazik davranmak ve transfeksiyon işlemi sırasında verimli çalışmaktır. Göstereceğimiz üzere, bu protokol, ekteki belgede açıklandığı şekilde kültüre edilen RAW 264.7 fare makrofaj hücre hat

using-rna-interference-to-investigate-innate-immune-response-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, makrofajlardaki transkripsiyon faktörleri nükleer faktör-kappa-B (NF-κB) ve aktivatör protein-1'in (AP-1) toll benzeri reseptöre (TLR) bağlı aktivitesini incelemek için bir testi göstermektedir. TLR'ler, NF-κB ve AP-1'i aktive ederek, hasarla ilişkili moleküler modelleri (DAMP'ler) tanıdıktan sonra bir pro-inflamatuar sinyal kaskadını tetikler. Tasarlanmış raportör makrofajlar, NF-κB ve AP-1 aktivasyonu üzerine salgılanan embriyonik alkalin fosfataz (SEAP) enzimi üretir ve bu...

Makrofajlarda TLR'ye Bağımlı NF-&kcy;B/AP-1 Transkripsiyon Faktörü Sinyalizasyonu için Bir Test

Bu video, Toll benzeri reseptör (TLR) sinyalini inhibe eden potansiyel biyoaktif nanopartikülleri taramak için bir raportör hücre tabanlı testi göstermektedir. Test, raportör proteinleri - salgılanan embriyonik alkalin fosfataz (SEAP) ve lusiferaz - eksprese eden raportör makrofajlara peptit-altın nanopartikül hibritleri ile karıştırılmış lipopolisakkaritlerin (LPS) eklenmesini içerir. Hibritlerin aracılık ettiği LPS kaynaklı TLR sinyalinin azalması, raportör sinyallerinin ölçülmesiyle...

Toll Benzeri Reseptör Sinyal İnhibisyonu için Biyoaktif Nanopartikülleri Taramak İçin Bir Test

İnsan Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) ve Epstein-Barr virüsü (EBV) ile yakından ilgili olan bir model herpesvirüs, kemirgen gamma herpes virüsü 68 (γ HV68) ile enfekte olan fareler içindeki antiviral sitokin üretimini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Genetik olarak modifiye edilmiş olan fare soyları ve fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) kullanarak, biz antiviral sitokin üretimini in vivo ve ex vivo hem de değerlendirildi. Lentiviral transdüksiyonu ile nakavt embriyonik...

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

Burada murin peritoneal makrofajları izole etmek için basit bir protokolü açıklıyoruz. Bu prosedürü, Toll benzeri reseptörlerin uyarılması üzerine gen ekspresyon analizi yapmak için RNA ekstraksiyonu takip eder.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Biz polyethyleneimine (PEI) kullanarak bir yöntemi açıklamak-kaplı superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri siRNA ile transfecting makrofajlar için. Bu nano tanecikleri siRNA makrofajlar vitro ve in vivo ve sessizlik hedef gen ekspresyonu için verimli bir şekilde teslim edebilirsiniz.

Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak Vitro ve In Vivo

Makrofajlar, özellikle birincil makrofajlar, kendi kendine kökenli olmayan molekülleri tespit etmede uzmanlaşdıkları için transfect yapmak zordur. Plazmidler gibi DNA şablonlarından oluşturulan mRNA ile birincil makrofajların yüksek verimli transfeksiyonuna olanak tanıyan bir protokolü tanımlıyoruz.

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Bir kemokinin in vivo makrofaj alımı üzerindeki etkisini test etmek için, yerinde hibridizasyondaki tüm montaj, kemokinin ektopik ekspresyonunu saptamak için kullanıldı ve makrofajları etiketlemek için immünboyama kullanıldı. Makrofaj göçünün gerçek zamanlı gözlemi için canlı görüntüleme kullanıldı.

Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Bu protokol, araştırmacılara, biyomateryal implant mikroçevresini modelleyen çeşitli polimerik yüzeylere ve adsordi protein katmanlarına yanıt olarak bir murine makrofaj hücre hattında TLR bağımlı NF-кB/AP-1 transkripsiyon faktörü aktivitesini ölçmenin hızlı ve dolaylı bir yöntemini sağlar.

Polimerik Yüzeylerde Adsorbe Protein Katmanlarında Sinyalizasyonu NF-kB/AP-1 Sinyallerini İnceleyecek Bir Makrofaj Muhabiri Hücre Tetkik

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Öğrenin fare makrofajlarında RNA girişimi ile doğuştan bağışıklık tepkisini incelemeyi. Amaxa Nucleofector sistemi kullanılarak siRNA transfeksiyonu ve sitokin üretimi değerlendirilir.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Daha fazla video keşfet