Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Bu prosedürün genel amacı, aday genlerin doğuştan gelen bağışıklık tepkisi üzerindeki etkisini araştırmak için RNA girişimini kullanmaktır. Bunu yapmak için fare makrofajlarında, fare makrofaj hücre hatları tripslerle innize edilir ve transfeksiyon çözeltisi ve ilgilenilen SI RNA'ları ile birleştirilir, karışım daha sonra 96 kuyulu bir nükleo VETE plakasına aktarılır ve siRNA'yı makrofajlara transfekte etmek için bir Maxa 96 Well transfeksiyon sistemi kullanılır ve hücre kültürü ile bir inkübasyondan sonra, Orta, LPS veya doğuştan gelen bağışıklığın diğer aktivatörleri, onları uyarmak için transfekte edilmiş makrofajlara uygulanır. Son olarak, Eliza'lar daha sonra sitokin üretimini izlemek ve siRNA tedavisinin doğuştan gelen bağışıklık tepkisi üzerindeki etkisini değerlendirmek için gerçekleştirilir.

Bu tekniğin lipid aracılı transfeksiyona göre en büyük avantajı, tahlilimizin sağlam olması ve yüksek verimli mesleklerde birçok gene uygulanabilmesidir. Bu yöntemin anahtarı, sağlıklı hücrelerle çalışmak, onları nazikçe tedavi etmek ve transfeksiyon işlemi sırasında verimli bir şekilde çalışmaktır. Göstereceğimiz gibi, Bu protokol, ekteki belgede açıklandığı gibi kültürlenen ham 2 64 0.7 fare makrofaj hücre hattını kullanır.

INA transfeksiyon plakasına hazırlanırken,% 20 oranında hücreler akıcılığa sahiptir ve hücreler% 80'den fazla birleşmeyene kadar bir veya iki gün büyür. Üç ve 10. pasajlar arasındaki hücreleri kullanmayı unutmamak önemlidir. Çözüldükten sonra, transfeksiyon için kullanılacak 96 kuyulu mekik sistemini programlayarak bu işleme başlayın.

Bunun için sol üst kısımdaki dosya menüsünden mekiğe bağlı bilgisayarda 96 kuyulu mekik yazılımını başlatın. Yeni parametre dosyasını seçin. Görüntülenen 96 kuyulu plaka şemasında transfekte edilecek kuyuları vurgulayın.

Yeşil bir kutu seçilen kuyuları gösterecektir. Ham 2 64 0.7 hücre için kullanılan makrofaj hücre hattına karşılık gelen programı seçin. DS 1 36'yı seçin, uygula'yı seçin.

Bir program seçtikten sonra, şematik plaka üzerindeki kuyucukların renklendirileceğini unutmayın. Koyu mavi boş daireler, bir program atanmamış ve şok edilmeyecek kuyuları gösterir. Daha sonra, SF hücre hattı 96 kuyulu nükleo efektör solüsyonunu birlikte verilen ek tüpün tüm içeriği ile karıştırarak çalışan nükleo efektör solüsyonunu hazırlayın.

Karışık reaktiflerin oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin. D-M-E-M-R-P-M-I 1640 %0.25 tripsin EDTA ve PBS'yi 37 santigrat derecede ısıtın. Deneysel S-I-R-N-A-P max GFP kontrol plazmidini veya floresan etiketli siRNA'ları, hücre kültürü kaplarından yapışık makrofajları ayırmak için buz üzerinde çözdürerek hazırlayın.

Ortamı aspire edin ve hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra PBS'yi çıkardıktan sonra, hücreler ayrılmaya başlayana kadar hücreleri plaka başına bir mililitre önceden uyarılmış% 0.25 tripsin EDTA ile inkübe edin. Bu bir ila iki dakika sürer.

Tripsin izasyonunu en üst düzeye çıkarmak için plakaya hafifçe vurun ve inkübasyon sırasında çözeltiyi hareket ettirin. Hücreler ayrıldıktan sonra, yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe dokuz mililitre DMEM artı FBS karışımı ekleyin ve ardından hücreleri steril bir tüpe pipetleyerek toplayın. Bir Hema Sitometre kullanarak izole edilen makrofajların sayısını sayın.

10 santimetrelik plaka başına yaklaşık 10 milyon makrofaj bekleyin. 96 kuyulu mekikte her bir kuyuda ihtiyaç duyulan toplam makrofaj sayısını hesaplayın, 200.000 hücre gerektirir. Hesaplanan hücre sayısını bir santrifüj tüpüne pipetleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında 150 G'de 10 dakika boyunca steril 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakaya döndürün, bu da reaktif kaybını en aza indirirken karıştırmayı kolaylaştırır. Transfekte edilecek her bir oyuğa her bir IRNA'dan iki mikrolitre ekleyin. siRNA'ların sayısına bağlı olarak, bunun makrofaj santrifüjleme adımı sırasında gerçekleştirilebileceğini unutmayın.

Bu prosedürün en zor yönü, hücreleri çok nazikçe tedavi eden ve çok hızlı çalışan anahtarlar olan elektroporasyondur. Hücreler toksik bir transfeksiyon çözeltisine girdikten sonra, ortamı santrifüj hücrelerinden aspire edin, ardından bunları nükleo efektör çözeltisinde nazikçe yeniden süspanse edin. Ek çözeltiyi içeren SF.

Hücreleri hemen çok kanallı bir pipet kullanarak steril bir oluğa aktarın: 20 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre karışımını, yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırılmış siRNA'ları içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna aktarın. Daha sonra, 20 mikrolitre hücre INA karışımını 96 kuyulu nucleo vete plakasına aktarın. Bu adım sırasında kabarcık oluşturmaktan kaçınmak çok önemlidir, çünkü bu, çekirdek sevgisi sırasında hatalara neden olabilir.

Tüm deney örneklerini transfeksiyon plakasına yerleştirdikten sonra, verilen kapakla örtün ve sert bir yüzeye çok nazikçe vurun. Baloncukları çıkarmak için 96 kuyulu plakayı 96 kuyulu çekirdek efektör mekiğine yerleştirin ve program ekranının sağ alt kısmında yükle ve başlat'ı seçin. Ardından, nükleo sevgi süreci kuyuları sırasında sonuçları başarılı bir şekilde kaydetmek için program istemini izleyin.

Transfekte, ekrandaki 96 kuyu şemasında artı işaretli yeşil bir daire ile gösterilecektir. Eksi işaretli kırmızı bir daire, büyük olasılıkla kabarcıklardan veya nükleo sevgisinden hemen sonra yanlış hacimde reaktiflerin pipetlenmesinden kaynaklanan bir hatayı gösterir. 80 mikrolitre ön ısıtma RPMI 1640 eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.

Her birinin yanına orta. Ortamın, bu aşamada çok hassas olan transfekte edilmiş hücrelerle yavaşça karışmasına izin verin. Ortamı çok hızlı eklemek, canlılığı büyük ölçüde azaltacaktır.

Transfekte edilmiş numuneler ve RPMI 1640 içeren 96 oyuklu plakayı, iki veya daha fazla dakika boyunca% 5 CO2 içeren 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Daha fazla manipülasyondan önce hücrelerin iyileşmesine izin vermek çok önemlidir. Plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra, karışımı her bir oyuktan 96 oyuklu bir doku kültürü plakasına dikkatlice aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.

Daha sonra, çok kanallı pipeti kullanarak, her birine FBS ile 100 mikrolitre DMEM ekleyin. Transfeksiyon ve iyileşmeden hemen sonra 24 ila 36 saat boyunca inkübe edin, akış sitometrisi yapın. Floresan etiketli SI irna'nın transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için, hücrelerin% 99'undan fazlası, transfeksiyon testinden bir gün sonra transfekte edilmelidir GFP plazmidinin transfeksiyon verimliliği için, hücrelerin% 30 ila 50'si GFP'yi ifade etmelidir 24 ila 36 saatlik inkübasyonun ardından, taze ortamda LPS veya doğuştan gelen bağışıklığın diğer aktivatörlerini hazırlayın, LPS'yi FBS ile DMEM'de mililitre başına 20 nanogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin.

Daha sonra ortamı 96 oyuklu plakadan dikkatlice aspire edin ve LPS'yi içeren taze ortamı hücrelere ekleyin. Stimülasyondan sonra çeşitli zamanlarda LPS'ye veya doğuştan gelen bağışıklığın diğer uyarıcılarına yanıtı izlemek için plakayı bir inkübatöre yerleştirin. Süpernatanı hücrelerden Eliza tarafından analiz edilmek üzere 96 kuyulu bir saklama plakasına pipetleyin.

Hücre canlılığını izlemek için süpernatanı çıkardıktan sonra, her bir kuyucuğa bir ila beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek için PBS'de 100 mikrolitre bir ila 100 floresein di asetat ekleyin. Canlı hücrelerde hücresel esterazlar tarafından bölündüğünde bir plaka okuyucu kullanarak hücrelerdeki floresansı izleyin. Bu bileşik, doğuştan gelen bağışıklık tepkisini izlemek için bu yaklaşımın faydasını göstermek için floresan hale gelir.

Bilinen doğuştan gelen bağışıklık düzenleyici genleri hedef alan siRNA'lar, ham 2 64 0.7 makrofaj hücre hattına transfekte edildi. Hücreler daha sonra LPS ve proinflamatuar sitokinlerin üretimi ile uyarıldı. IL altı ve TNF alfa, burada gösterildiği gibi Eliza tarafından izlendi.

Toll benzeri reseptör dördüncüün, LPS reseptörünün inhibisyonu, ancak diğer TLR'lerin inhibisyonu. SIR kullanılarak, LPS'nin güçlü bir şekilde azalmış üretimi, IL altı ve TNF alfa'yı indükledi. IL altı'nın irna ile inhibisyonunun IL altı üretimini azalttığını, ancak TNF alfa üretimini etkilemediğini unutmayın.

Bu veriler, doğuştan gelen bağışıklığın aday düzenleyicilerinin siRNA aracılı yıkımının iyi etkinliğini ve iyi özgüllüğünü göstermektedir. İyi bir transfeksiyon ve iyi hücre geri kazanımının anahtarının, çok sağlıklı hücrelerle çalışmak, transfeksiyon ve geri kazanım işlemi sırasında onlara nazikçe davranmak ve hücreler bir nükleo efektör çözeltisine girdikten sonra hızlı bir şekilde çalışmak olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, gen yıkımını izlemek için QPCR ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisini araştırmak için diğer birçok test dahil olmak üzere birçok başka test yapılabilir.