Pre-mRNA Substratlarm 3 'End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi In vitro
May 3rd, 2014
RNA polimeraz II olgun mRNA'nın 3 'ucunun ötesine uzanan bir ön-madde RNA sentezler. Olgun RNA uç yarılma kompleksinin endonükleaz etkinliği ile, RNA dizileri tarafından dikte bir bölgede, cotranscriptionally oluşturulur. Burada, detay in vitro bölünme reaksiyonları çalışma yöntemi biz.
Bu prosedürün genel amacı, üç asal mRNA bölünmesini in vitro olarak başarılı bir şekilde incelemektir. Bu, önce süspansiyon halinde büyütülen hücrelerden transkripsiyonel olarak aktif nükleer ekstrakt yapılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, in vitro transkripsiyon yoluyla radyo etiketli RNA substratları yapmaktır.
Üçüncü adım, etiketli RNA substratlarını jelleştirmektir. Son adım, nükleer ekstrakt ve etiketli RNA substratı dahil olmak üzere bölünme reaksiyonunu bir araya getirmektir. Sonuç olarak, sonuçlar dikey radyoaktif jel elektroforezi yoluyla üç asal mRNA, UNC parçalanmış substrat ve parçalanmış ürün gösterebilir.
Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, 1980'lerden beri gerçekleştirilmesine rağmen, prosedür boyunca zorlu olan birçok spesifik adım olduğu için kolayca uygulanmaz. Hücreleri yıkadı, peletledi ve parçalanmaya hazır hale getirdi. Bu protokolü hücre peletine başlatmak için, taze DTT ile tampon ekleyin.
Tahmini GBM'den beş hacim ekleyin ve peleti parçalamak ve süspansiyonun buz üzerinde soğumasını sağlamak için bir pipet kullanın. 10 dakika sonra, hücreleri sallanan bir kovada dört santigrat derecede döndürün. Santrifüj, süpernatanı dikkatlice aspire edin.
Pelet bir miktar çözeltiyi emmiş ve boyut olarak şişmiş olacaktır. Ardından bir GBV tampon A ekleyin ve peleti bir pipet ucuyla nazikçe parçalayın. Süspansiyonu soğutulmuş bir homojenizatöre dökün ve beş ila 12 vuruşla sıkı bir havaneli ile hücreleri sarın.
Küçük bir alikotu çıkarın, trian mavisi uygulayın ve parçalanmalarının eksiksizliğini belirlemek için hücreleri kontrol edin. Gerekirse, hücreleri %90 parçalanana kadar homojenleştirmeye devam edin, ancak aşırıya kaçmayın. Şimdi lizatı ultra berrak bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
Toplam hacmi kaydedin ve daha önce yapıldığı gibi döndürün. Bulutlu süpernatanı aspire edin ve buzun üzerinde saklayın. Ve sitozol analizi için, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.
Çekirdekleri içerir. Ardından, peleti 15 dakika boyunca yüksek hızda döndürün. Kalan küçük hacimli süpernatantı çıkarın ve sitozol toplama ile bir araya getirin.
Ardından PACT nükleer hacmini belirleyin. Pelete hacim eşdeğeri bir tampon C ekleyin. Ardından, temiz bir homojenizatörde pipeti kullanarak peleti yerinden çıkarın.
Canlandırmak için beş ila 10 sıkı havaneli vuruşu kullanın. Peleti askıya alın. Homojenatı soğutulmuş bir tüpe aktarın ve 30 dakika ters çevirerek karıştırın.
Dört santigrat derecede, bir karıştırma plakası kullanılabilir. Hacim yeterince büyükse, lizatı bir UltraClear ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede 30 dakika döndürün. Yaklaşık 25.000 g'da, süpernatan nükleer ekstrakttır.
Metin protokolünü takiben, diyalizi sadece bir mikrogram şablondan tamamlayın. Probu, SP altı veya T yedi uyumlu promotörlü bir kit kullanarak in vitro transkripsiyonla hazırlayın. Sayfayı yüklerken, her RNA substratı için üç mikrolitre işaretleyici ve 25 mikrolitre reaksiyonun tamamını kullanın.
Ayrıca, benzer büyüklükteki transkriptlerin şeritlerini ayırarak çapraz kontaminasyonu önleyin. Jeli, 600 nükleotidli bir prob daha sonra yaklaşık iki saat boyunca 25 watt'ta çalışacak şekilde çalıştırın. Jel bantların yerini işaretlemek için, açıkta kalan filmi bir ışık kutusu ile aydınlatın ve sarılı jeli üstüne koyun.
Otomatik rad işaretleyicisini ve açıkta kalan işaretleyiciyi film üzerinde hizalayın. Ardından bantları çıkarmak için bant konumlarını siyah kalemle işaretleyin Jeli açın. Ve temiz bir bıçakla, jelin bant bölümlerini eksize edin, her bölümü kendi tüpüne aktarın ve standart prosedürleri izleyerek RNA'yı dışarı atın.
Tüm reaktifler hazırlandıktan sonra, etiketli RNA'yı iki dakika boyunca 80 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra RNA'yı buz girdabına, %10 PVA'ya aktarın ve ardından kabarcıkları çıkarmak için birkaç dakika yüksek hızda döndürün, ardından her reaksiyon için ana karışımları yapmaya devam edin. Her reaksiyon için 5.25 mikrolitre ana karışım bir tane dağıtın.
Ardından, 6.25 mikrolitre nükleer ekstrakt karışımı ekleyin. Ardından, toplamda 50 ano molar ile seyreltilmiş bir mikrolitre etiketli RNA substratı ekleyin. Her reaksiyon, beşten az anomolar etiketli RNA kullanır.
Şimdi, yavaşça girdap yapın ve reaksiyon karışımlarını hızla aşağı döndürün. Reaksiyonun 30 santigrat derecede iki saate kadar gerçekleşmesine izin verin. Reaksiyondaki proteini sindirmek için proteinaz K kullandıktan ve ardından reaksiyonu saflaştırdıktan sonra, reaksiyonun zaman seyrini almak en iyi sonuçları sağlayacaktır Fenol kloroform yöntemini kullanarak, ürünleri %6 sayfa yükü, üç mikrolitre işaretleyici veya reaksiyon ürünü başına beş mikrolitre ile çalıştırın.
Ardından jeli çalıştırın ve daha sonra jel aparatını dikkatlice sökün. Jeli toplamak için filtre kağıdını sıkıca bastırın ve ters çevirin. Jelin kağıt tarafından tam olarak kavrandığından emin olmak için cama sıkıca bastırın.
Ardından filtre kağıdını jel takılıyken yavaşça soyun. Jelin açıkta kalan tarafını plastiğe sarın ve sargıyı diğer taraftaki filtre kağıdına bantlayın. Jeli, filtre kağıdı vakuma bakacak şekilde 15 dakika kurutucuya koyarak bitirin.
Daha sonra, jeli bir filme veya fosfo görüntüleyiciye maruz bırakarak analiz edin. Bölünmüş. RNA substratı, jelin üst kısmındaki en yavaş göç eden banttır.
Kalın bir okla işaretlenmiş özel parçalanmış ürün, jel içinde beklenen boyutta daha hızlı çalışır. Bu ürün, pollier dizisinde bir nokta mutasyonu ile kontrolde yoktur. Bölünme aktivitesinin nicelleştirilmesi bir DS metrik grafiği ile belirlendi.
Bölünmüş RNA'nın bölünmüşe oranının karşılaştırılması, bölünmüş RNA kontrolüne normalize edilmiştir. Bu prosedürü takiben, poliA polimerazın aktivitesi gibi ek soruları yanıtlamak için poliadenilasyon testi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu tahlil, magnezyum eklenmesi ve EDTA'nın çıkarılması gibi reaksiyon koşullarının değiştirilmesiyle yapılır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, RNA olgunlaşmasında kritik bir süreç olan üç primer mRNA kesimi in vitro'nun incelenmesine odaklanmaktadır. Yöntem, kesme reaksiyonlarını analiz etmek için transkripsiyonel olarak aktif nükleer ekstrakt ve radyo etiketli RNA substratlarının kullanımını içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- RNA biyolojisi
- Moleküler biyoloji
- Biyokimya
Arka Plan
- RNA polimeraz II, olgun mRNA'nın 3' ucunun ötesine uzanan öncü RNA sentezler.
- Kesme kompleksi, olgun RNA üretimi için konumu belirler.
- Kotranskripsiyonel süreçler, RNA olgunlaşması için gereklidir.
- Kesme reaksiyonlarını anlamak, RNA işleme mekanizmaları hakkında bilgi sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Üç primer mRNA kesimi in vitro'yu incelemek.
- RNA işlemede nükleer ekstraktların rolünü anlamak.
- Kesme reaksiyonlarının ürünlerini jel elektroforezi kullanarak analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Süspansiyon-yetiştirilen hücrelerden transkripsiyonel olarak aktif nükleer ekstraktın hazırlanması.
- In vitro transkripsiyon yoluyla radyo etiketli RNA substratlarının sentezi.
- Etiketli RNA substratlarının jel ile saflaştırılması.
- Nükleer ekstrakt ve etiketli RNA substratları ile kesme reaksiyonlarının bir araya getirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Üç primer mRNA substratlarının başarılı bir şekilde kesimi gözlendi.
- Sonuçlar, dikey radyoaktif jel elektroforezi ile analiz edildi.
- UNC kesme substratları ve kesme ürünleri tanımlandı.
- Metodoloji, RNA kesme reaksiyonlarının incelenmesi için bir çerçeve sağlar.
Sonuçlar
- Bu çalışma, in vitro mRNA kesimi incelemek için güvenilir bir yöntem sunar.
- Kesme mekanizmalarını anlamak, RNA işleme hakkında bilgiyi artırabilir.
- Sonuçlar, RNA biyolojisinin daha geniş alanına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
