Name: Pre-mRNA Substratlarm 3 End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, hücre dışı sistemler kullanarak pre-mRNA 3' uç bölünme reaksiyonlarını in vitro analiz etmeyi. Transkripsiyonel olarak aktif nükleer ekstrakt ve radyoaktif etiketli RNA substratları ile kesme ürünlerini jel elektroforeziyle değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SV NIH K22AI077353 ve Landenberger Vakfı&#39;nın finansman desteği için minnettar olduğunu. KR minnetle NIH (5SC1GM083754) fon kabul eder.

<ol><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Wahle, E., Ruegsegger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-End+processing+of+pre-mRNA+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes.</a> FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).</li>
<li>Colgan, D. F., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+mRNA+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation.</a> Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%27+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA biology. 9, 563-576 (2012).</li>
<li>Danckwardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prothrombin+3%27end+formation+signal+reveals+a+unique+architecture+that+is+sensitive+to+thrombophilic+gain-of-function+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations.</a> Blood. 104, 428-435 (2004).</li>
<li>Moreira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstream+sequence+element+of+the+C2+complement+poly%28A%29+signal+activates+mRNA+3%27+end+formation+by+two+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms.</a> Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).</li>
<li>Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+cyclooxygenase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2.</a> Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).</li>
<li>Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+basal+polyadenylation+factor+by+the+upstream+sequence+element+of+the+human+lamin+B2+polyadenylation+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).</li>
<li>Moore, C. L., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+cleavage+and+polyadenylation+of+exogenous+RNA+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate.</a> Cell. 41, 845-855 (1985).</li>
<li>Gilmartin, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilmartin%2C+GM+%22mRNA+formation+and+function%22">mRNA formation and function</a>. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).</li>
<li>Wahle, E., Keller, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahle%2C+E+%22RNA+Processing.+Vol.+II%22">RNA Processing. Vol. II</a>. , Oxford University Press. 1-34 (1994).</li>
<li>Chabot, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChabot%2C+B+%22RNA+Processing+Vol+I%22">RNA Processing Vol I</a>. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).</li>
<li>Valente, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+mRNA+3%27+end+processing+is+distinctively+regulated+by+eIF3f%2C+CDK11%2C+and+splice+factor+9G8%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8.</a> Mol Cell. 36, 279-289 (2009).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li>
<li>Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Fluoro-+and+2%27-amino-2%27-deoxynucleoside+5%27-triphosphates+as+substrates+for+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).</li>
<li>Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+polyadenylation+factor+CPF+specifically+interacts+with+the+pre-mRNA+3%27+processing+signal+AAUAAA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA.</a> EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).</li>
<li>Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+factors+are+required+for+3%27-end+cleavage+of+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).</li>
<li>Takagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multisubunit+factor%2C+CstF%2C+is+required+for+polyadenylation+of+mammalian+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).</li>
<li>Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+Im+is+related+to+spliceosomal+SR+proteins+and+can+be+reconstituted+in+vitro+from+recombinant+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits.</a> Mol Cell. 1, 243-253 (1998).</li>
<li>Vries, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+II%28m%29+contains+homologs+of+yeast+proteins+and+bridges+two+other+cleavage+factors%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors.</a> EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).</li>
<li>Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ordered+pathway+of+assembly+of+components+required+for+polyadenylation+site+recognition+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing.</a> Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3%27+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Mol Cell. 33, 365-376 (2009).</li>
<li>Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement%3A+co-transcriptional+recruitment+of+pre-mRNA+processing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).</li>
<li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+cleavage+and+polyadenylation%3A+the+long+and+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it.</a> Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).</li>
<li>Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+accurate+and+efficient+mRNA+3%27+end+cleavage+and+polyadenylation+of+a+simian+virus+40+early+pre-RNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro.</a> Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).</li>
<li>Hirose, Y., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+phosphate%2C+not+ATP%2C+is+required+for+3%27+end+cleavage+of+mammalian+pre-mRNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro.</a> J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).</li>
<li>Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+activators+of+pre-mRNA+3%27+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage.</a> RNA. 15, 483-492 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

HeLa hücre nükleer özütlerinde veya bu ekstrelerden parçalandı bölme faktörleri ile gerçekleştirilen in vitro pre-mRNA 3 &#39;bölünme reaksiyonu, çekirdek bölünmesi faktörler ve ana komplekslerinin 16-21 tanımlanmasını sağladı. Bu faktörlerle ilişkili daha birçok proteinlerin son zamanlarda 22 tespit edilmiştir ve in vitro reaksiyon bu proteinlerin reaksiyonu nasıl katkıda ışık tutacak devam edebilir. In vivo reaksiyon cotranscriptional 23 gibi görünüyor, ya da...

En olgun ökaryotik mesajı RNA&#39;lar (mRNAlarının) biyosentezi gibi kapatma, yapıştırma ve poliadenilasyonun gibi çeşitli transkripsiyon sonrası değişiklikler gerektirir. Bu değişiklikler genel olarak doğru işlem 1 yürütülmesini sağlamak ve güçlü bir mRNA&#39;nın stabilitesini arttırmak kuple edilir. 3 &#39;, memeli ön mRNA uç oluşumu 5&#39;e adenilat tortularının ilave edildi ve ardından yeni oluşan RNA endonükleolitik yarılmasıyla üretilir&#39; poly (A) polimeraz (PAP) 2-4 ürünü ayrıldı. Memelilerde, bölünme özel ön-RNA dizileri üzerinde toplanır, yaklaşık 800 kDa, ve, bir çok-bileşenli protein kompleksi ile gerçekleştirilir. Poli (A) sinyal sekansı, yüksek oranda korunmuş bir kanonik hexanucleotide sekansı AAUAAA, yaklaşık 10-30 nt alt bölünme sitesi yönlendirir. Bu site spesifik yarılma ve poliadenilasyon özgüllük faktörü (CPSF) ve 73 kD alt ünitesi tarafından tanınanCSPF endonükleaz aktivitesi içerir. Bölünme uyarım faktörü (CSTF) alt poli (A) Alanı daha dejenere GU-ya da U-zengin sekansı element bağlar. Ayrıca memeli bölünme faktörü I (CFIm) ve memeli bölünme faktörü II (CFII) bölünmesi için gerekli olan. CFIm gen bir dizi için tanımlandığı gibidir ve önemli fizyolojik işlemleri 5-8 dahil olmak gibi olmuştur üst dizisi elemanları (kullanım) spesifik UGUA (N) sitelerine bağlanır. İn vitro olarak, RNA işleme tepkimelerinin genel olarak radyo-etiketli RNA alt tabakaların 9-12 kullanımı ile analiz edilmiştir. Bunlar, bakteriyofaj promotör T7 ya da SP6 ikinci run-off transkripsiyonu ile sentezlenebilir. Daha önce karakterize edilmemiş bir poliadenilasyon sitesi incelenirken, önemli alt dizileri cDNA içinde mevcut olmayabilir gibi, RNA alt tabakanın üretilmesi için, genomik DNA yerine cDNA kullanmak gereklidir. En az 150 nt upstrea dahil tasarım yüzeylerm ve 50 nt aşağısında olgun mRNA üzerinde yarılma sitesi / ucundan. Alt-tabaka bölünme oluşumu daha hızlı göç eder; Diğer parçalar spesifik olmayan nükleaz hareketiyle oluşturulmuş olabilir, çünkü ancak, reaksiyonun özgüllüğü doğru işlem sinyal dizileri üzerinde bağımlılığı ile doğrulanmalıdır. Bu nedenle, AAUAAA dizisi (örneğin, AAGAAA) bir nokta mutasyonu ile alt-tabakalar RNA bölünme reaksiyonu için bir negatif kontrol olarak hizmet etmektedir. Radyo işaretli RNA küçük bir miktar bölünme reaksiyonları için kullanıldığı göz önüne alındığında, çoğu nükleer özütlerinde de yüksek bolca mevcut RNazlar sorunlu olabilir ve özü hazırlanması için başlangıç ​​malzemesinin seçimi sınırlayabilir. HeLa hücreleri, endojen RNases düşük seviyelerini ihtiva edebilmekte ve bu yüzden, bu deneylerde iyi bir performans göstermektedir. In vivo ve in vitro RNA substratların endonükleolitik klivaj hemen poli (A) ekleme, Per izlemektedirs bölünmüş ara tespit edilebilir miktarlarda mevcut değildir. Bu nedenle, belirli bir RNA dizisini ya da bir bölünme reaksiyonunda yer alan proteinleri ya da çalışma için, deneyler meydana gelen poliadenilasyon önlemek koşullarda yapılır. Bir parçalanma reaksiyonunu zarar vermeden poliadenilasyona durdurmak böylece hiçbir poliadenilasyonunun üzerinde bölünme bağımlılığı, ya da tam tersi vardır. Bu nedenle, ATP tek bir nükleotid poli (A) bölgesinde dahil edilebilir ve sadece bir RNA klivaj tespit edilebilir, böylece 3 &#39;hidroksil grubuna sahip olmayan bir zincir sonlandırma analogu ile değiştirilir. Karmaşıklığı ve tahlil bu tür yüksek derecede belirli özellikler göz önüne alındığında, in vitro mRNA öncülerinin ayırma / Poli (A) makine ile endonükleolitik bölünme incelemek için ayrıntılı bir video protokol açıklar. Biz, yetkili nükleer özleri hazırlamak radyoetiketlenmiş RNA alt tabakalar oluşturmak, parçalanma reaksiyonunu gerçekleştirmek ve sonucu analiz etme ve yorumlama nasıl tarifing ürünleri. Şekil 1, bir bölme deneyi için kullanılacak olan HIV-1 ön-mRNA öğeleri içerisinde 3 &#39;ucunda kodlama için alt-tabaka RNA&#39;ların bir örneğini göstermektedir. HIV RNA genomunun 3 &#39;ucu, örneğin poli (A) sitesi, G+ U zengin bölge ve bütün viral mRNA transkriptlerinin 13 etkin bir şekilde olgunlaşması için gerekli olan USE elemanı olarak çok önemli bir düzenleyici sekansların oluşmaktadır . Bu örnekte giriş RNA substrat 338 nt ve bölünme 237 üzerine nt olması beklenir. Poliadenilasyon oluşmasına izin verilir ise, ürün bir yayma 237 ve 437 nt arasında anlamlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>1 L Celstir şişesi</td><td>Wheaton</td><td>356884</td><td>Farklı boyutlar mevcuttur</td></tr><tr><td>4 konumlu yavaş hızlı karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>12621-076</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan kova santrifüjü</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Allegra x-15R, SX4500 Rotorlu</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Optima L-100 XP Ultra, SW41 Rotorlu</td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj 5417R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Buzdolabı</td></tr><tr><td>Termomikser inkübatörü</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml konik tüpler</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Ultraclear santrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>JOKLIK modifiye MEM</td><td>Lonza</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Atlas</td><td>F-0500-A</td><td>Isı ile etkisiz hale getirilmiş</td></tr><tr><td>L-glut:kalem:strep</td><td>İkizler Biyo-Ürünler</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Mediatech</td><td>46-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>MP Biyomedikal</td><td>194844</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Alexis Biyomedikal</td><td>280-001-G-010</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>5 M sodyum klorür çözeltisi</td><td>Mediatech</td><td>46-032-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889-100ml</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Termo Bilimsel</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Fisher</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Diyaliz Kasetleri Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>66372</td><td>MWCO 7.000 0.5 ml-3 ml</td></tr><tr><td>15 ml Dounce doku öğütücü seti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938-1SET</td> Farklı <td>boyutlar mevcuttur</td></tr><tr><td>Yüksek kaliteli PCR kitini genişletin</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>Y02256</td><td>her nükleotid 10 mM</td></tr><tr><td>MaxiScript SP6/T7 kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1322</td><td></td></tr><tr><td>m7G(5 ')ppp (5') G RNA kapağı</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td></td></tr><tr><td>Yüzyıl İşaretleyici Şablonu Artı</td><td>Ambion</td><td>AM7782</td><td></td></tr><tr><td>Easytides UTP [&alfa;-32P] 250 &mu; Ci</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU507H250UC</td><td></td></tr><tr><td>Jel yükleme tamponu II</td><td>Ambion</td><td>8546G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC arıtılmış su</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Fisher</td><td>BP13354</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Ameresco Yaşam Bilimleri</td><td>0658-4L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Balıkçısı</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum asetat</td><td>Fisher</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>%40 19:1 Akrilamid:Bis-Akrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Roche</td><td>10 901 393 001</td><td></td></tr><tr><td>%100 mutlak etanol 200 kanıt</td><td>Acros</td><td>61509-0040</td><td></td></tr><tr><td>Asit fenol: kloroform</td><td>Ambion</td><td>9720</td><td>RNA</td></tr><tr><td>Scintilasyon sıvısı</td><td>için Fisher</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>Rnaz inhibitörü</td><td>Promega</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>Polivinil alkol- PVA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kreatin fosfat</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP</td><td>Fisher</td><td>BP2560-4</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Acros</td><td>23042-5000</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Fisher</td><td>BP1700-100</td><td></td></tr><tr><td>Ayarlanabilir dizileme ünitesi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351881-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Bağlayıcı klipsler</td><td>Ofis Deposu</td><td>838-056</td><td></td></tr><tr><td>20 cm x 42 cm cam plakalar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352543</td><td>1 TAKIM</td></tr><tr><td>20 cm x 22 cm cam plakalar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35252-7</td><td>1 TAKIM</td></tr><tr><td>20 cm x 42 cm alüminyum soğutma plakaları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352667</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>0,4 mm x 22 cm ara parçalar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35230-6</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>0,4 mm x 42 cm ara parçalar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352314-1</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>8 kuyulu tarak</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35195-4</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>16 oyuklu</td><td>tarak Sigma-Aldrich</td><td>Z351962</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>32 oyuklu tarak</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351970</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>Jel itici kaplama</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>SGR-0401</td><td>veya SGR-0101 bireysel şişe için</td></tr><tr><td>Jel yükleme ipuçları</td><td>Rainin</td><td>GT-10-4</td><td>0.1-10 &; l</td></tr><tr><td>Sıralama PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>PowerPac HV</td><td>5.000 V/500 mA/400 W</td></tr><tr><td>Jel Kurutucu Model 583</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583</td><td></td></tr><tr><td>Jel kurutucu için Hydrotech vakum pompası</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glogos II Karanlıkta parlayan kalemler</td><td>Agilent</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Film 8 x 10</td><td>Midsci</td><td>BX810</td><td></td></tr><tr><td>Film 14 x 17</td><td>Phoenix</td><td>F-BX1417</td><td></td></tr><tr><td>Otoradyografi kaseti</td><td>Fisher</td><td>FBCA 1417</td><td>8 x 10 boyutu mevcut</td></tr></tbody></table>

pre-mrna substratlarm 3 &#39;end bölünme: hücre Ücretsiz sistemlerini kullanma rna İşleme reaksiyonları analizi<em&gt; in vitro</em

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Memeli mRNA&#39;ların 3 &#39;ucu RNA polimeraz II (RNPII) ile transkripsiyonun sonlandırılması ile ani oluşmuş değildir. Bunun yerine, RNPII olgun RNA&#39;lar ötesinde ön-mRNA sentezler ve endonükleaz aktivitesi olan bir süreç belirli bir site gereklidir. Öncü RNA bölünmesi normalde CA dinükleotidleri sonra konsensüs polyA bölgesi (AAUAAA) aşağı nt 10-30 oluşur. Yarılma kompleks, yaklaşık olarak 800 kDa&#39;lık çok faktörlü bir protein kompleksi, ikinci proteinler, bu özel nükleaz aktivitesi gerçekleştirmek. Belirli RNA sekansları, yukarı akış ve poliA site alt bölünme kompleksinin işe kontrol eder. Hemen bölünmesinden sonra, pre-mRNA stabil olgun RNA mesajları üretmek için poli A polimerazı (PAP) ile poliadenile edilmiştir. Bir RNA transkriptinin 3 &#39;ucunun radyo-etiketli RNA Processing özel alt-tabakalar ile hücre nükleer özler kullanılarak incelenebilir. Özetle, uzun bir 32 &lt;/ Sup&gt; P-etiketli Parçalanmamış öncü RNA, in vitro olarak nükleer ekstreler ile inkübe edilir, ve bölünme jel elektroforez ve otoradyografi ile değerlendirilir. Uygun bölünme oluştuğunda, 5 &#39;kısa bir ürün olarak algılanır ve ölçülür ayrıldı. Burada, bir örnek olarak, kullanılarak ayrıntılı olarak HIV-1 mRNA&#39;ların 3 &#39;ucu işleme bölünme tahlili tarif eder.

RNA poli (A) HIV-1 siteleri (Şekil 2) bir bölünme tahlili temsil edici sonuçları. Bu jelin üstünde yavaş göç eden bir bant Parçalanmamış RNA alt tabakanın, gözlemleyebiliriz. Belirli ürün, daha hızlı parçalanan beklenen boyutta jelde çalışan en yoğun kısa fragman bandı, ve poliA sekansı (mutPolyA) RNA, bir nokta mutasyon ihtiva mutpoly (A) kontrolü yarılma tahlilinden özellikle yoktur alt-tabaka. Giriş substratın degradasyon ürünleri, bazen gözlemlenebilir. Yarılma aktivitesi miktar tayini Parçalanmamış...

RNA polimeraz II olgun mRNA&#39;nın 3 &#39;ucunun ötesine uzanan bir ön-madde RNA sentezler. Olgun RNA uç yarılma kompleksinin endonükleaz etkinliği ile, RNA dizileri tarafından dikte bir bölgede, cotranscriptionally oluşturulur. Burada, detay in vitro bölünme reaksiyonları çalışma yöntemi biz.

Pre-mRNA Substratlarm 3 &#39;End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Bu prosedürün genel amacı, üç primer mRNA kesimini in vitro ortamda başarıyla incelemektir. Bu işlem, öncelikle süspansiyonda büyütülen hücrelerden transkripsiyonel olarak aktif nükleer ekstrakt hazırlanarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, in vitro transkripsiyon yoluyla radyoaktif olarak işaretlenmiş RNA substratları hazırlamaktır.Üçüncü adım, işaretli RNA substratlarını jel ile saflaştırmaktır. Son adım ise nükleer ekstrakt ve işaretli RNA substratını içeren kesim reaksiyonunu kurmaktır. Nihayetinde, dikey radyoaktif jel elektroforezi aracılığıyla üç primer mRNA, kesilmemiş substratlar ve kesilmiş ürün gösterilebilir.Bu yöntem 1980'lerden beri uygulanıyor olsa da, prosedür boyunca zorlayıcı olan birçok spesifik adım bulunduğu için kolayca yürütülemez; bu nedenle yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir. Yıkanmış, pelletlenmiş ve lizse hazır hücreler bulundurun. Bu protokole başlamak için, hücre pelletine taze DTT içeren tampon ekleyin.Tahmini CPV'nin beş hacmi kadar ekleyin ve peleti parçalamak için bir pipet kullanın, ardından süspansiyonun buz üzerinde soğumasını sağlayın. 10 dakika sonra, hücreleri dört santigrat derecede salınımlı kova santrifüjle çöktürün. Santrifüjden sonra süpernatantı dikkatlice aspire ederek uzaklaştırın.Pellet bir miktar çözelti emmiş ve boyut olarak şişmiş olacaktır. Ardından bir CPV tampon A ekleyin ve pelleti bir pipet ucuyla nazikçe parçalayın. Süspansiyonu soğutulmuş bir homogenizöre dökün ve sıkı bir havan eliyle beş ila 12 vuruş yaparak hücreleri parçalayın.Küçük bir alikot alın, trypan blue uygulayın ve lizisin tamamlanıp tamamlanmadığını belirlemek için hücreleri kontrol edin. Gerekiyorsa, hücreler %90 oranında lize olana kadar homojenizasyona devam edin, ancak aşırıya kaçmayın. Şimdi lizatı ultra net bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.Toplam hacmi kaydedin ve daha önce yapıldığı gibi santrifüjleyin. Bulanık süpernatanı aspire edin ve buz üzerinde saklayın. Sitozol analizi için pelletin bozulmamasına dikkat edin.Çekirdekleri içerir. Ardından, peleti 15 dakika boyunca yüksek hızda santrifüjleyin. Geriye kalan küçük hacimdeki süpernatantı uzaklaştırın ve bunulele alınanle sitozol koleksiyonuyla birleştirin.Ardından PACT çekirdek hacmini belirleyin. Pellete eşdeğer hacimde tampon C ekleyin. Daha sonra, temiz bir homojenizatör içinde pipet kullanarak pelletle bağlantıyı kesin.Pelleti yeniden süspand etmek için havan eliyle beş ila 10 kez sıkıca ezin. Homojenatı soğutulmuş bir tüpe aktarın ve 30 dakika boyunca altüst ederek karıştırın.Dört °C'de bir manyetik karıştırıcı kullanılabilir. Hacim yeterince büyükse, lizatı bir UltraClear ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve dört °C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Yaklaşık 25.000 ×g'de, süpernatan nükleer ekstraktır.Metin protokolünü takip ederek, sadece bir mikrogram kalıp DNA ile diyalizi tamamlayın. SP6 veya T7 uyumlu bir promotör içeren kit kullanarak in vitro transkripsiyon ile probu hazırlayın. Jeli yüklerken, her bir RNA substratı için üç mikrolitre marker ve reaksiyonun tamamı olan 25 mikrolitre kullanın.Ayrıca, benzer boyutlardaki transkriptlerin şeritleri arasında boşluk bırakarak çapraz kontaminasyonu önleyin. Jeli, 600 nükleotidlik bir probun daha sonra yaklaşık iki saat boyunca 25 watt'ta çalışacağı şekilde çalıştırın. Jel bantlarının konumunu işaretlemek için, pozlanmış filmi bir ışık kutusuyla aydınlatın ve sarılı jeli üzerine yerleştirin.Auto rad işaretleyiciyi ve film üzerindeki pozlanmış işaretleyiciyi hizalayın. Ardından, bantları çıkarmak için bant konumlarını siyah bir markörle işaretleyin. Jeli çözün. Temiz bir bıçakla jelin bant bölümlerini kesin, her bölümü kendi tüpüne aktarın ve standart prosedürleri izleyerek RNA'yı elüe edin.Tüm reaktifler hazırlandıktan sonra, etiketlenmiş RNA'yı iki dakika boyunca 80 °C'de ısıtın. Ardından RNA'yı buza aktarın, vortexleyin, %10 PVA ekleyin ve ardından kabarcıkları gidermek için birkaç dakika boyunca yüksek hızda santrifüjleyin; sonrasında her bir reaksiyon için ana karışımları (master mix) hazırlamaya geçin. Her reaksiyon için 5,25 µL birinci ana karışımı dağıtın.Ardından, 6,25 µL nükleer ekstrakt karışımı ekleyin. Daha sonra, toplamda 50 amolar seviyesine seyreltilmiş 1 µL işaretli RNA substratı ekleyin. Her reaksiyonda 5 amolar'dan daha az işaretli RNA kullanılır.Şimdi, reaksiyon karışımlarını nazikçe vorteksleyin ve hızlıca santrifüjleyerek çöktürün. Reaksiyonun 30 °C'de iki saate kadar gerçekleşmesine izin verin. Reaksiyonun zaman seyri takibi en iyi sonuçları verecektir. Reaksiyondaki proteinleri sindirmek için proteinaz K kullandıktan ve ardından fenol kloroform yöntemiyle reaksiyonu saflaştırdıktan sonra, ürünleri %6'lık bir jelde yürütün; her şeride üç µL marker veya reaksiyon ürünü başına beş µL yükleyin.Ardından jeli çalıştırın ve daha sonra jel aparatını dikkatlice sökün. Jeli toplamak için filtre kağıdını üzerine sıkıca bastırın ve ters çevirin. Jelin kağıt tarafından tamamen kavranmasını sağlamak için cama sıkıca bastırın.Ardından, filtre kağıdını üzerindeki jel ile birlikte yavaşça soyun. Jelin açıkta kalan tarafını plastikle sarın ve sargıyı diğer taraftaki filtre kağıdına bantlayın. İşlemi, jeli vakum tarafı filtre kağıdına bakacak şekilde 15 dakika boyunca bir kurutucuya yerleştirerek tamamlayın.Daha sonra, jeli bir filme veya fosfor imajere maruz bırakarak analiz edin. Kesilmiş RNA substratı, jelin üst kısmındaki en yavaş göç eden banttır.Kalın okla işaretlenen spesifik kesilmiş ürün, jelde beklenen boyutta daha hızlı ilerlemiştir. Bu ürün, polier dizisinde nokta mutasyonu bulunan kontrolde mevcut değildir. Kesim aktivitesinin kantifikasyonu, bir DS metrik grafiği ile belirlenmiştir.Kesilmiş RNA'nın kesilmemiş RNA'ya oranını, kesilmiş RNA kontrolüne göre normalize ederek karşılaştırın. Bu prosedürün ardından, polyA polimeraz aktivitesi gibi ek soruları yanıtlamak için poliadenilasyon analizi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu analiz, magnezyum eklemek ve EDTA'yı çıkarmak gibi reaksiyon koşulları değiştirilerek gerçekleştirilir.

analysis-rna-processing-reactions-using-cell-free-systems-3-end

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Bakteri ve Archaea yılında CRISPR / Cas sistemleri aracılık adaptif bağışıklık. Birçok Cas proteinlerin uzunluğu değişen crRNA öncüllerinin hareket endoribonucleases olarak hareket etmek önerilmektedir. Burada Cas endonuclease aktivitesinin biyokimyasal analiz için önceden crRNA yüzeyler oluşturmak için üç farklı yaklaşımlar sergiler.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

Burada, bakteri transkriptlerinden transkripsiyonel başlangıç noktalarını belirlemek ve otomatik bir jel dizileyici kullanarak in vivo RNA işlemeyi belirlemek için floresan bazlı bir primer uzatma yöntemini açıklıyoruz.

Floresan Bazlı Astar Uzatma Tekniği Transkripsiyonal Başlangıç ​​Noktalarını ve RNases yarılması Siteleri belirleme In Vivo

Bu iletişim kuralı için siteleri işleme eşleme pre-mRNA 3' ucu bir yöntemi açıklar.

A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

İki farklı 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) protokolleri açıklanan burada yapmak açık okuma çerçevesi (ORF), kodonu ve tüm 3' UTR RNA kullanarak bir transkript, bir parçasını içeren dizileri iki farklı DNA polimerazlar kullanımı farklı kanser hücre satırlarından elde.

3' adapte CDNA hızlı amplifikasyon transkript kanser eşlemek için sona erer

RNA/protein kompleksleri Botin-streptavidin strateji kullanarak saf ve daha fazla fonksiyonel analiz için uygun olmayan bir biçimde denaturing koşullarda çözüm için eluted. Burada, yerel ve tamamen işlevsel RNA/protein kompleksleri verimli bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı RNA ve nazik bir UV-elüsyon adım kullanır bu stratejinin bir değişiklik açıklar.

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

Burada, sadece kısa sentetik DNA ve RNA oligonükleotides ve arıtılmış pol II gerektiren RNA polimeraz II (pol II) uzama kompleklerinin montajını tarif ediyoruz. Bu kompleksleri, Pol II uzama kompleksi ile ilişkili transkriptlerin Co-transcriptional işleme temel mekanizmaları eğitim için yararlıdır.

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Burada RNA DNAzyme bağımlı dekolte için bir protokol salıyoruz. Bu, RNA 2'-O-metilasyonun hızlı ve yere bağlı analizini sağlar. Bu yaklaşım, snoRNA aktivitesinin ön veya önemli değerlendirilmesi için kullanılabilir.

RRNA 2'-O-Metilasyonun DNAzyme bağımlı analizi

13 C/ 15 Netiketli ve etiketsiz RNA'da mikro-milisaniye dinamikleri1H R1φ  gevşeme dağılımı nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ile ölçmek için bir protokol sunuyoruz.  Bu protokolün odak noktası, NMR deneylerinin yüksek saflıkta numune hazırlanması ve kurulumunda yatmaktadır.

RNA'nın 1 H R1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

RNA ikincil yapısı öncelikle olgun RNA'da yapı araştırma yöntemleriyle gözlemlenmiştir. Ortak transkripsiyonel Yapı İzleme dizileme (CoSTseq), yeni başlayan RNA'da polimeraz pozisyonunu incelemek için kullanılan nükleer akım sürecini yapı araştırması ile birleştirir. CoSTseq, aktif transkripsiyon altında RNA'da ikincil yapının gözlemlenmesini sağlar.

Saccharomyces cerevisiae'de yeni başlayan ve olgun transkriptlerin karşılaştırmalı RNA yapısı analizi

Öğrenin, hücre dışı sistemler kullanarak pre-mRNA 3' uç bölünme reaksiyonlarını in vitro analiz etmeyi. Transkripsiyonel olarak aktif nükleer ekstrakt ve radyoaktif etiketli RNA substratları ile kesme ürünlerini jel elektroforeziyle değerlendirin.

Pre-mRNA Substratlarm 3 'End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi

Daha fazla video keşfet