Pre-mRNA Substratlarm 3 'End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi In vitro

Bu prosedürün genel amacı, üç asal mRNA bölünmesini in vitro olarak başarılı bir şekilde incelemektir. Bu, önce süspansiyon halinde büyütülen hücrelerden transkripsiyonel olarak aktif nükleer ekstrakt yapılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, in vitro transkripsiyon yoluyla radyo etiketli RNA substratları yapmaktır.

Üçüncü adım, etiketli RNA substratlarını jelleştirmektir. Son adım, nükleer ekstrakt ve etiketli RNA substratı dahil olmak üzere bölünme reaksiyonunu bir araya getirmektir. Sonuç olarak, sonuçlar dikey radyoaktif jel elektroforezi yoluyla üç asal mRNA, UNC parçalanmış substrat ve parçalanmış ürün gösterebilir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, 1980'lerden beri gerçekleştirilmesine rağmen, prosedür boyunca zorlu olan birçok spesifik adım olduğu için kolayca uygulanmaz. Hücreleri yıkadı, peletledi ve parçalanmaya hazır hale getirdi. Bu protokolü hücre peletine başlatmak için, taze DTT ile tampon ekleyin.

Tahmini GBM'den beş hacim ekleyin ve peleti parçalamak ve süspansiyonun buz üzerinde soğumasını sağlamak için bir pipet kullanın. 10 dakika sonra, hücreleri sallanan bir kovada dört santigrat derecede döndürün. Santrifüj, süpernatanı dikkatlice aspire edin.

Pelet bir miktar çözeltiyi emmiş ve boyut olarak şişmiş olacaktır. Ardından bir GBV tampon A ekleyin ve peleti bir pipet ucuyla nazikçe parçalayın. Süspansiyonu soğutulmuş bir homojenizatöre dökün ve beş ila 12 vuruşla sıkı bir havaneli ile hücreleri sarın.

Küçük bir alikotu çıkarın, trian mavisi uygulayın ve parçalanmalarının eksiksizliğini belirlemek için hücreleri kontrol edin. Gerekirse, hücreleri %90 parçalanana kadar homojenleştirmeye devam edin, ancak aşırıya kaçmayın. Şimdi lizatı ultra berrak bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.

Toplam hacmi kaydedin ve daha önce yapıldığı gibi döndürün. Bulutlu süpernatanı aspire edin ve buzun üzerinde saklayın. Ve sitozol analizi için, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.

Çekirdekleri içerir. Ardından, peleti 15 dakika boyunca yüksek hızda döndürün. Kalan küçük hacimli süpernatantı çıkarın ve sitozol toplama ile bir araya getirin.

Ardından PACT nükleer hacmini belirleyin. Pelete hacim eşdeğeri bir tampon C ekleyin. Ardından, temiz bir homojenizatörde pipeti kullanarak peleti yerinden çıkarın.

Canlandırmak için beş ila 10 sıkı havaneli vuruşu kullanın. Peleti askıya alın. Homojenatı soğutulmuş bir tüpe aktarın ve 30 dakika ters çevirerek karıştırın.

Dört santigrat derecede, bir karıştırma plakası kullanılabilir. Hacim yeterince büyükse, lizatı bir UltraClear ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede 30 dakika döndürün. Yaklaşık 25.000 g'da, süpernatan nükleer ekstrakttır.

Metin protokolünü takiben, diyalizi sadece bir mikrogram şablondan tamamlayın. Probu, SP altı veya T yedi uyumlu promotörlü bir kit kullanarak in vitro transkripsiyonla hazırlayın. Sayfayı yüklerken, her RNA substratı için üç mikrolitre işaretleyici ve 25 mikrolitre reaksiyonun tamamını kullanın.

Ayrıca, benzer büyüklükteki transkriptlerin şeritlerini ayırarak çapraz kontaminasyonu önleyin. Jeli, 600 nükleotidli bir prob daha sonra yaklaşık iki saat boyunca 25 watt'ta çalışacak şekilde çalıştırın. Jel bantların yerini işaretlemek için, açıkta kalan filmi bir ışık kutusu ile aydınlatın ve sarılı jeli üstüne koyun.

Otomatik rad işaretleyicisini ve açıkta kalan işaretleyiciyi film üzerinde hizalayın. Ardından bantları çıkarmak için bant konumlarını siyah kalemle işaretleyin Jeli açın. Ve temiz bir bıçakla, jelin bant bölümlerini eksize edin, her bölümü kendi tüpüne aktarın ve standart prosedürleri izleyerek RNA'yı dışarı atın.

Tüm reaktifler hazırlandıktan sonra, etiketli RNA'yı iki dakika boyunca 80 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra RNA'yı buz girdabına, %10 PVA'ya aktarın ve ardından kabarcıkları çıkarmak için birkaç dakika yüksek hızda döndürün, ardından her reaksiyon için ana karışımları yapmaya devam edin. Her reaksiyon için 5.25 mikrolitre ana karışım bir tane dağıtın.

Ardından, 6.25 mikrolitre nükleer ekstrakt karışımı ekleyin. Ardından, toplamda 50 ano molar ile seyreltilmiş bir mikrolitre etiketli RNA substratı ekleyin. Her reaksiyon, beşten az anomolar etiketli RNA kullanır.

Şimdi, yavaşça girdap yapın ve reaksiyon karışımlarını hızla aşağı döndürün. Reaksiyonun 30 santigrat derecede iki saate kadar gerçekleşmesine izin verin. Reaksiyondaki proteini sindirmek için proteinaz K kullandıktan ve ardından reaksiyonu saflaştırdıktan sonra, reaksiyonun zaman seyrini almak en iyi sonuçları sağlayacaktır Fenol kloroform yöntemini kullanarak, ürünleri %6 sayfa yükü, üç mikrolitre işaretleyici veya reaksiyon ürünü başına beş mikrolitre ile çalıştırın.

Ardından jeli çalıştırın ve daha sonra jel aparatını dikkatlice sökün. Jeli toplamak için filtre kağıdını sıkıca bastırın ve ters çevirin. Jelin kağıt tarafından tam olarak kavrandığından emin olmak için cama sıkıca bastırın.

Ardından filtre kağıdını jel takılıyken yavaşça soyun. Jelin açıkta kalan tarafını plastiğe sarın ve sargıyı diğer taraftaki filtre kağıdına bantlayın. Jeli, filtre kağıdı vakuma bakacak şekilde 15 dakika kurutucuya koyarak bitirin.

Daha sonra, jeli bir filme veya fosfo görüntüleyiciye maruz bırakarak analiz edin. Bölünmüş. RNA substratı, jelin üst kısmındaki en yavaş göç eden banttır.

Kalın bir okla işaretlenmiş özel parçalanmış ürün, jel içinde beklenen boyutta daha hızlı çalışır. Bu ürün, pollier dizisinde bir nokta mutasyonu ile kontrolde yoktur. Bölünme aktivitesinin nicelleştirilmesi bir DS metrik grafiği ile belirlendi.

Bölünmüş RNA'nın bölünmüşe oranının karşılaştırılması, bölünmüş RNA kontrolüne normalize edilmiştir. Bu prosedürü takiben, poliA polimerazın aktivitesi gibi ek soruları yanıtlamak için poliadenilasyon testi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu tahlil, magnezyum eklenmesi ve EDTA'nın çıkarılması gibi reaksiyon koşullarının değiştirilmesiyle yapılır.