Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak

Biz, hipokampusun CA1 bölgesinde ve dilimin tetanized alan nükleer zenginleştirilmiş kısımların daha sonraki izolasyon Uzun süreli potansiyasyon indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yaklaşım, önemli aktivitesini öğrenme ve hafıza ile hücresel modellerinde bağımlı nükleer protein alma belirlemek için kullanılabilir.

Bu deneyin genel amacı, nöronal bağlantının ve fonksiyonun iyi korunduğu akut hipokampal dilimler kullanarak proteinlerin aktiviteye bağlı nükleo sitoplazmik geçişini incelemektir Bu amaca ulaşmak için, yetişkin bir erkek sıçanın hipokampusu önce izole edilir ve ikinci adım olarak akut enine dilimler hazırlanır. Hipokampal dilimler kayıt odasına aktarılır ve LTP'nin geç formu CA bir stratum radi atomunda indüklenir. Daha sonra, güçlendirilmiş ve kontrol dilimleri dondurulur ve daha fazla immünoblott Analizi için nükleer zenginleştirilmiş fraksiyonu izole etmek için uyarılmış ca bir bölge disseke edilir.

Western blotlama analizine dayanan sonuçlar, LTP'nin indüksiyonundan 30 dakika sonra güçlendirilmiş ve kontrol dilimleri arasında nükleer fosfoprotein seviyelerinde farklılıklar olduğunu göstermektedir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler iki nedenden dolayı mücadele edeceklerdir. Birincisi, doku numunesi miktarının düşük olması ve ikincisi, numunelerin hipotonik lizis tamponunda parçalanması için tekrarlanan kritik zaman dilimi, çekirdeklerin serbest bırakılmasına izin verir, bu yöntemin görsel gösterimi, hipokampus yaşam hazırlığı ve C bir bölgesinin izolasyonu hızlı ve çok doğru diseksiyonlar gerektirdiğinden kritiktir, ancak bazı püf noktaları vardır.

Bunu kolaylaştırmak için, hipokampusun C bir bölgesinden nükleer zenginleştirilmiş fraksiyonun hazırlanması için hem yazılı hem de görselleştirilmiş talimatların izlenmesi gerekecektir. Lizis Prosedürün gösterimi pinon Posta Laboratuvarı tarafından gerçekleştirilecektir. Akut hipokampus lizisinin nasıl hazırlanacağını ve LTP'nin nasıl indükleneceğini gösterecek.

C'nin diseksiyonundan sonra Berra g aracılığıyla bir bölge laboratuvarımızdan öğrenci size nükleer ve yıkımı nasıl izole edeceğinizi gösterecek. Bu işleme sıçan beynini izole ederek başlayın ve önceden karbonatlanmış buz gibi soğuk bakış çözeltisine batırın. Sonra, beyincik ve enteral korteksin bir kısmını çıkarın.

Kortikal hemisferleri orta sagital bir kesim ile ayırın. Daha sonra, her yarım kürenin sırt kenarı boyunca 50 ila 70 derecelik bir kesim yapın. Ardından, her yarım küreyi medial yüzeyine yerleştirin, her yarım küreyi vibrato'nun dilimleme platformunda yeni kesilmiş yüzeyle yapıştırın.

Daha sonra platformu önceden karbonlanmış buz gibi soğuk bakış solüsyonu ile kaplayın. Vibram ile hipokampal formasyonu, subuler ve enteral korteksleri içeren 350 mikrometrelik dilimleri anteriordan posterior tarafa doğru kesin. Bundan sonra, dilimleri U şeklinde ve batık tip bir inkübatöre aktarın ve karbojen A BOS ile 32 santigrat derecede en az iki saat inkübe edin.

Şimdi bir hipokampal dilimi mikroskop altına monte edilmiş batık tip kayıt odasına aktarın. Dilimi karbonatlı A BOS ile dakikada altı mililitre olarak 32 santigrat derecede en az 30 dakika perfüze edin. 30 dakika sonra, cam kılcal mikro elektrotları bir BOS ile doldurun.

CA'ya bir mikro elektrot yerleştirin, stimülasyon için bir Schaefer teminat lifi ve diğerini 300 mikrometre aralıklarla kayıt yapan alan EPSP'leri için ca bir tabaka hazır atoma yerleştirin. Ardından, Schafer teminat liflerine fazik dikdörtgen akım darbeleri ile üç ila dört volt ileterek alan EP SSP'lerini uyandırın. Giriş çıkış ilişkisini ölçerek maksimum stimülasyon testini gerçekleştirin ve stimülasyon gücünü maksimum alan EPSP'lerinin eğim değerinin %40'ı olarak tanımlayın.

Ardından, deney boyunca her dakika test uyaranlarına verilen yanıtları ölçerek taban çizgisini en az 15 dakika boyunca kaydedin. Geç LTP'yi indüklemek için, yaklaşık bir bölgede uyarılmış alan EPSP'lerini artırmak için yüksek frekanslı tein uygulayın. Tetinden iki dakika önce A BOS'a COE ile beş mikromolar uygulayın ve son tetanozdan hemen sonra yıkayın.

Kaydı durdurun. Geç LTP indüksiyonundan iki dakika veya 30 dakika sonra, elektrotları çıkarın ve dilimi hızlı bir şekilde kuru buz üzerine yerleştirilmiş önceden soğutulmuş bir metal platforma aktarın. Daha sonra her dilimi 1,5 mililitrelik bir eend orph tüpünde toplayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Bu adımda, donmuş dilimleri eksi 80 santigrat dereceden çıkarın ve buz üzerinde tutun. Tüpe proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 0,5 mililitre taze soğuk TBS tamponu ekleyin. Stereo mikroskoba aktarmadan önce iki ila üç dakika inkübe edin.

Daha sonra, dilimi bir iğne ile tutarak ve CA'yı bir alanı diğeriyle keserek hipokampusun CA bir stratum parama dole bölgesini inceleyin. Daha sonra, disseke edilmiş ca bir bölgeyi, 50 mikrolitre lizis tamponu içeren yeni bir nokta mililitrelik tüpte grup başına beş dilimden toplayın. Daha sonra toplanan dokuları 200 mikrolitrelik bir pipet ile dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek homojenize edin.

Hücrelerin şişmesine izin vermek için lizatı buz üzerinde beş ila yedi dakika inkübe edin. Bundan sonra, lizattan iki mikrolitre alın ve bir mikroskop lamına bırakın. Hücrelerin şişmesini parlak bir alan mikroskobu altında görselleştirin.

Çekirdekler, uygun şişme ile yuvarlak sağlam yapılar olarak görünür. Şimdi, homojenat fraksiyonu olarak 1,5 mililitrelik yeni bir tüpte 20 mikrolitre numune toplayın. Sekiz mikrolitre denatüre edici dört XSDS numune tamponu ekleyin.

Daha sonra kalan lizatı 1100 RCF'de bir dakika santrifüjleyin. Bir dakika sonra, süpernatanı üstten dikkatlice toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Ardından, 20 mikrolitre dört x numune tamponu ekleyin.

Daha sonra peleti 60 mikrolitre hipotonik tamponda yeniden süspanse edin ve 20 mikrolitre dört x numune tamponu ekleyin. Bu fraksiyona nükleer zenginleştirilmiş fraksiyon denir. Homojenat, sitozolik ve nükleer zenginleştirilmiş fraksiyonları eksi 20 santigrat derecede veya eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Bu prosedürde daha sonraki immüno-lekeleme için, homojenat, sitoplazmik ve nükleer zenginleştirilmiş fraksiyonlardan eşit miktarda protein örneği olan mito siyah testi veya BCA test yükü ile protein konsantrasyonunu ölçmeden önce numuneleri çözün ve 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Bir SDS sayfasında, kontrol ve LTP dilimlerinden alınan jel örnekleri, Western blot'ta doğrudan karşılaştırma için aynı jel üzerine yerleştirilmelidir. Bu şekil, sitozolik ve nükleer belirteçlerle incelenen ca bir lizatın homojenat, sitozolik ve nükleer olarak zenginleştirilmiş fraksiyonları için bir immün lekeyi göstermektedir.

Bu, tein indüksiyonundan iki dakika ve 30 dakika sonra homojenattaki PJS 180 seviyelerinin bir immüno-blot analizidir ve bu, nükleer zenginleştirilmiş fraksiyondaki PJS 180 seviyelerinin bir immüno-kan analizidir. İnizasyondan iki dakika ve 30 dakika sonra, fosfo Jacob seviyeleri toplam CA'da bir protein homojenatında ve izasyondan iki dakika sonra nükleer zenginleştirilmiş fraksiyonda değişmeden kaldı. Ancak LTP'nin indüksiyonundan 30 dakika sonra p Jacob, S 180 İmmünoreaktivitesinde önemli bir artış bulundu.

Bu prosedürü denerken, uygun hacimde hipotonik lizis valfi kullanmayı unutmamak önemlidir. Ayrıca, numunelerin parçalanması için kritik zaman çerçevesinin standartlaştırılması gerekir. Özellikle, bu yöntem hipokampus dışındaki sıçan veya fare beyin dokusu örneklerinden nükleer ve fraksiyon izolasyonu için uygulandığında Bu prosedürü takiben, OTP'nin indüksiyonundan sonra çekirdeğe ithal edilen aday proteinlere karşı antikor ile tamamlayıcı immün boyama veya aktif kinaz veya fosfataz formları gibi sinyal molekülleri gibi diğer yöntemler bu sonuçların doğrulanması için yardımcı olabilir.

Ek soruları cevaplamak için farmakolojik tedavi yapılabilir. Örneğin, sinaptik nükleer protein meerlerinin translokasyonunda hangi sinyal kaskadlarının rol oynadığı veya bunların bir nükleer işlevi nasıl etkilediği. Ek olarak, hipokampus içeren hastalıkta sinap nükleer haberci proteinlerin rolü incelenebilir.

Örneğin, Alzheimer hastalığı.