Name: Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Öğrenin hipokampal dilimlerde uzun süreli potansiyasyon indüksiyonu ve nükleer zenginleştirilmiş fraksiyon izolasyonu yöntemini. Bu teknik, aktiviteye bağımlı protein taşınmasını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP hibesi (MRK), AB FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Davranışsal Beyin Bilimleri Merkezi (CBBS, Şahsen-Anhalt), (AK ve SB) tarafından finanse edilmiştir, MM, Avrupa Moleküler Biyoloji Organizasyonu (EMBO) Uzun Süreli Bursu (EMBO ALTF 884-2011) ve Marie-Curie IEF sahibidir.

Yetişkin sıçan beyninde gelen Akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması 1. <ol><li> Izofluran ile sıçan anestezisi. DİKKAT: Kapalı bir exicator kullanarak prosedürü uygulayın, izofluran solumamanızı. Hayvan tamamen uyuşturulduktan emin olun. </li><li> Hızlı, sıçan başını kesmek beyin izole ve precarbonated (% 95 O 2/5% CO2 gaz karışımı), buz soğukluğunda mM Gey çözeltisi içinde (bileşim bekletmektir: 130 NaCl, 4.9 KCl, 1.5 CaCl2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2, O, 11 MgCI2 · 6H 2, O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8, Na 2 HPO 4 · 7H 2, O, 5 Glükoz · H2O, 25 HEPES, 22 NaHCO3, pH 7.32) 30 dakika boyunca 1,2,10,16. </li><li> Entorhinal korteks beyincik ve parçasını çıkarın. Daha sonra medial yüzeyi üzerinde her yarımkürede aşağı yerleştirin, bir mid-sagital kesim ile kortikal hemisferlerdir ayırın. Bundan sonra yapmakHer yarımkürede 13,14 dorsal kenarı boyunca 50-70 ° kesim (50-70 ° enine). </li><li> Kesit sistemin dilimleme platformda taze kesilmiş yüzeyi ile her yarımkürede Tutkal. Platform precarbogenated buz soğuk Gey çözümü ile kaplanmış olmalıdır. </li><li> Z-ekseni salınımı en aza indirmek için ayarlanmış bir vibratome kullanarak yan posterior anterior 350 mikron 50-70 ° enine dilim kesin. Hipokampal oluşumda, subiküler ve entorinal kortekste gibi hipokampusa Dorsolateral bulunan korteksleri deneyler 13,14 için kullanılan dilimlerin bir parçası olacaktır. </li><li> U-şekli ve batırılmış tipte inkübatöre hipokampal dilimler aktarın ve carbogenated yapay serebrospinal akışkan (ACSF mM içeren 32 ° C&#39;de en az 2 saat süreyle inkübe edin: 2H ​​2, O, 1,5 MgSO ^ · 110 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 Glukoz · H 2, O, 27.4 NaHCO 3, pH 7.3) 1,2,10,16. </li></ol> 2. Elektrotların Konumlandırma, Temel Kayıt ve LTP indüksiyonu <ol><li> Mikroskop altında monte edilmiş bir batırılmış tipte kayıt odasına hipokamp dilim aktarın. 32 ° C&#39;de en az 30 dakika boyunca carbogenated ACSF (6-7 ml / dak) perfüze. </li><li> (Uç direnci M? 3-5 olan) ACSF ile dolu cam kılcal Mikroelektronlar hazırlayın. </li><li> Uyarımı ve fEPSP için CA1 stratum radiatum kayıt 1,2,10 (Şekil 2) CA1 Schaffer kollateral-liflerde ACSF ile dolu bir cam Mikroelektronlar yerleştirin. Elektrotlar arasındaki mesafe yaklaşık 300 um olmalıdır. </li><li> 3-4 V arasındaki bir aralıkta iki fazlı dikdörtgen akım darbelerinin (200 ms / kutup) ile Schaffer kollateral liflerin-uyarılması ile alanını uyancı postsinaptik potansiyeller (fEPSPs) uyandırmak </li><li> Inp ölçerek maksimum stimülasyon testi gerçekleştirinut-çıkış ilişkisi ve elde edilen maksimum fEPSP-eğim değerlerinin% 40 olarak uyarım gücünü tanımlamak ve deney boyunca sabit tutun. </li><li> Maksimum uyarma testi sonra en az 15 dakika boyunca başlangıç ​​kayıt başlayın. Deney boyunca her dakika uyaranlara test yanıtları ölçün. Düşük frekanslı stimülasyon ile bazal kayıtları gerçekleştirin. </li><li> En az 30 dakika boyunca temel kaydedin. </li><li> Geç-LTP indüksiyonu için yüksek frekansı 5 dk diziler arası aralık ile 100 Hz üç 1 sn uyaran trenler oluşan 100 Hz tetanization geçerlidir. CA1 bölgesinde 5 uM bicuculline içinde stimülasyon alanını artırmak için tetanization önce, 2 dakika ile yıkanabilir ve hemen geçen tetanization sonra yıkanmalıdır. </li></ol> LTP ve Yapış Donma İndüksiyonunun sonra Dilimleri 3. Koleksiyonu <ol><li> Dur LTP 2 dakika ya da Geç-LTP uyaran tetanik stimülasyon üç trenlerin 30 dakika sonra kayıt. </li><li&gt; elektrotlar ve hızlı bir şekilde kuru buz üzerinde yerleştirilmiş metal bir platform üzerine precold dilim aktarın. U-şekilli inkübatör tutulan bir kontrol dilim için prosedürü tekrarlayın. DİKKAT: eldiven kullanın kuru buz ile çalışırken. </li><li> -80 ° C de, 1.5 ml tüp ve mağaza her dilim toplayın. </li></ol> Hippocampus CA1 Bölgesi&#39;nden Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler 4. İzolasyonu <ol><li> -80 ° C donmuş dilimleri, 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpleri çıkarın ve buz üzerinde tutun. </li><li> Ekleme tüpüne taze soğuk TBS tampon çözeltisi ihtiva eden bir proteaz (PI) ve fosfataz (PS) inhibitörleri, 0.5 mi. 2-3 dakika inkübe ve stereomicroscope transfer. DİKKAT: koruyucu eldiven kullanın ve PI ve PS ile çalışırken bir laboratuvar önlüğü. </li><li> Iki iğne kullanılarak hipokampusun CA1 stratum radiatumdan, pyramidale bölgesini ayır. Stereomikroskop ve CA1 alanı kesmek için ikinci bir iğne altında tutulması için bir dilim iğne kullanın. </li><li> Disseke CA toplayın50 ul liziz tamponu ihtiva eden yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine (her bir grup için) 5 kesitlerden 1 bölgeleri (mM olarak içeren hipotonik liziz tamponu 1x: 10 HEPES, 1.5 MgCl2, 10 KCI, PI ve PS ile pH 7.9). Bu malzeme miktarı 2-3 imünoblotlarının çalıştırmak için yeterli olacağını unutmayın. </li><li> Aşağı dikkatli pipetleme up ve tarafından toplanan doku homojenize. 200 ul pipet kullanın. Hücre şişer izin vermek için 5-7 dakika boyunca buz üzerinde inkübe lizat. </li><li> , Lizatının 2 ul alır mikroskobik bir slayt üzerinde açılan ve parlak bir alan mikroskobu altında hücrelerin şişmesine görselleştirmek. Hücrelerin doğru şişmesi ile çekirdekler gibi yuvarlak sağlam yapıları görünür. </li><li> &#39;Homojenat fraksiyon &quot;olarak yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine 20 ul numune toplayın. 4 x SDS numune tamponu denatüre 8 ul ilave edin. </li><li> 1 dakika boyunca 11,000 rpm&#39;de santrifüje kalan lizatları. </li><li> Dikkatle, tr üst (&#39;Sitosolik kısım, M&#39;) &#39;süpernatan toplamakansfer yeni bir tüpe ve 4x numune tamponu 20 ul ekle. </li><li> , Hipotonik tampon maddesi, 60 ul pelletini ve 4x numune tamponu 20 ul ekle. Bu fraksiyon bir nükleer bakımından zengin kısım &quot;olarak adlandırılır. </li><li> Homojenat, sitosolik, nükleer veya zenginleştirilmiş kısımlar, daha sonra -80 ° C bağışıklık boyama için -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Synapto nükleer proteinlerin yarı kantitatif 5. Bağışıklık <ol><li> Örnekleri Defreeze ve 95 ° C&#39;de 5 dakika boyunca kaynatın. </li><li> Her parçadan 5 ul alın ve amido siyah testi veya BCA testi ile protein konsantrasyonu belirlemek. </li><li> SDS-PAGE üzerinde homojenattan protein örneklerinin eşit miktarda, sitoplazmik ve nükleer zenginleştirilmiş kısımlar yükleyin. Ve kontrol LTP kesitlerden örnekler doğrudan bir karşılaştırma için, aynı jel üzerine yerleştirilmelidir. </li><li> Standart Batı-kurutma işlemini gerçekleştirin (ıslak transferi önerilir). </li><li> T membranlar Probeo seçenek antikor. Nörona özgü enolase2 (NSE2) ve nükleer işaretleyici - - Neun bir yükleme kontrolü olarak bir p-aktin antikor daha sonra aynı blotlar (veya aynı anda paralel ölçüm), sitoplazmik bir işaretleyici ile problanabilir. </li></ol> 6. Veri Analizi <ol><li> LTP indüksiyon Verimliliği Clampfit yazılım ile analiz edilebilir. Bazal kayıtların ortalama eğim tetanization sonra yamaçları iki yönlü ANOVA, p kullanılması ile karşılaştırıldığında &lt;0.05 anlamlı farklılık olarak kabul edildi. FEPSP eğim değerleri ortalama ± SEM olarak şemalarda tasvir edildi </li><li> Immunoblotların ölçümü için, bir film ya da otoradyografik tarar ve bir Licor sistemi ile ImageJ veya flüoresan gruplar tarafından protein bantlarının yoğunluğu analiz entegre. Immunorekatif bantlar Değerleri yükleme ve kurutma kontrolü için normalize edilmelidir. Kontrolü karşılaştırması ve LTP gruplar için nonparametrical Mann-Whitney U-Testi kullanılmış olabilir. </li></ol><table border="0"cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Tamponun Adı </td><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon (mM) </td><td> Tutar </td><td> Yorumlar / Açıklama </td></tr><tr><td> Gey çözeltisi (pH: ~ 7.4 7.3) </td><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 7.6 gr </td><td> steril filtrasyon </td></tr><tr><td> 1000 mi </td><td> KCl </td><td> 4.9 </td><td> 0.37 gr </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl2 · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.22 gr </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 · 2H 2 O </td><td> 0.3 </td><td> 0.0739 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgCI2 · 6H 2 O </td><td> 11 </td><td> 2.24 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.23 </td><td> 0.0313 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Na 2 HPO 4 · 7H 2 O </td><td> 0.8 </td><td> 0,2145 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glukoz · H2O </td><td> 5 </td><td> 0,9909 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Hepes </td><td> 25 </td><td> 5.96 gr </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO3 </td><td> 22 </td><td> 1.85 g </td><td></td></tr><tr><td> ACSF (pH: ~ 7.4 7.3) </td><td> NaCl </td><td> 110 </td><td> 6.428 g </td><td> steril filtrasyon </td></tr><tr><td> 1000 mi </td><td> KCl </td><td> 2.5 </td><td> 0,1865 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl2 · 2H 2 O </td><td> 2.5 </td><td> 0.368 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.370 g </tD&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.24 </td><td> 0.169 gr </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glukoz · H2O </td><td> 10 </td><td> 1,9817 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO3 </td><td> 27.4 </td><td> 2,3 g </td><td></td></tr><tr><td> 1x Hipotonik tamponu (pH: 7.9) </td><td> Hepes </td><td> 10 </td><td> 0.23 g </td><td></td></tr><tr><td> 100 mi </td><td> MgCI2 · 6H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.0304 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KCl </td><td> 10 </td><td> 0,07455 g </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Tamponlar.

<ol><li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276(2011).</li>
<li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li>
<li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABA%28A%29+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldendrin-Jacob%3A+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34(2008).</li>
<li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li>
<li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li>
<li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+%28ERK%29+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li>
<li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+protein+shuttling%3A+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li>
<li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li>
<li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li>
<li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li>
<li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li>
<li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation%3A+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Yukarıdaki protokolün açıklanan adımlar, hipokampus akut genç ya da yetişkin farelerin dilimlenmiş hazırlamak dilim uyarılmış alanı neden ve kayıt LTP, hızla teşrih ve aktivite bağımlı protein dinamikleri incelemek için nükleer zenginleştirilmiş kısmını hazırlamak için nasıl rehberlik sağlamak. Bu yaklaşım, her biri birbirinden bağımsız bir şekilde kullanılan birçok farklı yöntemlerin kombinasyonu kaynaklanmaktadır. Biz bir iş akışını optimize edilmiş ve LTP indüksiyonu üzerine proteinlerin hücre içi yeniden dağıtılması...

Sinaptik N-metil-D-aspartat-reseptörler (NMDARs) sinaptik plastisite ve hücre hayatta kalma ve nörodejenerasyonunun hücre ölümünü nasıl tetikleyebildiği extrasynaptic NMDARs aktivasyonu ise sinyal çok önemli bir rol oynar. Bu değişiklikler sıkı kontrol / düzenlenmiş bir faaliyet bağımlı gen ifadesine bağlı ve böylece aktif sinaps veya dendritler ve nükleus 7 arasında sürekli iletişim gerektirir. MAP ERK1 / 2 sinyalizasyon sinaptik NMDARs alt baş gerçekleştirmekle ve extrasynaptic NMDAR yoluyla sinyalleme yapan hiç ya da ERK1 / 2 aktivitesi 8,11 üzerinde inhibe edici bir etkiye sahiptir, oysa, NMDAR-aktivasyonu ile uyarılan gen sentezlenmesine katılan edilir kinaz. Distal dendrit ve çekirdeği arasındaki transfer gösterilmiştir proteinler vardır. Bu proteinlerin çoğu bir nükleer lokalizasyon sinyali içerir ve aktif olarak çekirdeğe bir 6,9 ve dinein importin bağımlı bir şekilde, mikrotübülün boyunca taşınmaktadır. InterestinglY, belirli bir sinaptik uyarıcıya tepki olarak çekirdeğe Bu taşıyıcı maddelerin bazıları için yalnızca bir geçiş. Örneğin, siklik AMP tepki elemanı bağlayıcı protein 2 (CREB2) retrograd nakil aracı kimyasal LTD, fakat LTp 12 tarafından indüklenir. Lokalize NMDAR-bağımlı uyarma sinaptik uzun vadeli plastisite hipokampal 4 katılır çekirdeği, bir translokasyon süreç içine CREB düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici (CRTC1) tahrik eder. Son zamanlarda protein haberci Jacob hem sonra nükleus, sinaptik ve extrasynaptic NMDAR aktivasyonu için translocates ve CREB&#39;ye bağımlı gen transkripsiyonunu 5 düzenler olduğu gösterilmiştir. Sinyalinin sinaptik veya extrasynaptic kökenli Jacob bir sonrası modifikasyon kodlanmıştır. Sinaptik aktivitesi primer hipokampal kültürdeki çekirdeğe translokasyonu açısından daha sonra gerekli bir konumda olan 180 (pJacobS 180) açısından çok önemli bir serin bir Yakup&#39;un ERK1 / 2 bağımlı fosforilasyonunu uyanr. Ayrıca, in CA1 Schaffer kollateral LTP sonra çekirdeğe akut hipokampal dilimlerin pJacobS 180 translocates nöronlar değil 1,10 LTD. pS180 Jacob plastisite ilişkili genlerin ifadesindeki artışa neden olur ve bu gen ekspresyon sinaptik fonksiyon geri beslenir. Extrasynaptic NMDARs aktivasyon Ser180 fosforilatlanır değildir ve neden çekirdekte farklı bir protein kompleksi ile ilişkili olabilir sonra çekirdeğe translocates tezat, Jacob &#39;CREB&#39;ye kapatmak&#39; ve sinaptik bağlantıları 10 bir geri çekilme. Synapto-nükleer protein haberci nükleer ithalatına En yayınlanan çalışmalar, ayrışmış nöronal primer kültürlerinde yapılmıştır. Nöronal bağlantı ve fonksiyon çok daha iyi korunmuş olduğu, bu nedenle bu bulgular hipokampal dilimleri kullanarak fizyolojik daha uygun koşullar çoğaltılamaz görmek ilginç olacaktır. Burada LTP-de değerlendirmek için optimize edilmiş bir protokol mevcutimünoblotlama protein haberciler nükleer translokasyonunu pendent. Bu yöntem aynı zamanda bu basit bir nükleer fraksiyonda proteinin aktivitesine bağlı fosforilasyonunun analizi için uygundur. Özel olarak, mevcut protokolü akut, CA1, hipokampüse ait kesitler indüksiyonu ve LTP kayıt hazırlanmasını da kapsar. Sonraki CA1 bölgesi mikroskobik uyarılmış bölgeyi izole etmek için disseke edilir. Biz kombine ve Zhao ve arkadaşları 17 tarafından tanıtılan değişiklikler ile CellLytic nükleer Ekstraksiyon Kiti tarafından sağlanan nükleer izolasyonu için protokol değiştirilmiş. Optimize edilmiş prosedür, hücre şişmesi ve çekirdekler salımını sağlayan, hipotonik tampon maddesi içinde kesildi CA1 bölgelerin lızız ışlemını içermektedir. Hücre lizizi, ve çekirdekler morfolojisi mikroskopik inceleme ile tespit edilebilir. Nükleer zenginleştirme kısa bir santrifüjleme adımı ile elde edilir. Neun ve NSE2, nükleer veya sitosolik fraksiyonlar özel markörler, karşı antikorlar ile immunoblotting analizi bu yaklaşım hızlı bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedirve tekrarlanabilir protokolü bu hücrealtı kesirler izole etmek ve protein fosforilasyonu gibi çok kararsız öteleme sonrası modifikasyonları çalışma. Buna ek olarak, bu yöntem, hipokampal dilimler kesilmiştir CA1 bölgelerinden kaynaklanan küçük bir doku numuneleri için avantajlıdır ve hipokampal dilimler immünohistokimya ile kombinasyon halinde de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>CED 1401 AD/DA dönüştürücü</td><td>Cambridge Electronics Design, İngiltere</td><<td></td><td></td></tr><tr><td>a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomikroskop</a></td><td>Leica S4E, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrotom</td><td>Leica VT1000S, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzole nabız stimülatörü</td><td>A-M Sistemler, ABD</td><td></td><td>Model 2100</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE sistemi</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğutucu</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parlak alan Mikroskobu</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td>Thermo Electron Corporation</td> Mikromanipülatör <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann, SM-5, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kurutma odası ve elektrik enerjisi tedarikçisi</td><td>Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Batık tip kayıt odası</td><td>özel yapım</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-şekilli ve batık tip inkübatör&nbsp;</td><td>ısmarlama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük cerrahi makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik Pastör pipeti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik kültür kabı &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen beher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.3957.1</td><td>&ge; %99,5, pa, ACS, ISO</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth Art</td><td>.-Nr.6781.1</td><td>&ge; % 99,5, pa, ACS, ISO</td></tr><tr><td>CaCl < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; 2H < alt > 2 < / alt >O</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>pro analizi</td></tr><tr><td>MgSO<alt > 4< / alt > ve orta nokta; 2H2O</td><td>Merck</td><td>5886.05</td><td>pro analizi</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>AppliChem</td><td>CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:</td><td>Moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>2320946 KH2PO 4</td><td>Merck</td><td>12034.025</td><td>moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>Na2HPO4 ve orta nokta; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1.06574.1000</td><td>ekstra saf</td></tr><tr><td>Glikoz ve orta nokta; H2O</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6887.1</td><td>moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.9105.4</td><td>PUFFERAN, &ge; %99,5, yıllık</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.1000</td><td>pro analizi</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfostop</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Tocris Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antikorlar</td></tr><tr><td>Birincil antikorlar</td><td>Şirket</td><td>Katalog</td><td>Numarası Tür</td></tr><tr><td>pJac-s180 Biogenes</td><td></td><td></td><td>tavşan (1:100 seyreltilmiş)</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Milipore</td><td>MAB377</td><td>fare (1:1.000 seyreltilmiş)</td></tr><tr><td>NSE</td><td>Hücre Sinyali</td><td>D20H2</td><td>tavşan (1:1.000 seyreltilmiş)</td></tr><tr><td>Beta-aktin</td><td>Sigma</td><td>A-5441</td><td>fare (1:5.000 seyreltilmiş)</td></tr><tr><td>İkincil antikorlar</td><td>Şirket</td><td>Katalog Numarası</td><td>Tür:</td></tr><tr><td>IgG HRP konjuge</td><td>DAKO</td><td></td><td>keçi anti-fare (1:5,000)</td></tr><tr><td>IgG HRP konjuge</td><td>NEB</td><td></td><td>keçi anti-tavşan (1:5,000)</td></tr></tbody></table>

hipokampal dilimleri adlı ca1 nükleer zenginleştirilmiş kesirler izolasyonu synapto-nükleer messenger proteinler etkinliği-bağımlı nükleer İthalat okuyacak

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Öğrenim aktivitesine bağlı protein ekspresyonu, hücre-altı yer değiştirmesi, ya da fosforilasyon sinaptik plastisite altında yatan hücresel mekanizmaların anlaşılması önemlidir. Uzun vadeli potansiyelleri (LTP) ve akut hipokampal dilim bağlı uzun süreli depresyon (LTD) yaygın öğrenme ve hafızanın hücresel modelleri olarak kabul edilir. Etkinlik bağımlı protein dinamikleri görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme veya immünohistokimya yaklaşımları kullanmak birçok çalışma bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemler tek nöronlarda floresan-etiketli proteinlerin immünolojik hücre ya da aşırı dışavurumu için antikorların uygunluğu dayanır. Proteinlerin İmmünoblotting bulguların bağımsız onay veren bir alternatif yöntemdir. Bireysel tetanized hipokampal dilimlerde sub-hücresel fraksiyonları hazırlanmasında ilk sınırlayıcı faktör, malzemenin düşük miktarıdır. İkinci olarak, işleme yöntemi çok önemlidir l, hatta çok kısa bir küçük ve manipülasyon içindilimleri Iving belirli sinyal silsileleri uyarmamaktadır olabilir. Burada fare beyninden akut hippokampüs kesitlerinin CA1 bölgesinde yeterli saflıkta nükleer bakımından zengin kısım için yeterli malzeme elde etmek için bir optimum iş akışını açıklar. Temsili bir örnek olarak, synapto-nükleer protein haberci ERK1 / 2 fosforlu şekli Jacob aktif LTP indüksiyonu üzerine çekirdeğe doğru yer değiştirir ve CA1 nöronlarının bir nükleer bakımından zengin kısım tespit edilebileceğini göstermektedir.

Daha önce synapto-nükleer protein haberci Jacob LTP indüksiyonu değil, LTD 1 Aşağıdaki çekirdekte birikmektedir göstermiştir. Ayrıca, sinaptik stimülasyonu sonrası Yakup&#39;un translokasyon Ser180 (Şekil 1) MAPK ERK1 / 2 aktivasyonunu ve Yakup&#39;un fosforilasyonu gerektirir. Fosforile edilmiş Jacob bir importin bağımlı bir şekilde çekirdeğe doğru yer değiştirir ve fosforile durum 15 αinternexin ara filaman ile birlikte (Şekil 1) uzun süreler boyunca muhafaza edi...

Biz, hipokampusun CA1 bölgesinde ve dilimin tetanized alan nükleer zenginleştirilmiş kısımların daha sonraki izolasyon Uzun süreli potansiyasyon indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yaklaşım, önemli aktivitesini öğrenme ve hafıza ile hücresel modellerinde bağımlı nükleer protein alma belirlemek için kullanılabilir.

Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Bu deneyin genel amacı, nöronal bağlantıların ve fonksiyonların iyi korunduğu akut hipokampal dilimler kullanarak proteinlerin aktiviteye bağlı nükleo-sitoplazmik taşınımını incelemektir. Bu amaca ulaşmak için, öncelikle yetişkin bir erkek sıçanın hipokampusu izole edilir ve ikinci bir adım olarak akut transvers dilimler hazırlanır. Hipokampal dilimler kayıt odasına aktarılır ve CA1 stratum radiatum bölgesinde LTP'nin geç formu indüklenir. Ardından, potansiyel hale getirilmiş ve kontrol dilimleri hızlıca dondurulur ve daha sonraki immünoblot analizi için nükleer olarak zenginleştirilmiş fraksiyonu izole etmek amacıyla stimüle edilen CA1 bölgeleri diseke edilir.Western blotting analiziyle elde edilen sonuçlar, LTP indüksiyonundan 30 dakika sonra potansiyelize edilen ve kontrol kesitleri arasındaki nükleer fosfoprotein seviyelerinde farklılıklar olduğunu göstermektedir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler iki nedenden dolayı zorlanacaklardır. Birincisi, doku örneğinin düşük miktarı; ikincisi ise, çekirdeklerin salınımına izin veren hipotonik lizis tamponu içinde örneklerin lizis süreci için gereken kritik zaman dilimidir. Hipokampus canlı preparasyonu ve CA1 bölgesinin izolas

isolation-ca1-nuclear-enriched-fractions-from-hippocampal-slices-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Bu video, fare hipokampal beyin dilimlerinde uyarıcı sinaptik akımların mikroRNA aracılı inhibisyonunu göstermektedir. CA3 nöronları, bir floresan raportörü eksprese etmek için bir yapıyı, ışıkla aktive olan bir membran kanalını ve voltaj kapılı kalsiyum kanallarının ekspresyonunu aşağı regüle eden bir mikroRNA'yı barındıran rekombinant bir viral vektör ile enfekte edildi. Bir kayıt odasına bir dilim yerleştirildikten ve bir CA1 nöronunu bir kayıt pipeti ile yamaladıktan sonra, ışıkla aktive...

Fare Hipokampal Dilimlerinde Uyarıcı Postsinaptik Akımların MikroRNA Aracılı İnhibisyonu

Proteinlerin lokalizasyonu ve dağıtım onların hücresel fonksiyonları anlamak için önemli bilgiler sağlar. Elektron mikroskobu üstün çözünürlük uzaysal (EM), belirli bir antijen aşağıdaki immünohistokimya hücre içi lokalizasyonu belirlemek için kullanılabilir. Sürdürmek antijenite EM araştırmalarda özellikle zor olmuştur süre yapısal bütünlüğünü koruyarak merkezi sinir sistemi (MSS), dokular için. Burada, çalışma MSS yapılar ve antijenleri korumak ve sıçan hipokampal CA1 piramidal nöronlarda...

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Bu video makalesinde, kemirgenlerden alınan akut hipokampal dilimler kullanılarak CA1 piramidal nöronlarında sinaptik etiketleme, yakalama ve çapraz etiketleme gibi uzun vadeli plastisiteyi ve ilişkisel süreçlerini incelemek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Kemirgenler gelen akut Hipokampal Dilimleri kullanarak Synaptic Etiketleme / yakalama ve Çapraz yakalama İncelenmesi

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Bu iletişim kuralı oksijen seviyesini geri dönüşümlü arabellek küçük bir hacim ve etkinlik bağımlı sinaptik plastisite batık akut Hipokampal dilimler halinde kayıt metodolojik açıdan istikrar açıklar.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Elektrokonvulsif nöbet (ECS) Elektrokonvulsif terapi şiddetli depresyon için bir deneysel hayvan modeldir. ECS synaptogenesis ve sinaptik plastisite yol hipokampüs, faaliyet genel olarak uyarır. Burada, ECS indüksiyon Sıçanlarda nöbet kaynaklı sinaptik protein değişimler incelemek için kendi hippocampi hücre altı ayırma yöntemleri açıklanmaktadır.

Elektrokonvulsif nöbetler fareler ve onların Hippocampi ayırma nöbet kaynaklı değişiklikleri postsinaptik yoğunluğu proteinlerde incelemek için

Burada özetlenen protokolünü ayirt analizi, biocytin kurtarma ve hücre içi elektrofizyolojik kayıtlar in vitro nöron izin takip hipokampal CA2 interneurons yüksek kaliteli rekonstrüksiyonlar açıklar karakterizasyonu ve belirlenmesi için sonuçta iyi nöronal anatomisi.

Biocytin kurtarma ve dolgulu hipokampal CA2 Interneurons 3D rekonstrüksiyonu

Bu makale, farelerde yatay hipokampal beyin dilimleri elde etmek için sistematik bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodolojinin amacı, dentat girus ile ilgili nörolojik süreçleri değerlendirmek için perforant yol ve yosunlu lif yolu gibi hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaktır.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Öğrenin hipokampal dilimlerde uzun süreli potansiyasyon indüksiyonu ve nükleer zenginleştirilmiş fraksiyon izolasyonu yöntemini. Bu teknik, aktiviteye bağımlı protein taşınmasını incelemek için kullanılır.

Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak (Video) | JoVE Journal

Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak

Daha fazla video keşfet