Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi

Bu prosedürün genel amacı, hızlı ve kantitatif bir in vitro yöntem kullanarak anjiyogenezde rol oynayan genleri veya yolakları belirlemektir. Bu işlem, öncelikle analizden bir gün önce primer veya ölümsüzleştirilmiş endotelyal hücrelerin serum açlığına maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, endotelyal hücrelerin 30 dakika boyunca kalsin ile inkübe edilmesi ve ardından hücrelerin PBS ile yıkanmasıdır.

Ardından, endotel hücreleri tripsinizize edilir, topakları gidermek için filtrelenir ve sayılır. Son adım, endotel hücrelerini olası anjiyojenik faktörler içeren kondisyonlu medyum ile birleştirmek ve bunları katılaşmış bazal membran ekstraktı üzerine dağıtmaktır. Sonuç olarak, tüp ağlarını görselleştirmek için ışık veya floresan mikroskobu kullanılır ve bu ağlar daha sonra özel bilgisayar programları kullanılarak nicelleştirilebilir.

Bu tekniğin anjiyogenez testi için kullanılan diğer yöntemlere göre temel avantajı; kurulumunun kolay olması, nispeten düşük maliyetli olması, saatler içinde tübüller oluşturması ve bu tekniğin gösterildiği şekilde nicelendirilebilir olmasıdır. American University biyoloji bölümünde lisansüstü öğrencisi olan Erica Bullwinkle, uygun medyayı kullanarak assay'e başlamadan iki gün önce üç B 11 hücresini yeni bir flaska transfer eder; en iyi sonuçlar için hücreler kullanıldığında ikinci ve altıncı pasajlar arasında olmalıdır.

Ardından, hücreleri desteklenmiş dmm içerisinde 24 saat boyunca büyütün. Hücreler hazır olduğunda, serum açlığına bırakılırlar. Besiyeri, düşük serumlu besiyeri ile değiştirilerek serum açlığına bırakılmış hücreler ek bir 24 saat daha büyütülür.

En iyi sonuçlar için, BME stok çözeltisinin konsantrasyonunun 10 mg/mL olduğunun üreticiden teyit edilmesi önemlidir. İndirgenmiş büyüme faktörü BME'yi buzdolabında çözdürün. BME ısındığında katılaştığı için kullanım öncesinde soğuk tutulur.

Ardından, floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntüleme için assay'de gerekli olan medyumu çözün; medyuma final konsantrasyonu 2 µg/mL olacak şekilde calcein AM ekleyin. Calcein AM ile işaretlenen hücreleri yaklaşık 30 ila 45 dakika boyunca karanlıkta bekletin. Bu sürenin sonunda, medyumu uzaklaştırın ve 3B11 hücrelerini DPBS ile yıkayın. Daha sonra, 1 mL tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri tripsinizleyin. Tripsinizleme işlemi tamamlandıktan sonra.

Hücreleri 10 mililitre nihai hacme ulaşacak şekilde resüspande edin. Takviyeli dmm içinde, hücreleri 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek topaklanmaları giderin. Hücreleri saydıktan sonra, tüp oluşum testi için uygun nihai konsantrasyona getirerek resüspande edin ve soğutun.

Yüklemeden 20 ila 30 dakika önce 24 kuyucuklu bir plaka ve bir mililitrelik uçlar hazırlanır. Bu, BME'nin başlama zamanı geldiğinde vaktinden önce katılaşmasını önler; 24 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 250 microliters indirgenmiş büyüme faktörü BME pipetleyin. Pipeti son durağına kadar bastırmayarak hava kabarcığı oluşmasını önleyin.

Pipetleme sırasında, kuyucuklar doldurulduktan sonra, kuyucuğun merkezinde yeterli miktarda BME kaldığından emin olmak için kontrol edin. Menisküs oluştuğunda, matris çok inceyse hücreler yalnızca bir monotaba oluşturacaktır. Ardından, BME'nin katılaşması için plakayı 30 dakika boyunca inkübe edin.

BME donduktan sonra, yaklaşık 300 mikrolitre kondisyonlu medyumu 10 mikrolitre resüspande edilmiş three B 11 hücresi ile karıştırın ve hücre süspansiyonunu plaka kuyucuklarına paylaştırın. Plaka inkübatöre yerleştirildikten sonra iki ila dört saat içinde tüpler oluşmaya başlayacaktır; kondisyonlu medyumdaki anjiyojenik faktör konsantrasyonuna bağlı olarak pik tüp oluşumu üç ile 12 saat arasında gerçekleşebilir. Analiz zamanlamasının, bireysel çalışma koşullarına göre optimize edilmesi gerekecektir.

Tüpler genellikle 18 saat içinde bozulmaya başlar ve endotel hücreler, tüp oluşumunun zirve yaptığı sırada apoptoza girer. Tüp ağını bozmamak için kuyucuktaki medyumu dikkatlice aspire edin. Ardından, anlık görüntüleme için her bir kuyucuğu 1 mL DPBS ile yıkayın.

Her kuyucuğa bir mililitre taze DPBS ekleyin ve daha sonraki görselleştirme için bir tüp ağı sabitlemek amacıyla tüp ağını konfokal mikroskop altında görüntüleyin. Aspire edilen her kuyucuğa %4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Paraformaldehidi uzaklaştırdıktan sonra DPBS ile iki kez yıkayın ve ardından her kuyucuğa bir mililitre taze DPBS ekleyin. Bu görüntüler, fare keratinositleri veya fibroblastları tarafından salgılanan anjiyojenik faktörlerin tüp oluşumunu indükleyebildiğini göstermektedir.

Zamanla endotel hücreler göç eder ve ekimden sonra bir ila iki saat içinde küçük dallar oluşturmaya başlar. Maksimum tüp oluşumuna dört ila altı saatte ulaşılmıştır. 24 saat itibarıyla bazı dallar kalmış olsa da hücrelerin çoğu apoptotik hale gelmiş ve tüpler birbirinden ayrılmaya başlamıştır.

Hücre sayısı, tüp oluşumu üzerinde derin bir etkiye sahiptir. Yetersiz sayıda hücre ekildiğinde az sayıda tüp oluşur ve ağ minimal kalır; daha fazla hücre ekildikçe tüp ağı daha kapsamlı hale gelir. Ancak, çok yüksek konsantrasyonlarda hücreler kümelenmeye veya monokatmanlar oluşturmaya başlar ve tedavi grupları arasındaki farklar maskelenir; yeterli tüp oluşumunu sağlamak için hücrelerin en az iki pasajdan geçmiş olması gerekir.

Üç B 11'in büyüme hızı öylesine hızlıdır ki, hücrelerin %25'inin bir günlük pasajı, ertesi gün konfluen bir flask verecektir. Burada, toplam düğümleri, ağ içindeki tüpleri kombinasyon halinde ve ağ üzerindeki birleşmiş yapıları tespit etmek için calcine AM boyalı tüp ağı üzerinde anjiyogenez eklentili Image J kullanılır. Ek olarak, bu program; nicelleştirilebilen düğümleri, tüpleri veya ağları ayrı ayrı tespit etmek için de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yaygın hatalardan kaçınarak in vitro anjiyogenez işleminin hızlı ve güvenilir bir şekilde nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.