Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

Bu prosedürün genel amacı, bir atomik kuvvet mikroskobu kullanarak bitki dokularının mekanik özelliklerini haritalamaktır. İlk olarak, ince bir aros filmi oluşturmak için sürgünün kazınmış bir bölgesine düşük erime sıcaklığına sahip bir aros damlası pipetleyerek cam slaytları hazırlayın. İkinci adım, numuneyi incelemek ve monte etmektir.

Çiçek tomurcuklarını gövdeden çıkarın, marris sapını gövdeden kesin ve kesilmiş sapı hemen camın üzerindeki ince Agros filmine gömün. Sonraki kaydırın, Maris gövdesi Aros filmine gömüldüğünde oluşan çatlağı doldurmak için yeterince erimiş montaj agrosu ekleyin. Son adım, veri toplama için atomik kuvvet mikroskobunu kurmaktır.

Sonuç olarak, görünür Young hücre duvarı modülünün veri analizi ve ölçümleri, hücre duvarlarının özelliklerinin aynı anda hücre altı çözünürlüklerde ve dokunun tüm bölgelerinde mekanik bir haritasını oluşturur. Bu tekniğin mevcut yönteme göre en büyük avantajı, hücre duvarının mekanik özelliklerini aynı anda hücre altı çözünürlükte ve dokunun tüm bölgesinde ölçebilmesidir. Numuneleri gömmek için Aros ortamı, suda% 10 mannitol içinde% 0.7 düşük erime sıcaklığından hazırlanır.

Matkap ucu gibi güçlü bir metal alet kullanarak, bir mikroskopi camının ortasında 0,5 x 0,5 santimetrelik bir alanı aşındırın. Slayt: Bu, agros ortamının slayta yapışmasını veya sabitlenmesini sağlamak için agrosun yapışmasını kolaylaştırmak için yüzeyi pürüzlendirir. Pipeda damlası yaklaşık 20 mikrolitre gömme agros ortamı cam slaytın kazınmış bölgesine yerleştirilir.

Bu, ince bir agros filmi üretir. Cam slaytı nemli bir kutuda saklayın ve Agros ortamının Arabidopsis'ten alınan numuneleri katılaşmasını bekleyin. Ana, meristem örneklerini hazırlamak için atomik kuvvet mikroskobu için kullanılacaktır.

Çiçek tomurcuklarını ultra ince cımbızla aşağı çekerek gövdeden tek tek çıkarın. P tek aşamalı primor olarak bilinen sekel göstermeyen tomurcuklara kadar tüm çiçek tomurcuklarının çıkarılması önemlidir. Bir tıraş bıçağı veya cımbızın ucunu kullanarak meristemi gövdeden kesin.

Kesim, atomik kuvvet mikroskobu veya bir FM ile ölçülecek olan meristem yüzeyinin bölgesine paralel olmalıdır. Elde edilen apeks, deney sırasında parçalanmaması için 300 mikron ile 600 mikron arasında olmalıdır. Apeksi hemen daha önce hazırlanmış olan ince aros media filminin içine itin. Cam sürgü veya aros üzerinde bir konum seçin ve meristem hem cam sürgü ile doğrudan temas halinde olacak hem de arostan dışarı çıkacak şekilde hafifçe itin.

Agros, basınç uygulandığında kırılır, bu nedenle mari gövdesi şimdi bir çatlakta duracaktır. Marit sapını, gövdeden kesimlerini takip eden birkaç saniye içinde aros'a yerleştirmek çok önemlidir. Bu, MA gövdesinin kurumasını önler.

Aynı yükseklikte olmaları ve birbirlerinden 500 mikrondan daha az konumlandırılmaları koşuluyla, toplu görüntüleme için bu şekilde birkaç MA gövdesi hazırlanabilir. Slaytta, daha fazla numuneyi incelerken hazırlanan ma saplarını nemli kutuda tutun. Bir sonraki adıma geçmeden önce, meristem ve çiçek tomurcukları arasındaki sınırdaki fazla suyu nazikçe çıkarmak için filtre kağıdı kullanın.

Bu, erimiş agroların kılcal kuvvetler nedeniyle numuneyi su basmasını önlemek içindir. Daha sonra, daha önce oluşturulan çatlağı doldurmak ve her bir meristemi çevrelemek için yeterince erimiş montaj agrosunda 20 mikrolitrelik bir pipet ile aros, çıkarılan çiçek tomurcuğunun veya primor spor salonunun yara izi seviyesine ulaşmalıdır. Bunu başarmak için, çatlağın her iki ucuna agros eklemek gerekebilir.

Agros eklendiğinde, hızla çatlağa akacaktır. Pipeti kullanarak, me sapının sürgü üzerindeki en yüksek nokta olduğundan emin olmak için erimiş montaj agroslarının bir kısmını aspire edin. Bu, me sapını, kökler ve hipo yavrular için görüntüleme sırasında hareket etmeyecek şekilde sabitler.

Agros'un ince filminde diseksiyona gerek yoktur. Hazırlanan cam slayt üzerinde, camdaki bir aşındırmanın hemen üzerinde veya bir cam lamel boyunca bir oluk açmak için mikro cımbız kullanın, kökü veya hipo coddle'ı bu oluğa yerleştirin ve tutma uzunluğu boyunca camla temas halinde olduğundan emin olun. Me kök numunesi için gösterildiği gibi numunenin etrafına erimiş montaj agroları ekleyin.

Bir JP PK nano sihirbazı. Bu gösteride bir FM kullanılmıştır. Bu prosedüre başlamak için, A FM'ye yuvarlak şekilli bir girintiye sahip bir konsol monte edin. Yarıçap, X, Y, Z çözünürlüğünü ve doğru ölçümün arşivlenebileceği girinti derinliğini belirleyecektir.

Epidermis yüzeyindeki nano ölçekli ölçümlere meso almak için 50 nanometre yarıçaplı yuvarlak bir girinti kullanın. Orta ölçekli ölçümler yapmak için 0,5 mikron yarıçaplı yuvarlak bir girinti kullanın ve iki ila üç hücre arasında mikro ölçekli ölçümler almak için 2,5 mikron yarıçaplı yuvarlak bir girinti kullanın, lazeri konsolun ucuna yerleştirin. Aynayı kullanarak lazeri tutsakın ortasına hizalayın.

A FM yaklaşımının altına, bir voltluk ayar noktası hedefi olan temiz bir cam yerleştirin, spektroskopi için seçin. Maksimum bağıl ayar noktasını iki volta, uzatma hızını saniyede 40 mikrona ve Z uzunluğunu beş mikrona ayarlayarak bir girinti yapın. Kalibrasyon yöneticisi menüsünden, hassasiyete uyacak şekilde ileri eğrinin doğrusal kısmını seçin.

Uygun aralığı seç düğmesini kullanarak, bağıl ayar noktası 200 mikrolitre% 10 manitol çözeltisinde hacimden metreye dönüştürülmelidir. Konsol ucunun altında, aynayı kullanarak lazeri tutsakın ortasına yeniden hizalayın ve saygıyı hareket ettirerek kalibrasyon yöneticisi menüsünden hassasiyeti yeniden kalibre edin. Bilinmeyen düğmeye tıklayın, dört spektroskopi seçin ve daha önce gösterildiği gibi bir girinti yapın.

Bu prosedürü başlatmak için uygun aralığı seç düğmesini kullanarak hassasiyete uyacak şekilde ileri eğrinin doğrusal kısmını seçin, monte edilmiş numuneleri A FM'nin altına yerleştirin ve numunelerin üzerine 500 mikrolitrelik bir damla %10 manitol çözeltisi ekleyin. Manitol çözeltisi, hücreleri dakikalar içinde plazmalar, 200 nano Newton'luk nispi bir ayar noktası ile göçükte 20 nano Newton'luk ayar noktası hedefine yaklaşır ve saniyede 40 mikronluk hızı ve beş mikronluk Z uzunluğunu uzatır. 100 nanometreye monte konsol için 200 nanometre veya bir mikron için 0,5 mikronluk bir girinti elde etmek için göreceli ayar noktasını ayarlayın.

Beş mikron monte edilmiş konsol kuvveti haritalama modu. Hipokoslar için 64 x 64 çözünürlüğe sahip 70 x 70 mikron mar sapları ve 64 x 64 çözünürlüğe sahip 100 x 100 mikron kökleri için taranacak bir bölge seçin. Deneyleri başlatmak için tara'ya basın, çıktıyı kaydedin.

Veri dosyasını veri analizi yazılımında açarak başlayın. Ardından toplu işlemeyi seçin. Aynı analizi tek bir haritanın tüm eğrilerine uygulamak için.

Girinti derinliğini çıkarmak için konsolun bükülme yüksekliğini doğru seçin. Young'ın modül sığdırma işlevini seçin. Bu, kuvvetin girinti alanıyla orantılı olduğunu varsayar.

Girinti şeklinin bir parabol olduğunu varsaymak için uç şeklini parabolik olarak ayarlayın. Ucun yarıçapını belirtin. Ardından, analiz için geri çekme eğrisini seçin.

Geri çekme eğrisi, topografyaya daha az duyarlı olduğu için xtend eğrisine göre tercih edilir. Poso oranını 0,5 olarak ayarlayın. Son olarak, üzerine basın, çıktıyı analiz edin ve kaydedin.

Çiçek Mars saplarının, genç ve yaşlı hipo yavrularının ve kök MA gövdelerinin tipik A FM genç modüler haritaları tüm deneylerde burada gösterilmiştir. Sözleşme yarım küre şeklindedir, ancak yarıçapı farklıdır, böylece farklı uzamsal çözünürlükler elde edilebilir. Bu haritalar, 50 nanometre yarıçaplı ve 50 nanometre derinlik girintili mezodan nano ölçekli girintilere sahip tipik sonuçları göstermektedir.

Kardiyograf, hipokodal epidermal hücrelerin yüzey hücre duvarlarındaki mikro ölçekli heterojenlikleri ortaya koymaktadır. Ayrıca, çiçek meristemi, hipo coddle ve kök için 500 nanometre derinlik girintilerine sahip 500 nanometre yarıçaplı orta ölçekli girintiler için tipik sonuçlar da gösterilmiştir. 500 nanometre derinlik girintilerine sahip 2,5 mikron yarıçaplı mikro ölçekli sözleşmeler için bu kardiyograf, herhangi bir görünür büyümeden önce organ başlatma sırasında doku yumuşamasını ortaya çıkardı.

Bununla birlikte, numune yüksekliğindeki aralığın A FM'nin maksimum Z aralığını aşması nedeniyle bu tarama iptal edildi. Yanlış sabitleme nedeniyle deney sırasında numune hareketi, burada gösterildiği gibi bulanık bir taramaya neden olabilir. Agros ile kaplı bölgeler de bu örnekte gösterildiği gibi düzgün bir şekilde ölçülemez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir.