Name: Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Keşfedin bitki dokularının mekanik özelliklerini atomik kuvvet mikroskobu ile haritalama yöntemini. Bu teknik, hücre duvarı elastikliğini doku ve hücresel çözünürlükte ölçerek gelişim süreçlerini anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz birçok yararlı tartışmalar için Yves Couder özel şükrediyoruz. Biz dirseklerin ve tartışma kalibrasyonu için Aymen Asnacios teşekkür ederim. Biz eleştirel okuma Lisa Willis, Elliot Meyerowitz ve Oliver Hamant teşekkür ederim. Bu çalışma İnsan Frontier Bilim Programı hibe RGP0062/2005-C tarafından kısmen finanse edildi; Agence Nationale de la Recherche&#39;&#39;&#39;&#39; Growpec&#39;&#39; ve&#39;&#39; Mechastem projeler.

1.. Örnek Montaj için cam slaytlar hazırlayın <ol><li> Agaroz ortam gömülmesinin hazırlanması:% 10 manitol (su içinde) içinde% 0.7 düşük erime noktalı agaroz. </li><li> Güçlü bir metal alet (örneğin matkap ucu, kireç) kullanılarak, bir mikroskop cam slayt merkezinde 0.5 x 0.5 cm bölgeyi etch. Veya bunun yerine, Araldite yapıştırıcı kullanarak cam slayt cam yapraklardan (yaklaşık 20 x 200 mm) küçük bir parça tutkal. Not: Bu sağlamak için agaroz yapışmasını kolaylaştırmak amacıyla yüzeyi pürüzlü olduğu slayt agaroz ortam çubukları ya da giderir. Bu slayt yeniden kullanılabilir. </li><li> Cam slayt kazınmış bölge üzerine agaroz ortam gömülmesinin yaklaşık 20 | il bir damlacık yerleştirin. Bu agaroz ince bir film oluşturur. </li><li> Nemli bir kutu içinde cam slayt saklayın ve agaroz medya katılaşması için bekleyin. </li></ol> 2.. Meristem Örnekleri Diseksiyon ve Montaj <ol><li> Konfokal IMAGI için Microdissect meristemlering: ultra ince cımbız ile onları aşağı çekerek sapından çiçek tomurcukları tek tek kaldırın. Bu (P1 primordia 14 yani) sepals ememeyen tomurcukları tüm çiçek tomurcukları kadar kaldırmak için önemlidir. </li><li> Bir jilet veya cımbız ucu kullanarak, uzak sapından meristemi kesti. Kesilen AFM ile ölçülecek olan meristem yüzeyinin bölgesine paralel olmalıdır. Elde edilen apeks 300 um ve AFM ucu altında uygun yüksek 600 mm arasında olmalıdır. </li><li> Aşama 1.1.4 hazırlanan agaroz ortam filmin içine tepe itin. Cam slayt / agaroz bir pozisyon seçin ve meristem cam slayt ile temas hem de doğrudan ve agarozdan dışarı çıkıntı nazikçe böyle itin. Bu kök onun kesim takip birkaç saniye içinde agaroz meristemi konumlandırmak için çok önemlidir. Not: Bu kurutma gelen meristemi önlemek için olan. Bu aşamada, bir meristem CRAC ayakta edilecektirAgaroz basınç uygulanması üzerine kırık nedeniyle k. </li><li> Onlar aynı yükseklikte ve tek slaytta diğerinden az 500 mikron konumlandırılmış şartıyla, birkaç meristemleri toplu görüntüleme için bu şekilde hazırlayın. Bundan başka örnekleri kesme sırasında nemli kutu içinde hazırlanan meristemleri tutun. NOT: Bu kalibrasyon gelen değişimi sınırlayan. Her durumda, ideal olarak 2 örnekler hazırlanmış ve rasgele ölçülebilir. Şimdiye kadar ölçüm (stres kaynaklı cevap) toplu görüntüleme gözlenen herhangi bir etkisi yoktur. Bu agar ve / veya montaj çözelti içinde stres sinyal molekülleri seyreltme sayesinde olabilir. Alternatif olarak, stres tepkisi ne olursa olsun, hazırlanmış bir numune miktarı aynıdır. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, meristem ve çiçek tomurcukları arasındaki sınır kuru olduğundan emin olun. Değilse, hafifçe filtre kağıdı kullanılarak fazla su çıkarmak. Bu erimiş bir sonraki aşamada engellemelidiragaroz nedeniyle kapillarite kuvvetlere örnek sel. </li><li> 20 ul pipet ile, eklemek yeterli adım 1.2.3 oluşturulan çatlak doldurmak için agaroz montaj eridi. ve her bir meristemi çevreleyen. Agaroz kaldırılan çiçek tomurcuğu (primordium) ve skar seviyesine ulaşmak gerekir. Bu amaca ulaşmak için, bu çatlak her iki ucunda da agaroz eklemek için gerekli olabilir. </li><li> Agaroz ilave edildiğinde, hızla çatlak içine sel olacak; pipet kullanarak, meristem slaytta en yüksek noktası olmasını sağlamak için agaroz montaj erimiş kısmını emmek. Bu görüntüleme sırasında hareket edemez, böylece bu meristemi giderir. </li></ol> 3.. Montaj Kök veya Hipokotil Örnekleri <ol><li> Kökler ve hipokotiller, hiç diseksiyon gereklidir. Hazırlanan cam slayt üzerinde agaroz ince bir film olarak, doğrudan cam üzerinde olan asit ya da bir cam lamel üzerinde ya da bir oluk yapmak. Bu temas halinde olduğu bu sağlanan bir oluk içinde kök veya hipokotil yerleştirinonun bütün uzunluğu boyunca cam. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, numune yüzeyinde kuru olduğundan emin olun. Eğer değilse, hafifçe filtre kağıdı kullanılarak suyun fazlası uzaklaştırıldı. </li><li> 1.2.6 ekleme aşamasında olduğu gibi, numune etrafında monte agaroz eritilir. </li></ol> 4. AFM Hazırlama ve Hassasiyet Kalibrasyon (bir JPK Nanowizard AFM için) <ol><li> AFM üzerinde bir dirsek monte edin. Konsol yuvarlak indenter ile monte edilmelidir. Yarıçapı x, y, z çözünürlük ve hassas ölçüm arşivlenmiş olabilir hangi girinti derinliği belirleyecek. <ol><li> Epidermisteki yüzeyindeki mezo-nano ölçümler almak için, bir 50 nm yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanın; , orta ölçek ölçümleri almak 0.5 mikron yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanmak için; (2-3 hücreleri arasında) mikro ölçümler almak için, 2.5 mikron yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanın. </li></ol></li><li> Konsol ucundaki lazer yerleştirin. Orta lazer hizalamaayna kullanarak captor. </li><li> AFM altında temiz bir bardak yerleştirin. NOT: Aşağıdaki konsol bir deformasyon içine AFM reseptörü üzerindeki lazer pozisyonun sinyalini dönüştürmek için ayarlanır ve bir güç haline çevirmek için, konsolun yay sabiti değerlendirerek edilir. </li><li> 1 V. hedef kuvvet &quot;set point&quot; ile yaklaşım </li><li> &quot;Force spektroskopi&quot; seçeneğini seçin. 2 V maksimal &quot;göreli noktası&quot; ayarlayarak bir girinti yapmak, 40 mikron / sn &quot;hız genişletmek&quot;, ve 5 um için &quot;z uzunluk&quot;. </li><li> &quot;Kalibrasyon Yöneticisi&quot; menüsünden &quot;fit aralığını seçin&quot; düğmesini kullanarak hassasiyeti sığdırmak için öne eğrisinin doğrusal bölümünü seçin. &quot;Göreli set point&quot; &quot;metre&quot; ile &quot;volt&quot; dönüştürülmüş olmalıdır. </li><li> &quot;Kalibrasyon Yöneticisi&quot; menüsünden EL değerlendirmek için &quot;yay sabiti&quot; seçiniztermal dalgalanmalar kullanarak Konsolun asticity. Konsolun spektral yoğunluk arsa almak için Basın &quot;run&quot;. Düşük frekans ile rezonans pik bulun. &quot;Fit aralığını seçin&quot; düğmesini kullanarak takınız. NOT 1:. Termal dalgalanmalar ayarlama hakkında daha fazla bilgi için, Cook ve ark 15 okundu Not 2: (bilinen sertlik ya da malzeme), bir referans konsol ile konsol elastikiyetini değerlendirmek için doğrudan bir yöntemi kullanmak için tercih edilir. Burada kullanılan nazik birini Atef Asnacios 16 tarafından bağışlanmıştır. </li><li> Konsol ucu altında% 10 mannitol çözeltisi 200 ul ekleyin. Ayna kullanarak captor ortasına lazer hizalayın. </li><li> Hassasiyetini yeniden kalibre: &quot;kalibrasyon Yöneticisi&quot; menüsünden, &quot;bilinmeyen&quot; butonuna tıklayın; tekrar 2.5 ile 2.3 adım. </li></ol> . 5 Veri Toplama: Görünen Young Modülü Haritacılık <ol&gt; <li> AFM altına monte edilen örnekleri yerleştirin ve numune üzerine,% 10 mannitol bir solüsyon 500 ul damlacık ekleyin. Mannitol solüsyon birkaç dakika içinde hücreleri plasmolyzes. </li><li> 20 nN hedef kuvveti (&quot;noktasını ayarlamak&quot;) ile yaklaşım (&quot;set point&quot; fazla 3 V olmamalıdır) </li><li> 200 nN bir &quot;göreli set noktası&quot; olan girinti, bir 40 mm / sn &quot;hız uzatmak&quot;, ve 5 mikron &quot;z uzunluğu&quot;. </li><li> Konsol ya da 1 mm / 5 um monte konsol 0.5 um monte nm 200 için 100 nm bir çentik elde etmek üzere &quot;nispi noktası&quot; ayarlayın. </li><li> , Meristemlerde için, bir çözünürlük 64 x 64 (&quot;piksel&quot;) ile 70 mikron x 70 mikron: &quot;force haritalama&quot; modunda taramak için bir bölge seçin hipokotillerinden ve kökleri için, 64 x 64 çözünürlüğe sahip 100 mikron x 100 mm. </li><li> Basın deneyler başlatmak için tarayın. Çıktısını kaydetmek. </li&gt; </ol> . 6. Veri Analizi: Görünen Young Modülü Hesaplamalar <ol><li> Veri analiz yazılımı veri dosyasını açın. </li><li> Tek bir harita tüm eğrileri aynı analizi uygulamak için &quot;toplu işlem&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Böylece girinti derinliği ayıklamak için &quot;konsolun bükme için yüksekliği düzeltmek&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Kuvvet girinti alanı ile orantılıdır üstlenecek &quot;Young modülü uyum fonksiyonunu&quot; seçeneğini seçin. Girinti şekli parabolik olduğunu varsaymak için parabolik &quot;ucu şekli&quot; olarak ayarlayın. </li><li> Uç yarıçapını gösterir. </li><li> O &quot;genişletmek&quot; eğri daha topografya daha az duyarlı olduğu için tercihen analizi için &quot;geri çekme&quot; eğrisi seçin. Prob önemli yapışma sırasında Ancak, eğer &quot;geri çekme,&quot; yapıştırma duyarsız &quot;genişletmek&quot; eğrisi, kullanın. </li><li> Set0,5 Poisson oranıdır. Basın üzerinde analiz ve çıkış kaydedin. </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li>
<li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+plant+cell+wall+extension+%28creep%29+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).</li>
<li>Durachko, D. anielM., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+%28Creep%29+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25(2009).</li>
<li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li>
<li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li>
<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix%3A+Insights+for+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+signaling+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li>
<li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TipChip%3A+a+modular%2C+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li>
<li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xyloglucan+endotransglucosylase%2Fhydrolase+%28XTH%29+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li>
<li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li>
<li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li>
<li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creep+function+of+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li>
<li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants%3A+the+role+of+pectins+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121(2012).</li>
<li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+signaling%3A+the+new+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813(2013).</li>
<li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+behind+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li>
<li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM%3A+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li>
<li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ball+tonometry%3A+a+rapid%2C+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+plant+growth+regulation%22%5BJournal%5D)">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li>
<li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+or+driving+force%3F+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549(2011).</li>
<li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bitkilerde, değişen mekanik özellikler büyüme ve morfolojilerinden yönlendirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Bugüne kadar orada bitki gelişimini kontrol genetik ve kimyasal ağları çözülüyor büyük ilerlemeler kaydedilmiş, ancak bu ağlar katkı ve mekanik özelliklerindeki değişikliklerden nasıl etkilendiğini bilgimiz ilkel gelmiştir. Bu yöntem, bu boşluğu doldurmak için bize imkan vermelidir, ve bu yüzden bitki büyümesi veya morfojenesis&#39;in herhangi bir yönünü inceleyen bilimciler için güçlü bir ilgi olmalıdır. B...

Bitkilerde büyüme organizmanın her hücre çevreleyen sert hücre duvarlarının koordineli genişlemesi ile elde edilir. Giderek artan kanıtlar bu bitkiler, yerel olarak, bu genişleme kontrol eden hücre duvarı kimyanın tadilatı yoluyla olduğunu gösterir. Genişleme hücrenin yüksek turgor basıncının neden olduğu hücre duvarları, üzerinde yük öncelikle tahrik olması düşünülmektedir; turgor basıncına bu gerginlik tepkisi hücre duvarlarının 1&#39;in mekanik özellikleri tarafından yönetilir. Küçük bu mekanik özellikleri bilinen ve geliştirme sırasında nasıl değiştiğini. Ayrıca biraz bu mekanik özellikleri geribildirimler görünüşte bir doku boyunca koordineli bir şekilde hücre duvarı kimyasını değiştirmeye katkısı olup olmadığını kontrol edilir ve nasıl bilinir. Biz kimyasal ve mekanik gelişimi sırasında bitki hücre duvarlarında değişiklikler ve sonuçta nasıl bu mikroskobik etkileşimlerin bir bitkiyi yöneten arasındaki bağlantıyı anlamak için ise&#39;In makroskopik büyümesi, hücre ya da doku ölçeğinde organları geliştirilmesinde hücre çeperlerinin mekanik özelliklerini izlemek için bir yöntem gereklidir. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi mikrometre veya nanometre doku sıkıştırmasından ya da çentikler dayandığı, burada anlatılan, subselüler çözünürlüklerde aynı anda organları gelişmekte ve doku tüm bölgeler arasında hücre duvarlarının mekanik özelliklerini ölçmek için tam geliştirilmiştir. Diğer yöntemler var ya çok düşük ya da çok yüksek bir çözünürlük: Ekstansometrelerin milimetre ölçeğinde 2-4, erken olayları ölçmek için çok büyük örneğin bir ölçekte tüm doku ortalama mekanik özelliklerini ölçmek için sadece yapabiliyor Organogenezis; microindenter nanometre ölçeğinde hücre içi çözünürlükte ölçümlerini, ancak izole edilmiş hücreler olup hücre ya da organların 5-7 gruplarının ölçümü ile sınırlandırılmıştır. AFM ile, ihtiyaçd doku, hücre ve hücre içi çözünürlükleri 8-10 elde edilebilir. Son zamanlarda çok sayıda protokolleri de 11, 12, kullanılabilecek bitki doku mekanik ölçmek için özel olarak geliştirilmiştir. Biz, belirgin Young modülü 13 ölçü dokuya elastikiyetini değerlendirmek nasıl burada sunacaktır. Young modülü, genellikle bir malzemenin sertliğini tarif etmek için kullanılır. Küçük deformasyon esnasında bir malzemenin deforme edilmesi için gerekli kuvvet girinti alanı ile orantılıdır. Young modülü, bu katsayısıdır. Sürekli bir homojen madde durumunda, aynı katsayısı ne olursa olsun girinti tipi (boyut ve şekil) içinde ölçülür, ancak ölçüm hızı ile değişecektir. Bitki dokusunun bir kompleks yapının durumunda, şimdiye kadar kuvvet belirlenmesini sağlayan bir deformasyon orantılı olduğunu gözlemledikbiz &quot;belirgin genç modülü&quot; adını bir orantılılık katsayısı. Bitkilerde sürekli akışkanda ikinci Bunun aksine, bu bariz genç modülü girinti boyutuna duyarlıdır. Bu saf hücre duvarının genç modülünün karşılık gelmez. Bu, en iyi doku hücre duvarının iskele elastikiyetini açıklar.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>Tüm 3 nesiller aynı ön koşulla iş yapabilmektedir.</td></tr><tr><td>AFM aşaması</td><td>JPK</td><td>CellHesion</td><td>Düşük topografyaya sahip numune için gereklidir (11'den az ve mikro; kuvvet taraması alanındaki en düşük ve en yüksek nokta arasında m).</td></tr><tr><td>AFM optiği</td><td>JPK</td><td>Üstten Görünüm Optiği</td><td>Numuneyi konumlandırmak için çok önemlidir. Uzun menzilli dürbün veya mikroskop ile değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>Her türlü stereo mikroskop yapabilir.</td></tr><tr><td>150 nm monte konsol</td><td>Nanosensörler Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, İsviçre</td><td>R150-NCL-10</td><td>Sadece epidermisin yüzeyindeki hücre duvarını ölçmek için kullanın.</td></tr><tr><td>1 ve mikro; m monteli konsol</td><td>Nanosensörler Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, İsviçre</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>Epidermisin yüzeyine dik olan hücre duvarının mekaniğini ölçmek için.</td></tr><tr><td>Uçsuz konsol</td><td>Nanosensörler Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, İsviçre</td><td>TL-NCH-20</td><td>Dokunun lokal mekaniğini ölçmek için (2-3 hücre genişliğinde) 5 &mikro kullanın; m monte konsol. 5 & mikro ekledik; Uçsuz bir konsola m borosilikat boncuk.</td></tr><tr><td>5 ve mikro; m silikon mikro küreler</td><td>Corpuscular</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik SA 77170 Coubet, Fransa</td><td></td><td>Araldite, boncuğu uçsuz konsola sabitlemek için.</td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &# 176; C jelleşme sıcaklığı</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 ABD</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 Paslanmaz Çelik No. 5 Cımbız</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, İsviçre&nbsp;</td><td></td><td></td>951199</tr></tbody></table>

hücre duvarları elastik Özelliklerinin afm-tabanlı haritalama: doku, hücresel ve subselüler Çözünürlüklerde

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Biz bir JPK AFM için, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) mikro / nano-çentikler kullanılarak bitki dokularının yüzeylerinin mekanik özelliklerini ölçmek için yeni geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Özellikle, bu protokolde, çiçek meristemler, hipokotiller, ve köklerde x 100 um kadar 100 um&#39;lik bölgeler arasında hücre içi çözünürlüklerde hücre duvarlarının belirgin Young modülüne ölçün. Bu numunenin dikkatli hazırlanması, mikro-indenters ve girinti derinliklerinde doğru seçimi gerektirir. Sadece, ölçümler hücreleri plazmolize ve böylece hücre turgor basınç katkı çıkarmak için manitol yüksek ölçüde konsantre çözeltiler içinde gerçekleştirilen hücre duvarı özellikleri hesaba katılması için. Diğer kaybolmamış tekniklerin aksine, farklı çentikleri ve girinti derinliği kullanılarak, bu yöntem, aynı anda çok ölçekli ölçümleri sağlar: <em&gt; Subsellüler çözünürlüklerde ve bir doku içeren hücrelerin genelinde yüzlerce yani. Bu, uzaysal-temporal tarzda büyümesi ve farklılaşması ile ilişkili olduğu için bu değişiklikleri sağlayan, geliştirme sırasında hücre çeperlerinin mekanik özelliklerinde yer alan karakterize etmek artık mümkün olduğu anlamına gelir. Bu koordineli mikroskobik hücresel değişiklikler makroskobik morfojenetik olaylar hakkında getirmek nasıl anlamak için önemli bir adımı temsil etmektedir. Ancak, bazı sınırlamalar kalır: bu yöntem sadece (100 çapı um civarında) ve bu dış dokularda oldukça küçük numuneler üzerinde kullanılabilir; yöntem, doku topografya duyarlıdır; bu dokusunun karmaşık mekanik özelliklerinin sadece bazı yönlerini ölçer. Teknik hızla geliştirilmektedir ve bu sınırlamalar çoğu yakın gelecekte çözüleceğini olasıdır.

Şekil 1 de çiçek Meristemlere tipik Genç modülleri haritalar (Şekil 1A ve 1B), genç ve yaşlı hipokotilleri (Şekil 1C-F) ve kök meristem (Şekil 1G ve 1H) sunuyoruz. Tüm deneylerde delici yarı-küresel, ancak farklı uzamsal çözünürlük elde edilebilir, böylece bunun radius farklıdır 1C ve 1D meso-nano girinti (50 nm derinlik) meso-nano indenters (50 nm çapında) için tipik sonuçlar g...

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak bitki dokularının mekanik özelliklerini haritalamak için bir yöntem açıklıyoruz. Bitki gelişimi sırasında hücre duvarlarında meydana gelen mekanik değişikliklerin geniş alan orta ölçeğinde nasıl kaydedileceğine odaklanıyoruz ve bu değişikliklerin büyüme ve morfogenez ile ilişkilendirilmesini sağlıyoruz.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Bu prosedürün genel amacı, bir atomik kuvvet mikroskobu kullanarak bitki dokularının mekanik özelliklerini haritalandırmaktır. İlk olarak, ince bir aros film oluşturmak için lam üzerindeki aşındırılmış bir bölgeye pipetle bir damla düşük erime sıcaklıklı aros damlatarak cam lamları hazırlayın. İkinci adım, örneğin diseke edilmesi ve monte edilmesidir.Çiçek tomurcuklarını gövdeden çıkarın, marris gövdesini ana gövdeden kesin ve kesilen me gövdesini hemen cam üzerindeki ince Agros filme gömün. Ardından, Maris gövdesi Aros filme gömüldüğünde oluşan boşluğu dolduracak kadar eritilmiş montaj agrosu ekleyin. Son adım, veri toplama için atomik kuvvet mikroskobunu hazırlamaktır.Nihayetinde, veri analizi ve hücre duvarlarının görünür Young modülünün ölçümleri, hücre duvarı özelliklerinin mekanik haritasını hem alt hücre çözünürlüğünde hem de tüm doku bölgelerinde eş zamanlı olarak oluşturur. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücre duvarının mekanik özelliklerini alt hücre çözünürlüğünde ve dokunun tüm bölgesi boyunca eş zamanlı olarak ölçebilmesidir. Numunelerin gömülmesi için kullanılan Aros medyumu, %10 mannitol içeren suda %0,7 düşük erime sıcaklıklı aros ile hazırlanır.

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ekstraselüler matriksin sertliği kuvvetle yapışık hücrelerinin birden fazla davranışları etkiler. Matrix sertliği bir doku boyunca mekansal değişir ve çeşitli hastalık koşullarında değişiklik uğrar. Burada atomik kuvvet mikroskobu microindentation kullanarak fare akciğer dokusunun normal ve fibrotik sertliği mekansal farklılıklar karakterize etmek için yöntemler geliştirmek.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Akciğer Doku Mikro-Mekanik Karakterizasyonu

Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Canlı hücrelerdeki mekanik zorlanmaya gerçek zamanlı tepkilerin ölçülmesine izin vermek için özel bir motor tahrikli mekanik aktüatör kullanılarak yeni bir görüntüleme protokolü geliştirilmiştir. Mekanobiyoloji ile ilgili olarak, sistem konfokal veya atomik kuvvet mikroskobu ile neredeyse gerçek zamanlı görüntülemeye izin verirken %20'ye kadar suşlar uygulayabilir.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

Kristalin selüloz, bitki hücre duvarının önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, hücresel bir çözünürlükte nicelleştirilmesi teknik olarak zordur.  Burada, uzay-zamansal bir çözünürlükte hücre duvarı bileşimi hakkında bilgi elde etmek için polarize ışık teknolojisinin ve kök kesitlerinin kullanımını rapor ediyoruz.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Burada, hücre ve dokularda nano ve mikro girinti aracı olarak işletilen atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sunuyoruz. Cihaz, numunenin 3D yüzey topografisini ve hücre duvarı Young 'ın modüllerinin yanı sıra Turgor basıncını da içeren mekanik özelliklerini eşzamanlı olarak satın almayı sağlar.

Santral hücreleri ve bitki dokularının mekanik özelliklerini ve Turgor basıncını ölçmek için Atomic Force Microkopi kullanımı

Bu protokol, yüzlerce mikrobiyal hücre üzerinde AFM ölçümlerini otomatikleştirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, mikroplar PDMS damga mikroyaplarına hareketsiz hale getirilir ve daha sonra yüzlerce hareketsiz hücre üzerinde kuvvet spektroskopisi ölçümleri otomatik olarak yapılır.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

Burada konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu tek bir enstrüman platformu nda birleştiren Conpokal tekniğinin protokolü sunulmuştur. Conpokal aynı hücre, aynı bölge, eşzamanlı konfokal görüntüleme ve canlı biyolojik örneklerin mekanik karakterizasyonu yakın sağlar.

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Atomik kuvvet mikroskobu girinti protokolü, normal veya kısıtlı büyüme sırasında (yani su açığı altında) bir doku veya organın belirli bir hücresinin hücre duvarının fiziksel özelliklerinin rolünü inceleme imkanı sunar.

Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu

Hücre duvarı biyomekaniği çalışmaları, bitki büyümesini ve morfogenezini anlamak için gereklidir. Aşağıdaki protokol, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak genç bitki organlarının iç dokularındaki ince primer hücre duvarlarının araştırılması için önerilmiştir.

Canlı Bitki Organlarında Primer Hücre Duvarının Mekanik Özelliklerinin Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karakterize Edilmesi

Bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) prob ucu tarafından bir numune yüzeyine uygulanan temas alanının ve kuvvetin ölçülmesi, nano ölçekli mekanik özellik belirlemeyi mümkün kılar. Elastik modülü veya diğer nanomekanik özellikleri ölçmek için yumuşak ve sert numunelerde havada veya sıvıda AFM konsol bazlı nanogirinti uygulamak için en iyi uygulamalar tartışılmaktadır.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Konsol Tabanlı Nanogirinti: Hava ve Sıvıda Nanoölçekte Mekanik Özellik Ölçümleri

Bu protokol, murin akciğer dokusunun kriyoseksiyonlarının nasıl hazırlanacağını, atomik kuvvet mikroskobu kuvvet haritası deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini ve doğal murin pulmoner bazal membranının Young modülünü belirlemek için verilerin nasıl analiz edileceğini görselleştirir.

Atomik Kuvvet Mikroskobundan Türetilmiş Kuvvet Haritalarından Doğal Murin Pulmoner Bazal Membranlarının Young Modülünün Çıkarılması

Keşfedin bitki dokularının mekanik özelliklerini atomik kuvvet mikroskobu ile haritalama yöntemini. Bu teknik, hücre duvarı elastikliğini doku ve hücresel çözünürlükte ölçerek gelişim süreçlerini anlamanıza yardımcı olur.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

Daha fazla video keşfet