Name: Nanopodia - Cep Hareketi ve Intercellular Etkileşimleri Rolleri İnce, Kırılgan Membran Projeksiyonlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Keşfedin nanopodia görüntüleme protokolünü endotelyal ve kanser hücrelerinde TM4SF1 immünofloresan boyama ile. Bu hassas yöntem hücre hareketi, proliferasyon ve hücreler arası etkileşimleri incelemek için kritik yapıları korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz 37 ° C PFA fiksasyon denemek için öneri içeren yararlı tartışmalar için Dr Harold Dvorak kabul. Bu çalışma NIH hibe P01 CA92644 tarafından ve Kanser Araştırmaları Ulusal Vakfı bir sözleşme ile desteklenmiştir.

1.. Kollajen Kaplamalı Camlar Diskte Hücre Kültürü <ol><li> Bir cam kavanoz (4 oz) ve diskler sterilize etmek otoklav içinde yer cam disk (çapı 12 mm). </li><li> Bir 50 ml Falcon tüpü içinde 25 ml% 70 etanol koyun ve bir hücre kültürü kaputu yerleştirin. Çözeltinin seviyesi 20 ml düşene kadar bu çözelti, birden çok kez tekrar edilebilir. </li><li> Cam disk kolu için kullanmadan önce, 5 dakika boyunca% 70 etanol içinde bir ekstra ince nokta ile keskin bir forseps yerleştirin. </li><li> Dikkatlice tüp dışında forseps kaldırmak ve kapağını kapatın, daha sonra yavaşça 2 dakika boyunca hava ile kuruması için tüpün üstüne etanol tedavi forseps yerleştirin. Forseps ucu kaputu şey dokunmak izin vermeyin. </li><li> Cam kavanoz dışında bir steril cam diski kapmak ve 24-yuvalı hücre kültürü plakasının bir kuyu içine yerleştirmek için steril forseps kullanın. Kuyu istenen sayıda diskler ile doldurulan kadar tekrarlayın. </li><li> Bovine kolajen çözeltisi 500 ul (koyun50 ng / ml) bir cam disk içeren ve en az 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2, hücre kültürü yetiştirme cihazı yerleştirmek her kuyuya. Daha uzun bir inkübasyon hiçbir zararı yoktur. </li><li> Hasat HUVEC (insan göbek damar endothelial hücreleri) ya da daha önce PC3 tripsinizasyon ile 150 mm hücre kültürü plakasında yetişen ve tam kültür ortamı kullanılarak tripsin aktivitesini bloke edilmiştir (prostat tümör hücreleri). Bir 15 ml Falcon tüpü içine hücreleri toplamak. </li><li> Hücre sayısını ve canlılığı% 90 daha büyük olduğundan emin olun. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 200 x g santrifüj ile hücreler Pelet Süpernatant kaldırmak. </li><li> 10 5 hücre / ml olacak şekilde seyreltmek hücreleri için kültür ortamı kullanın. Hücreleri buz üzerinde yerleştirin. </li><li> Hücre kültürü kaputu kolajen ve yavaşça aspire cam diskler kolajen ile kaplanmış edildiği de her bir hücre süspansiyonu, 500 ul koyun. 24 oyuklu bir plaka içerisinde, 5 x 10 4 hücre / çukur% 60 conf verecekHUVEC ve PC3 hücreleri için% 30 akma luency. Not: yüksek hücre yoğunluğu için daha fazla hücre süspansiyonu ekleyin. </li><li> Kültür, 37 ° C, 1 saat, 2 saat, 4 saat, 6 saat, ya da nanopodia faaliyetleri ve hücre geçişi izlemek için 24 saat boyunca% 5 CO2 inkübatörü içinde hücreler. Tipik olarak, hücreler ilk 30 dakika içinde cam disk eklemek, daha sonra Polarize ve ilk bir saat içinde göç başlar ve ilerleyen saatlerde arası etkileşimleri ve hücre bölünmesini gerçekleştirin. </li></ol> 2. Hücre Fixation <ol><li> Her iyi hücrelerini düzeltmek için 500 ul% 4 PFA (paraformaldehid) ihtiyacınız olacak. Ticari olarak üretilen ya da taze% 4 PFA kullanılabilir yapılmış ya. Hazırlanan kuyu sayısına göre gerekli PFA miktarını hesaplayın ve bir 15 ml Falcon tüpüne PFA yerleştirin. DİKKAT: paraformaldehıt bir kanserojen olabilir. </li><li> 37 ° C inkübatör yerinde zaten bir strafor stand şahin tüp koymak. Savaş için 30 dakika boyunca inkübatör tüpü terk37 ° C&#39;ye kadar PFA m </li><li> Kültürü kaputu bir ısıtma pedi yerleştirin ve açın. </li><li> 24-iyi hücre kültürü plakası ve kuluçka prewarmed PFA çıkarın ve ısıtma yastığı üstüne yerleştirin. </li><li> Bir kuyudan orta aspire bir elinizi kullanın ve hemen sonra hafifçe iyi kenarı boyunca kuyuya 500 ul PFA slayt için diğer elinizi kullanın. Kolay aspirasyonu için, o açıyla istikrarlı olduğunu böylece Strafor standı dayayarak, yaklaşık 45 ° de kültür plaka eğin. Bu, aspirasyon ile kültür içinde hücreleri bozmadan oyuğuna PFA çözeltisi eklenerek kolaylaştıracaktır. Bu hücre faaliyetleri, orijinal hücre yapısını korumak için en önemli adımdır. </li><li> Bir cam disk ile tüm kuyuları PFA almış kadar işlemi tekrarlayın. Not: kuyudan önceden varolan çözüm değiştirmek için gereken tüm adımlar aynı aspirasyon prosedürleri uygulayacaktır. </li><li> 5 dakika boyunca 37 ° C &#39;de plaka koyun. </li&gt; <li> Geri kültürü kaputu plaka almak ve adım 2.5 açıklandığı gibi Strafor karşı yatırın. Nazikçe bir toplama tüpüne kuyudan PFA aktarmak için bir elinizi kullanın; hemen sonra da en az 500 ul oda sıcaklığında PBS yerleştirmek için diğer elinizi kullanın. Tüm çukurlar yıkanıp sonra, geri ve de her bir kere daha PBS yıkama tekrarlayın. Tehlikeli atık kabı içine toplanır PFA boşaltın. </li><li> PBS,% 2 fetal sığır serumu eklenerek ICC bloke tamponu hazırlayın. % 0.04 sodyum azid (% 20 stok çözeltisinden seyreltilmiş), bir koruyucu madde olarak ilave edilir. DİKKAT: Sodyum azid zehirli bir bileşiktir. Tampon bakteriyel kontaminasyon olmaksızın uzun bir süre için 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Yine de her iyi PBS kaldırmak için aspire ve hemen sonrasında ICC engelleme tampon 500 ul ekleyerek aracılığıyla döngüsü bir kez, bir stand karşı eğik kültür plaka ile. Hücreler artık immunofloresan boyama için hazır bulunmaktadır. Gerekirse,Sabit hücre TM4SF1 proteinin önemli bir kayıp olmaksızın bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de buzdolabında saklanır. </li></ol> 3. Nanopodia arasında TM4SF1 İmmünofloresan boyanması <ol><li> Her bir oyuğa olarak, Triton X-100% 0.01 ihtiva eden yeni bir bloke edici tampon ile 500 ul bloke edici tampon ICC değiştirmek ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. Hücre zarlarından TM4SF1 kaldırmak gibi% 0.03 Triton X-100 daha yüksek kullanmayınız. Boyama hemen başlamak için hazır olup olmadığını PBS adım 2.10 ile yıkanmış hücrelerini doğrudan Triton içeren engelleme tampon taşınmış olabilir. </li><li> ICC bloke etme tampon maddesi içinde 0.5 ug / ml anti-birincil TM4SF1 (ya da anti-CD9) antikoru seyreltin. </li><li> Her bir oyuğa olarak, ICC/0.01% Triton tamponunu çıkarın ve anti-TM4SF1-antikor çözeltisi 300 ul ile değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe ya da 4 ° C&#39;de bir gece bekletin </li><li> En az 500 ul PBS ile daha iyi her yıkayın. 3x tekrarlayın; Her zaman le de vermekinkübasyon süresi ast 5 dak. </li><li> Ikinci bir antikoru ve phalloidin çözelti hazırlayın ICC bir Alexa 488 etiketli eşek anti-fare ikincil antikoru (2 ug / ml nihai konsantrasyon) 1000 kat dilüsyonu ve Phalloidin 1000 x seyreltme (50 ng / ml nihai konsantrasyon) kullanılarak, blokaj tamponu. </li><li> PBS çıkarın ve her bir oyuğa, ikincil antikor ve phalloidin çözeltisi 300 ul ilave edin ve 2 saat boyunca inkübe ya da 4 ° C&#39;de bir gece bekletin </li><li> Yıkama başına en az 5 dakika inkübasyon ile PBS yıkama adımları tekrarlayın. Son yıkamadan olarak, 1 saat boyunca PBS içinde de her bırakın. </li><li> Bir cam slayt üzerinde anti-solmaya montaj medya tek bir damla (~ 10 ul) bırakın. </li><li> Bend sert bir yüzeye hafifçe bastırarak şırınga iğnesi, 90 ° 19 G 1 ½ ucu. Bükülmüş iğne tutun ve yavaşça iyi bir cam diski yukarı kaldırın, ve keskin forseps kullanarak diski kavramak için diğer elinizi kullanın tek bir elinizi kullanın. </li><li> Cam diski Turn &amp;# 160; cam slayt hücre yan kişiyi montaj medya icar yüz aşağı. Yavaşça cam diski yerleştirin ve oda sıcaklığında karanlık bir yerde gece boyunca kurumaya bırakın. </li><li> Görüntü immünofloresans lekeli nanopodia devam, ya da -20 ° C&#39;de slayt kutuda saklayın slaytlar Slaytlar -20 ° C&#39;de birkaç ay boyunca görüntülenebilir kalacaktır </li></ol>

<ol><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li>
<li>Zukauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TM4SF1%3A+a+tetraspanin-like+protein+necessary+for+nanopodia+formation+and+endothelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).</li>
<li>Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+effects+of+L6%2C+an+IgG2a+antibody+that+reacts+with+most+human+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).</li>
<li>Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imag%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging and stem cell research.</a> Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).</li>
<li>Hemler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+functions+and+associated+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin functions and associated microdomains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).</li>
<li>Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+thymosin+beta-10+by+early+passage+and+senescent+vascular+endothelium+is+modulated+by+VPF%2FVEGF%3A+evidence+for+senescent+endothelial+cells+in+vivo+at+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis.</a> FASEB. 15, 458-466 (2001).</li>
<li>Itoh, T. J., Hotani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+and+the+regulation+by+microtubule-associated+proteins+%28MAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Uchu+Seibutsu+Kagaku%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).</li>
<li>Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-jump+studies+of+microtubule+dynamic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability.</a> J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).</li>
<li>Pollice, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+paraformaldehyde+and+methanol+fixation+for+simultaneous+flow+cytometric+analysis+of+DNA%2C+cell+surface+proteins%2C+and+intracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins.</a> Cytometry. 13, 432-444 (1992).</li>
<li>Macarulla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+solubilization+by+the+non-ionic+detergent+triton+X-100.+A+comparative+study+including+model+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Espanola+de+Fisiologia%22%5BJournal%5D)">Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes.</a> Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).</li>
<li>Koley, D., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triton+X-100+concentration+effects+on+membrane+permeability+of+a+single+HeLa+cell+by+scanning+electrochemical+microscopy+%28SECM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).</li>
<li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD13+%28aminopeptidase+N%29+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Nanopodia sıkıca TMED aracılığıyla Matris takmak ve ortamı duygusu ve hücreler arası etkileşimleri 2,3 aracılık için polarize mobil hücreden fazla 100 mikron uzatabilirsiniz ince hücresel membran kanalları vardır. Bu yüzden sıkıca kalıntıları uzak hücre hamle olarak geride kaldığını matrix uymak Nanopodia (Şekil 1 ve 2). Nanopodia böylece bizi hücrelerin çevrelerini nasıl hissettiğinin çalışma ve hücre hareketin yolunu belirlemek için, izin ve nasıl gen ifadesi ya da ilaç ted...

Hareket için polarizasyon esnasında, hayvan hücreleri filopodia, lamellipodia, geri çekme lifler ve fırfır 1 de dahil olmak üzere, yüzeyleri dinamik, membran uzantıların, çeşitli uzanır. Son zamanlarda bu listeye eklenir nanopodia, ince bir yeni tanınan tipi (çapı 100-300 mikron), gibi filopodia gibi F-aktin yapılarının uzatılması için membran kanalları sağlamak uzun (en fazla 50-100 mikron uzunluğunda) membran projeksiyon vardı geri çekme ve elyaf ve bu leke pozitif TM4SF1 (Transmembran-4-L-altı family-1) kültürlenmiş endotelyal ve tümör hücreleri içinde 2,3 ile. TM4SF1 ilk molekül endotel hücre proliferasyonu ve göçünde 2,3 önemli bir rol oynayan bir endotelyal hücre biyolojik olan keşfinden önce, bir tümör hücresi antijenine 4 olarak bilinen tetraspanin benzeri topolojisi ile bir proteindir. Immünofloresan boyama TM4SF1 perinuc lokalize olduğunu ortaya çıkardılear veziküller ve plazma zarına ve TM 4SF1 e nriched mikro d omains (TMED) içinde zenginleştirilmiştir. TMED çapa Matris nanopodia ve nanopodia 1-3 TMED / um uzunlukta bir düzenli aralıklı bantlı desen mevcut. Nanopodia tipik olarak bir hücrenin gelen ön uzanan ve hareket için hücre polarizasyon esnasında arka arkaya. Nedeniyle TMED bir firma yapışık doğaya, nanopodia uzak hareket olarak hücre içine geri geri edemiyoruz; terk nanopodia artıkları böylece hücresel hareketinin yolunu iz. F-aktin uzatma ve geri çekme için membran kanalları sağlamak ve hücreler arası etkileşim ve iletişimin 2,3 sitelerdir Nanopodia. Bu özellikler hücresel kutuplaşma, çevre hücresel algılama, hücre hareket yolu ve yön tayini, ve hücreler arası etkileşimler sırasında F-aktin aksamını altında yatan mekanizmaları incelemek için eşsiz bir fırsat sağlayacak nanopodia anlamına birnd iletişimi. Nedeniyle TMED oldukça hidrofobik doğa ve nanopodia ince ve kırılgan membranöz doğaya, özel bakım TMED ve nanopodia korumak için alınması gerekir. Nanopodia ve ortak laboratuvar yöntemlerle TMED çıkarılması yıkımı sadece altmış üç yayınlar 1986 1 yılında ilk keşif beri ve üzerine 100-300 mikron microdomains içinde TM4SF1 zenginleştirme bilgi eksikliği tamamlamak için TM4SF1 çıktı neden olası bir nedeni hücre yüzeyi, 2009 2, endotel hücrelerinde TM4SF1 raporu kadar. Geleneksel immüno-lekeleme yöntemleri yaygın hücreleri düzeltmek ve hücreler 5 permeabilize% 0.1 veya daha yüksek bir Triton X-100 konsantrasyonu kullanmak için, etanol, metanol veya aseton gibi organik çözücüleri kullanırlar. (I) 37 ° C% 4 PFA kullanımı ve 37 hücreleri düzeltmek: Burada anlatılan çalışmalar TMED ve nanopodia ortaya çıkarmak için geleneksel yönteme üç büyük değişiklikler uygulanmıştır76, C kuluçka makinesi, (ii) oda sıcaklığında nazik bir PBS yıkama uygulanır, ve (iii) Triton X-100, Triton X-100,% 0.03 &#39;den daha fazla özü gibi, primer antikor ilave edilmeden önce hücreler nüfuz edilebilir kılınması için sadece kısa bir süre için en az% 0.03 oranında kullanmak TM4SF1. Tüm tetraspanins hücre zarı 6 mikro bölgesini oluşturur ve bazı endotelyal ve tümör hücrelerine 2,3 in TMED ile colocalize. CD9, CD81 ve CD151 gibi tetraspanins her yerde bulunan bir ifade olarak, burada açıklanan boyama protokolü nanopodia fonksiyonunun çalışmalar için TM4SF1 olmayan pek çok farklı hücre tipleri için uzatılabilir.

<table><tbody><tr><td>Cam diskler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>12 mm çaplı</td></tr><tr><td>Cam kavanoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>Sertifikalı Temiz Şeffaf Cam Düz Taraflı Kavanozlar, 4 oz</td></tr><tr><td>Cam slayt</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>Fisherfinest Premium Düz Cam Mikroskop Slaytları</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tüpü</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>50 ml yüksek berraklıkta polipropilen konik santrifüj tüpü, 16.000 RCF derecesi. Steril.</td></tr><tr><td>Strafor raflı 15 ml Falcon tüpü</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Corning 15 ml PP Santrifüj Tüpleri</td></tr><tr><td>Keskin forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Diseksiyon Ekstra İnce Sivri Kıymık Forseps</td></tr><tr><td>24 oyuklu Hücre kültürü plakası</td><td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>24 oyuklu Hücre Kültürü Plakası</td></tr><tr><td>150 mm Hücre kültürü plakası</td><td>BD Bioscience</td><td>353025</td><td>150 mm hücre kültürü plakası</td></tr><tr><td>19 G 1 ve frak12; Şırınga iğnesi</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 & frac12;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratuvarları, Inc.</td><td>2701</td><td>Decon'un Saf Etanol 200 Korumalı</td></tr><tr><td>Kollajen çözeltisi</td><td>BD Bioscience</td><td>354249</td><td>Kollajen I, Yüksek Konsantrasyon, sıçan kuyruğu, 100 mg</td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>%0.25 Tripsin-EDTA 1x</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11965-092</td><td>DMEM yüksek glikoz (1x), sıvı, L-glutaminli, sodyum piruvat içermeyen</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Affymetrix</td><td>75889 5 LT</td><td>PBS, 10x Çözelti, pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehit)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td>PBS</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>Fetal Sığır Serumu</td></tr><tr><td>EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Bazal Ortam 500 ml ve EGM-2 SingleQuot Kit Takviyesi & Büyüme Faktörleri</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Suda çözünür. % 4 stok çözeltisi ve çalışma konsantrasyonu% 0.4'tür.</td></tr><tr><td>Fare anti-insan TM4SF1 antikoru&nbsp;</td><td>Millipore MAB3127</td><td></td><td>Epitop, hücre dışı alanda</td></tr><tr><td>bulunur Fare anti-insan CD9 antikoru&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>Epitop hücre dışı alanda bulunur</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Eşek anti-fare 2. antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 Eşek Anti-Fare IgG (H + L)</td></tr> <tr><td>Phalloidin</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>Rhodamine konjuge Phalloidin</td></tr><tr><td>Anti-solmaya karşı montaj ortamı&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P-36931</td><td>ProLong DAPI %70 Etanol İçeren Altın Antifade Reaktifi</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>17.5 ml etanol (200 kanıt) 7.5 ml çift deiyonize su</td></tr><tr><td>10x PBS (200 ml yapın)</td><td></td><td></td><td>20 ml 10x PBS 180 ml çift deiyonize su</td></tr><tr><td>%20 Triton X-100 (20 ml yapın)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml Triton X-100 16 ml çift deiyonize su</td></tr><tr><td>%4 NaN3 (25 ml yapın)</td><td></td><td></td><td>1 g NaN3 25 ml çift deiyonize su</td></tr><tr><td>50 ng/ml PBS'de sığır kollajen solüsyonu (5 ml yapın)</td><td></td><td></td><td>50 &mu stok solüsyonu; g/ml (50 ml) 830 &mu; l Kollajen I (3 mg) 50 ml PBS</td></tr><tr><td>ICC Bloke Edici Tampon (50 ml)</td><td></td><td></td><td>49 ml PBS %2 FBS (1 ml ekleyin) %0.04 NaN<alt>3</alt> (100 &mu ekleyin; l% 4 NaN < alt > 3 < / alt >)</td></tr> <tr><td>ICC Engelleme Tamponu /% 0.01 Triton X-100 (50 ml yapın)</td><td></td><td></td> <td>50 ml ICC Engelleme Tamponu 25 & mu; l% 20 Triton X-100</td></tr><tr><td>HUVEC&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">www.lonza.com</a></td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">www.atcc.org</a></td></tr><tr><td>Hücre kültürü davlumbazı</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425 (Seri 60) Biyolojik Güvenlik Kabini&nbsp;</td></tr><tr><td>37 & derece; C,% 5 CO2 Hücre kültürü inkübatörü&nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO2 Su Ceketli İnkübatör</td></tr><tr><td>Isıtma yastığı&nbsp;</td><td>K & H İmalat</td><td>1020</td><td>K & H Lectro Kennel Serbest Polar Kapaklı Isıtmalı Ped (<a href="http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y">www.amazon.com</a>)</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) Masaüstü Santrifüj</td></tr><tr><td>Hemositometresi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Parlak Çizgi Hemositometresi</td></tr></tbody></table>

nanopodia - cep hareketi ve intercellular etkileşimleri rolleri İnce, kırılgan membran projeksiyonlar

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Kültür yapışan hücreler hareketi ve hücreler arası etkileşimleri desteklemek için polarize durumunu korumak. Nanopodia, ince uzun, TM4SF1 (Transmembran-4-L-altı ailenin-1), imüno-lekeleme yoluyla görselleştirilebilir endotel ve kanser hücrelerinde büyük ölçüde F-aktin-negatif zar tahminleridir. 100-300 mikron çapında TMED de TM4SF1 kümeleri 14 kadar bireysel TM4SF1 moleküllere 3 ihtiva eden (TM 4SF1 e mikro d omains nriched). TMED 1 μ m &#39;başına TMED 3 ve sıkıca matrisine nanopodia çapa düzenli aralıklarla nanopodia boyunca aralıklı olarak düzenlenmiştir. Bu polarize endotel veya tümör hücrelerinin ön ön veya arka arkaya gelen daha 100 μ m uzatmak nanopodia sağlar ve MATR üzerinde geride olmak zar artıkları olurix hücre uzaklaşıyor zaman. TMED ve nanopodia nedeniyle aşırı kırılganlık ve sıcaklık hassasiyeti göz ardı edilmiştir. Rutin yıkama ve tespit yapısını bozabilir. Nanopodia lekelenme% 0.01 Triton X-100 kısa süreli maruz bırakma ve ardından, 37 ° C &#39;de paraformaldehit (PFA) doğrudan tespit ile korunur. Hücre biyolojisinde yeni ufuklar açmak Nanopodia: algılamak ve bir mesafede diğer hücreleri belirlemek, yakın temas sırasında hücreler arası etkileşimleri başlatabilir ve hareket, çoğalma dahil sinyal mekanizmaları, hücrelerin çevrelerini nasıl hissettiğinin anlayışımızı yeniden şekillendirmek ve hücre için söz veriyorum -hücre iletişimi. TM4SF1 türetilmiş nanopodia çalışmak için geliştirilen yöntemler, klasik tetraspanins, özellikle de her yerde bulunan bir ifade CD9, CD81 ve CD151 vasıtasıyla diğer hücre tiplerinde meydana nanopodia çalışmaları için yararlı olabilir.

Adım 1 için: (Örneğin HUVEC&#39;e ve bu çalışmada kullanılan PC3 olarak) hücreler normal büyümek mümkün ise, hücreler numaralı seribaşı sonra, 30 dakika içinde kollajen kaplı disk takmak Polarize ve kısa bir süre sonra mobil olmak ve ileride kendi yolunu nanopodia uzatacak hareketin. Şekil 1A ve 1B, sırasıyla bir polarize ve çoğalan HUVEC. Şekil 2A, bir cep halinde polarize PC3 hücreleri sini göstermektedir. Adım 2: </...

Nanopodia bir hücrenin ön ön veya arka arka 100 mikron kadar uzanır ve hücresel ortamı anlamda ince ama kırılgan zar kanallardır. 37 ° C&#39;de, hafif bir yıkama, ve etanol, metanol veya aseton gibi bir organik çözücü önlemeyi ve daha yüksek Triton X-100 konsantrasyonları doğrudan tespiti, bu hücresel yapılar gözlemlemek için gereklidir.

Nanopodia - Cep Hareketi ve Intercellular Etkileşimleri Rolleri İnce, Kırılgan Membran Projeksiyonlar

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

Bu prosedürün genel amacı, kültürlenmiş hücrelerde immünofloresan boyama yoluyla nano podia'yı görselleştirmektir. Laboratuvar ortamında. Bu, ilk olarak ilgilenilen hücrelerin kollajen kaplı cam diskler üzerinde kültürlenmesiyle gerçekleştirilir.İkinci adımda, hücreler daha sonra ılık PFA ile diske sabitlenir, hücreler yıkanır ve daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici tamponda inkübe edilir. Son adımda, hücreler TM dört, SF birine karşı antikor ile boyanır ve bir cam slayt üzerine monte edilir. Sonuç olarak, mobil çoğalan veya etkileşime giren hücrelerde nano podia uzantılarının varlığı, immünofloresan mikroskobu ile görselleştirilebilir.Bu tekniğin etkileri, insan kanserlerinin tedavisine ve teşhisine kadar uzanır, çünkü endot hücre ve tümör hücresi proliferasyonu, hareketi ve hücreler arası etkileşimler, tümör hücrelerinin anjiyogenezinde ve büyümesinde rol oynayan anahtar süreçlerdir. Prosedürün gösterilmesi iki yalın olacak, bir laboratuvardan bir doktora sonrası Diskler sterilize edilirken dört onsluk bir cam kavanozda 12 milimetre cam diskleri otoklavlayarak başlayın. 25 mililitre% 70 etanol içeren 50 mililitrelik bir konik tüpü bir hücre kültürü davlumbazına yerleştirin.Etanolün içine beş dakika boyunca ekstra ince uçlu keskin bir forseps yerleştirin ve ardından forsepsleri dikkatlice çıkarın ve tüpü kapatın, forsepsleri iki dakika boyunca kuruması için tüpün üzerine yerleştirin. Forsepsler kuruduğunda, 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının istenen oyuklarının her birine kuyucuk başına bir steril cam disk yerleştirin. Daha sonra her diski 500 mikrolitre sığır kollajen çözeltisi ile örtün ve plakayı en az 30 dakika boyunca 37 derece Santigrat derece% 5 karbondioksit hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Diskler inkübe edilirken, damlar ve gözler, ilgilenilen hücreler tam kültür ortamı ile reaksiyonu durdurur. Hücreler ayrıldığında, yüzen hücreleri 15 mililitrelik bir Falcon tüpünde toplayın ve canlılıklarının %90'dan büyük olduğunu onayladıktan sonra sayınHücreleri 200 G ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca pelet haline getirin. Süpernatanı çıkarın ve daha sonra hücreleri hücre kültürü ortamında mililitrede 10 ila beşinci hücreye kadar seyreltin ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin.Şimdi kollajen çözeltisini hücre kültürü başlığındaki her bir oyuktan aspire edin ve ardından 500 mikrolitre hücreyi her bir kollajen kaplı disk kültürüne nazikçe dağıtın. Nano podia aktivitelerini ve hücre geçişini izlemek için uygun süre boyunca hücreler. Tipik olarak, hücreler ilk 30 dakika içinde cam diske yapışacak, ilk bir saat içinde polarize olmaya ve göç etmeye başlayacak ve hücreleri ilk önce 37 santigrat derece inkübatörde tüm diskler için yeterince sıcak PFA'yı sabitlemek için sonraki saatlerde hücreler arası etkileşimler ve hücre bölünmesi gerçekleştirecektir.Ardından kültür davlumbazına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Açın ve ardından ön ısıtma PFA'sını ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Disklere PFA eklemek, hücre aktivitelerinin orijinal hücresel yapısını korumak için en önemli adımdır, kültür ortamının çıkarılmasını ve kültürdeki hücreleri rahatsız etmeden PFA'nın eklenmesini kolaylaştırmak için, plakayı yaklaşık 45 dereceye kadar kuyruklayın, bir strafor standına yaslayın, böylece açıda stabil kalır Tek elinizle kullanın.Daha sonra, ortamı her bir oyuktan aspire edin, ardından hemen diğer elinizi kullanarak 500 mikrolitre PFA'yı kuyu kenarından her bir oyuğa kaydırın ve diskleri beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra, kullanılmış PFA'yı bir elinizle bir toplama tüpüne dağıtan hücre kültürü ortamı için gösterildiği gibi PFA'yı çıkarın ve kuyucuklar PBS ile iki kez yıkandıktan sonra PFA'yı hemen 500 mikrolitre oda sıcaklığında PBS ile değiştirin, son PBS yıkamasını gösterildiği gibi çıkarın ve her diske 500 mikrolitre immünokimya bloke edici tampon ekleyin. Nano podia'yı floresan mikroskobu ile görselleştirmek için, önce her bir oyuktaki immünosito kimya bloke edici tamponu oda sıcaklığında bir saat boyunca% 0.01 tritton X 100 bloke edici tampon ile değiştirin.Daha sonra tritton bloke edici tamponu 300 mikrolitre taze seyreltilmiş anti TM dört SF bir antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında iki saat boyunca değiştirin. Daha sonra, her diski gösterildiği gibi PBS ile üç kez yıkayın ve son yıkamadan sonra her yıkama sırasında PBS'yi disklerde beş dakika bırakın. Her bir kuyucuğu 300 mikrolitre taze seyreltilmiş ikincil antikor ve Phin çözeltisi ile inkübe edin ve diskleri oda sıcaklığında iki saat daha inkübe edin.Şimdi diskleri tekrar üç kez yıkayın ve son PBS yıkamasını bir saat boyunca kuyularda bırakın. Ardından, 10 mikrolitrelik tek bir damla Antifa montaj ortamını her disk için bir cam kızağa damlatın. Ardından, 19 gauge bir şırınga iğnesinin ucunu sert bir yüzeyde 90 derece hafifçe bükün.Ardından iğneyi bir elinizle tutarak, diğer elinizle diski kavramak için keskin forseps kullanarak cam diski tek tek nazikçe kaldırın. Her bir cam diski yüzü aşağı bakacak şekilde cam kızakların üzerindeki montaj ortamına yerleştirin ve ardından slaytları gece boyunca kuruması için oda sıcaklığında karanlık bir yere dikkatlice yerleştirin. Lekeli nano podia daha sonra görüntülenebilir veya eksi 20 santigrat derecede bir slayt kutusunda saklanabilir.Normalde büyüyen hücreler, oturduktan sonra 30 dakika içinde kollajen kaplı disklere yapışır, polarize olur ve nano podia'yı hareket yollarından önce uzattıktan kısa bir süre sonra mobil hale gelir. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, izole edilmiş bireysel H-U-V-E-C genellikle nano podia içine gömülü hücre çevresinde f aktin projeksiyonları ile açıkça polarize bir morfoloji gösterecektir, PC üç hücre, nano podiaları ile polarize bir morfoloji gösterecektir. Hücreler, burada bölünen bir H-U-V-E-C'de görüldüğü gibi hücre bölünmesi durumundaysa, nano podia TM E yoluyla matrise sıkıca bağlanır ve F aktinin nano podia içinde uzamasına veya geri çekilmesine izin verir.Hücre kavşağı oluşumuna yol açan hücreler arası etkileşimler, bu örneklerde gösterildiği gibi, dört santigrat derece PFA fiksasyonu ve soğuk PBS yıkama, polarize hücrelerde nano podia yapısını bozacak ve tahrip edecek nano podia suboptimal sıcaklıkları yoluyla da yaygın olarak gözlemlenir. Soğukta PFA ve soğuk PBS'de çoğalan hücreler podiadan yoksun olacak ve bu nedenle nano podia içinde f aktin geri çekilmesi gözlenecektir. Ve hücreler arası bağlantılardaki boşluklar yapay olarak üretilecektir, çünkü nano podia, hücre dışı matrise takım halinde bağlanan ince uzun zar çıkıntılarıdır.Nano podia kalıntıları boyunca hücre hareketinin yolunu ortaya çıkarmak için görüntü işleme yazılımındaki parlaklık ve kontrast işlevleri aracılığıyla eşleştirilmiş yoğunluğun büyük olasılıkla iyileştirilmesi gerekecektir. Bu görüntünün iç kısmında yapıldığı gibi, kollajen kaplı bir cam disk üzerinde %60 co akıcılığında kaplandıktan sonra altı saat boyunca kültürlenen ve daha sonra az önce gösterildiği gibi 37 santigrat derece, %4 PFA'da sabitlenen H-U-V-E-C bu görüntüde gösterilmiştir. Nano podia, anti CD dokuz antikoru ile ortaya çıkarıldı ve F aktin, Phin ile boyandı, bu da CD dokuz'un nano podia'ya lokalize olduğunu gösterdi.Prosedürü takiben. Batı kanındaki akış sitometrisi gibi diğer yöntemler, bazı tedavilerin TM dört SF bir ekspresyon seviyelerini nasıl etkilediği ve böylece hücre hareketini, proliferasyonunu ve hücre içi etkileşimleri nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, nano podia'nın hücre hareketi ve hücreler arası etkileşimlerdeki rolünü incelemek için immüno-dondurulmuş sürdürmenin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu çalışmada yardımcı programı ve kolaylığı nicel hücre zarı uzantısı ölçüm ve hücre yapışkanlı kapasite için onun korelasyon gösterir. Temsil edici bir örnek olarak, biz burada Dickkopf ilgili biraz protein 3 (DKK3) artan lobopodia oluşumu teşvik ve vitroAdrenokortikal Karsinom hücre adhesiveness hücreleri göstermek.

Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

Burada, podosomes uyumlu bir filmde filmin topografik görüntülerin otomatik Analize hazırlanması uygulamak çıkıntı kuvvetleri değerlendirmek için kullanılan Deneysel teknikler ayrıntılı.

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

Burada, Promega Çift GloTM Lusiferaz Testi Sistemi kullanılarak bir lusiferaz tabanlı muhabiri gen yaklaşımı ile fagositoz indüklenen gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Bu protokol gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya aktarımı teknik anlatılmaktadır. Gap Junctional hücrelerarası iletişim doku homeostazı korunur ve bu hücre sinyal bozulması olumsuz sağlık etkileri vardır edildiği önemli bir hücresel bir süreçtir.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

Bu yazının nano ölçekli yapının kesin modellerini üretmek için süper çözünürlüklü mikroskopi görüntülere tek parçacık analizi uygulamak için Fiji tabanlı açık kaynak yazılım paketi VirusMapper kullanır.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Biz msn zamansal çözünürlüğe sahip membran dinamiklerinin görüntülenmesini sağlayarak elektron mikroskobu, "flaş-and-donması" içinde yeni bir teknik geliştirdi. Bu teknik, yüksek basınçlı dondurma nöron Optogenetic uyarılmasını birleştirir. Burada, prosedürleri göstermek ve ayrıntılı protokolleri açıklar.

Flaş-ve-Freeze: Elektron Mikroskobu ile Membran Dinamikler Yakalama Yeni Bir Tekniği

Keşfedin nanopodia görüntüleme protokolünü endotelyal ve kanser hücrelerinde TM4SF1 immünofloresan boyama ile. Bu hassas yöntem hücre hareketi, proliferasyon ve hücreler arası etkileşimleri incelemek için kritik yapıları korur.

Nanopodia - Cep Hareketi ve Intercellular Etkileşimleri Rolleri İnce, Kırılgan Membran Projeksiyonlar

Daha fazla video keşfet