Name: Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Öğrenin, kültür hücrelerindeki intra- ve ekstrasellüler askorbat seviyelerini hızlı ve spesifik bir mikroplate deneyiyle nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, hücresel metabolizma araştırmalarında maliyet etkin bir çözüm sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Astrosit kültürlerin cömert temini için Dr Stephen Robinson ve Ms Hanya Czerwińska (Monash Üniversitesi) müteşekkiriz.

1.. Kültür Hücreleri Hücre içi askorbat belirleyin <ol><li> Hücre kültürü ve hasat <ol><li> Standart kültür prosedürler 19-21,32,38 kullanılarak süspansiyon (örneğin insan eritrolösemi, K562) veya yapışık hücreleri (primer astrositlere) büyür. Not: hücreler, askorbat içeren askorbat ya da askorbat veya DHA ile 33,39 gibi kültür hücreleri yük sağlamak. </li></ol></li><li> Bir askorbat içeren hücresel özü oluşturun <ol><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanmış ve süspansiyon buz gibi soğuk hücre Permeabilization Tamponu [CPB 450 ul ile yapışan hücreler bir uygun sayıda inkübe et; PBS içinde% 0.1 (ağ / hac) bir saponin; 4 ° C]. Not: deneysel olarak son kullanıcı tarafından (aşağıya bakınız) deneyinin lineer aralığında bir absorbans değeri elde etmek için gerekli olan hücre sayısını belirler. Not: doku ekstreleri de (daha fazla bilgi için Tartışma) kullanılabilir. </li><li> Agita10 dakika boyunca buz üzerinde te ayrıntılı hücreleri hücre liziz sağlamak. </li><li> Soğutulmuş bir mikrosantrifüj (4 ° C) 5 dakika için 16,000 x g&#39;de ham lizat santrifüj ile hücre artıklarının çıkarılması ile berraklaştırılmış askorbat ihtiva eden hücre içi özü oluşturun. </li><li> Her bir numune dikkatli bir şekilde 4 x 100 ul alikotları kaldırmak ve tek ya da 25 ul / oyuk 45.5 U PBS (&quot;AO-&quot;), 25 ul / ya da ihtiva eden bir 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki kuyu yatay dizisine eklemek / ml PBS (&quot;+ AO&quot;) L-askorbat oksidaz-(AO) stok çözeltisi. Not: Bu (aşağıya bakınız) standartlarının hazırlanması paralel olarak yapılmalıdır. </li></ol></li><li> Askorbat standart eğri yapı (her bir deney için yeniden inşa edilmesi gerekir) <ol><li> Buz soğukluğunda PBS içinde 10 mM askorbik asit, bir stok çözelti hazırlayın. Not: spektrofotometrik olarak 1 olan bir kuartz küvet kullanılarak askorbatın konsantrasyonu doğrulama265 nm&#39;de (yok olma katsayısı = 14.5 mM -1 cm-1) 40 cm yol uzunluğu. </li><li> Dikkatle 0 ve 20 mcM arasında askorbat standartların bir dizi hazırlamak. </li><li> Adım 1.2.4 paralel olarak, dikkatli bir şekilde, her bir standart 4 x 100 ul alikotları çıkarın ve PBS (&quot;AO-&quot;) ya da 25 ul / yuva ihtiva eden bir 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki kuyu yatay dizisine eklemek PBS AO (&quot;+ AO&quot;) 45.5 U / ml stok solüsyonu. Not: Yukarıdaki askorbat standartların 100 ul askorbat 0-2 nmol içerir. Lütfen dikkat, AO amacı azalma ferricyanide olmayan askorbat redüktantların katkı için kontrol etmektir. </li></ol></li><li> Hücre içi askorbat belirlemek - Adım 1: seçici askorbat kaldırmak ve kantitatif ferrisiyanit ile askorbat okside <ol><li> Orbital folyo ile plaka kaplama ile karanlık bir ortamda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 550 rpm&#39;de 96 oyuklu plaka karıştırın. Not: Tüvey DHA&#39;ya &quot;+ AO&quot; kuyularda tüm askorbat okside gerekir. &quot;-AO&quot; kuyuları etkilenmemiş olmalıdır. </li><li> Tüm oyuklara PBS içinde (burada &quot;ferrisiyanür&quot; olarak anılacaktır) 3.5 mM potasyum ferrisiyanür 50 ul ekle. Nihai [ferrisiyanür] = 1 mM. Not: a multipipettor kullanın. </li><li> Orbital karanlıkta başka bir 5 dakika için oda sıcaklığında 550 rpm plaka karıştırın. Not: Bu adım okside askorbat 1 molekülü başına azaltılmış ferrisiyanit 2 molekülünün bir birleşme oranında askorbat ile ferrosiyanür için ferrisiyanür azalmaya neden olmalıdır. </li><li> Hemen% 50 (v / v) asetik asit ve% 30 (a / h) trikloroasetik asit (TCA) ihtiva eden bir yeni inşa çözeltisi 25 ul ekle. Not: a multipipettor kullanın. </li></ol></li><li> Hücre içi askorbat belirlemek - Adım 2: quantitate Ferrosiyanat miktarı 37 oluşmuş <ol><li> E ferrosiyanür belirlenmesi çözüm 37 100 ul ekleyiniyi ach. Not: bir çalışma çözeltisi kullanımdan hemen önce yapılmalıdır: 3 M Na-asetat (pH 6.0) içinde 2 ml; Buzlu asetik asit (~ 17.4 M asetik asit), 0.5 mi; 0.2 M sitrik asit ve 2 mi; 0.1 M asetik asit içinde 3.3 mM FeCl3 2 mi; 30 mM ferene-S 1 ml. Bu çalışma çözeltinin son hacmi 7.5 ml olmalıdır. </li><li> Orbital oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 550 rpm&#39;de karanlıkta plaka karıştırın. </li><li> 593 nm&#39;de kuyuların absorbans değerleri oku (örneğin Fe (II) (ferene-S) 3 kompleksin absorbans maksimum). </li><li> (Adım 1.3 &#39;her bir örnek için -&#39; AO &#39;kuyuları ve daha sonra askorbat standart eğriden interpolating ilk olarak karşılık gelen&#39; + AO &#39;kuyular için bir 593 nm değerleri çıkarılarak milyon hücre başına nmol askorbat gibi hücre içi askorbat miktarını hesaplayın .) Standart eğri oluştururken, ascorb miktarına karşı her bir standart için, bu &quot;fark değeri&quot; arsaOyuk başına yedi. </li></ol></li></ol> Kültür Hücreler Askorbat efflux-2. Belirlenmesi <ol><li> Hücre kültürü ve hasat <ol><li> (Adım 1.1) yukarıdaki gibi süspansiyon veya yapışık hücreleri büyümek. Not: En iyi sonuçlar için süspansiyon ve yapışık hücreleri ile 24-iyi bir plat formatında aşağıda tahlil yürütmek. </li><li> Süspanse süspansiyon hücreleri ya da ya da, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın, önceden ısıtılmış HEPES tamponlu salin çözeltisi 400 ul, yapışkan hücreler kaplamak ve 5 mM D-glukoz içeren, kuyularda (HBS / D, pH 7.3, 37 ° C) Bir 24-yuvalı plaka. Incelenecek her bir 24-çukurlu plaka üzerinde belirli bir hücre içermeyen çukurlara HBS / D aynı hacim. Not: ikinci (aşağıya bakınız) temel reaksiyon için hücre içermeyen kontroller olarak hizmet edecektir. </li></ol></li></ol> 3.. Çıkış Askorbat miktarı belirleyin <ol><li> Aşağıdaki stok çözeltileri önceden hazırlıklı olmalıdır: 120U / ml AO HBS / D (taze hazırlandı); 2.4 mM Ferene-S HBS / D; 120 uM FeCl3 ve HBS / D (daha fazla konsantre stok çözümleri hemen hazırlamak) 600 mcM Na-sitrat. </li><li> Ferrireduction reaksiyonu (her son hacim 600 ul olmalıdır) başlatmak için, daha önce HBS / D 400 ul ihtiva eden tek tek oyuklara reaktiflerin aşağıdaki miktarlar ekleyin: <ol><li> , Üç kopya halinde kuyu eşleştirilmiş için AO (120 U / ml) ya da HBS / D 50 ul ekle. Nihai AO konsantrasyon 10 U / ml olmalıdır. Not: Etiket olarak kuyu eşleştirilmiş &quot;- AO&quot; ve &quot;+ AO&quot;. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca hafif bir orbital karıştırma ile plakaları karıştırın </li><li> Tüm oyuklara 2.4 mM ferene-S 50 ul ekle. Nihai ferene-S konsantrasyonu, 200 uM olmalıdır. 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca, yukarıdaki gibi plakaları karıştırın </li><li> Taze hazırlanmış 120 uM ferrik sitrat 50 ul ekle. Nihai demir ve sitrat konsantrasyonları 10 mcM demir ve 50 mM sitrat olmalıdır. İyice karıştırın. </li></ol&gt; </li><li> Üç üçlü kontrol kaplan olarak, üstte uzanan orta aspire ve% 0.1 saponin içeren 600 ul HBS / D ekleyin. Not: Bu (aşağıya bakınız) paralel olarak yapılacak bir laktat dehidrojenaz (LDH) salım deneyi için &quot;% 100 hücre liziz&quot; kontrol grubu olarak hizmet edecektir. </li><li> 37 ° C&#39;de karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe </li><li> Askorbat-akış deneyinde sonunda, hızlı bir şekilde her bir oyuğa 500 ul aspire ve uygun bir şekilde, bir 24-çukurlu plaka gözenekleri içinde etiketli ekleyin. Not: süspansiyon hücreleri için, ilk olarak 4 ° C&#39;de santrifüj ile Hücreleri çıkarmak </li><li> 96 oyuklu bir plakaya süpernatan 300 ul hacimde ilave edin ve daha sonra 593 nm&#39;de okundu. </li></ol> Hücre dışı Askorbat 4. Belirlenmesi <ol><li> 593 nm&#39;de kuyuların absorbans değerleri okuyun. </li><li> Hücre içi askorbat tayini için tarif edildiği gibi mg protein başına (ya da milyon hücre başına) nmol askorbat gibi hücre dışı askorbat miktarını hesaplayınAdım 1.5.4 &#39;te. Not: askorbat serbest hücre içi askorbat ile sınırlı değildir, böylece son kullanıcının koşullarını optimize etmek gerekir. </li></ol> LDH Release 5. Belirlenmesi <ol><li> Her bir numunenin hücre dışı çözeltinin geri kalan 200 ul hücre liziz boyutunu belirlemek için bir LDH salma tahlili 32,41 yaparlar. Not: toplam salınabilir LDH% olarak hesaplamak. % 0.1 saponin ile muamele edilmiştir örneklerinden ayrılabilir LDH belirler. </li></ol>

<ol><li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albert+Szent-Gy%C3%B6rgyi%3A+vitamin+C+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li>
<li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Can.+Med.+Assoc.+J%22%5BJournal%5D)">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li>
<li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+dependence+of+the+hypoxia-inducible+factor+hydroxylases+%28factor+inhibiting+HIF+and+prolyl+hydroxylase+domain+2%29+on+ascorbate+and+other+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents.</a> Biochem. J. 427, 135-142 (2010).</li>
<li>Manning, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+Promotes+Maturation+of+T-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).</li>
<li>Asard, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAsard%2C+H+%22Redox+Biochemistry%22">Redox Biochemistry</a>. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).</li>
<li>Aguirre, R., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+vascular+bed%3A+Importance+of+vitamin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin.</a> C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+and+recycling+of+a-tocopherol+in+human+erythrocytes+by+intracellular+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid.</a> Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).</li>
<li>Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+some+major+functions+of+vitamin+C+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and some major functions of vitamin C in animals.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).</li>
<li>Rumsey, S. C., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+transport+and+disposition+of+ascorbic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans.</a> J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).</li>
<li>Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+chromosomal+mapping+of+the+human+nonfunctional+gene+for+L-gulono-g-lactone+oxidase%2C+the+enzyme+for+L-ascorbic+acid+biosynthesis+missing+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man.</a> J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).</li>
<li>Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChallem%2C+JJ+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22">Free Radic. Biol. Med</a>. 25, 130-132 (1998).</li>
<li>Nishikimi, M., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+deficiency+in+humans+of+gulonolactone+oxidase%2C+a+key+enzyme+for+ascorbic+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis.</a> Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).</li>
<li>Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((recycling+and+degradation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">recycling and degradation in mammals.</a> FEBS J. 274, 1-22 (2007).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+loss+of+the+vitamin+C+transporter+in+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).</li>
<li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vitamin+C+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Regulation of vitamin C transport.</a> Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).</li>
<li>Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pecking+order+of+free+radicals+and+antioxidants%3A+lipid+peroxidation%2C+a-tocopherol%2C+and+ascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).</li>
<li>May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+ascorbic+acid+an+antioxidant+for+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane.</a> FASEB J. 13, 995-1006 (1999).</li>
<li>Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+-+important+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Med.+%28Plovdiv%29%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid - important for iron metabolism.</a> Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transferrin+iron+reduction+and+uptake+are+regulated+by+transmembrane+ascorbate+cycling+in+K562+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells).</a> J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+routes+of+iron+accumulation+in+astrocytes%3A+ascorbate-dependent+ferrous+iron+uptake+via+the+divalent+metal+transporter+%28DMT1%29+plus+an+independent+route+for+ferric+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron.</a> Biochem. J. 432, 123-132 (2010).</li>
<li>Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+iron+uptake+is+stimulated+by+ascorbate+via+an+intracellular+reductive+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).</li>
<li>Lawen, A., Lane, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+iron+homeostasis+in+health+and+disease%3A+uptake%2C+storage%2C+transport%2C+and+molecular+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action.</a> Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).</li>
<li>Grünewald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid in the brain.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).</li>
<li>Harrison, F. E., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+function+in+the+brain%3A+vital+role+of+the+ascorbate+transporter+SVCT2%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2.</a> Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).</li>
<li>Rebec, G. V., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vitamin+as+neuromodulator%3A+ascorbate+release+into+the+extracellular+fluid+of+the+brain+regulates+dopaminergic+and+glutamatergic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission.</a> Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).</li>
<li>Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+view+at+C%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">New view at C.</a> Nat. Med. 8, 445-446 (2002).</li>
<li>Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid%3A+Chemistry%2C+biology+and+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).</li>
<li>Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+stimulates+ascorbate+transport+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes.</a> Brain Res. 858, 61-66 (2000).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+transport+and+recycling+by+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%3A+response+to+glutamate+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity.</a> Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+regulation+and+its+neuroprotective+role+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain.</a> Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutamate+aspartate+transporter+%28GLAST%29+mediates+L-glutamate-stimulated+ascorbate-release+via+swelling-activated+anion+channels+in+cultured+neonatal+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes.</a> Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+and+plasma+membrane+electron+transport+-+enzymes+vs+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).</li>
<li>Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume-sensitive+organic+osmolyte%2Fanion+channels+in+cancer%3A+novel+approaches+to+studying+channel+modulation+employing+proteomics+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).</li>
<li>Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+methods+for+simultaneous+determination+of+ascorbic+and+dehydroascorbic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids.</a> Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).</li>
<li>Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+assay+for+ascorbate+using+a+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader.</a> Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+colorimetric+microplate+ferrocyanide+assay+applied+to+ascorbate-stimulated+transplasma+membrane+ferricyanide+reduction+and+mitochondrial+succinate+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation.</a> Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Na%2B%2FH%2B+exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li>
<li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li>
<li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li>
<li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li>
<li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li>
<li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda, kültürlenmiş hücrelerde hücre içi ve hücre dışı bölmelerden türetilen askorbat tayini için iki hızlı, spesifik ve nispeten hassas mikro kolorimetrik tahlilleri mevcut. Tahliller, standart laboratuar ekipmanları ve reaktifler erişim tamamlanabilir. Deney için gerekli olan sadece orta derecede pahalı reaktif L-askorbat doğru analit özgüllük yüksek derecede kazandırmaktadır olarak önemlidir AO vardır. Tahliller, ya da süspansiyon hücreleri (örneğin, K562) ya da yapışık hüc...

1928 1934 1 yayımlanan gazetelerde askorbik asit (C vitamini), ve uzun aranan Albert Szent-Györgyi tarafından &quot;anti-iskorbüt hastalığı faktörü&quot;, ve diğerleri olarak kimlik kimyasal doğanın keşfi tarihinin önemli olaylar vardı biyokimyası. Nitekim, bu keşifler, Szent-Györgyi 1937 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandıktan. Hayvan ve bitki fizyolojisi askorbat rolleri giderek genişleyen paketi, yanı sıra insan sağlığını katkıda aktif bilimsel konular olmaya devam soruşturma ve tartışma. L-askorbat bol miktarda fizyolojik bir indirgeme ürünü olan ve memeli sistemlerde enzim kofaktörü ve kollajen hidroksilasyon, karnitin ve norepinefrin biyosentezinin, tirosin metabolizma ve peptid hormonu amidasyonu 2 içeren çok iyi tanımlanmış bir enzimatik reaksiyonlar katkıda bulunur. Intriguingly, montaj evidence askorbat gibi hidroksilasyon ile ilgili prolil ve asparaginil hidroksilazları gibi diğer demir bağımlı dioxygenases, uyarıcı ve hipoksiyayla tetiklenebilen faktörleri (HIFs) 1α ve 3 2α hedeflenmesine bir rol oynadığını göstermektedir. Yeni bir rapor, askorbat, nükleer hidroksilazları, Jumonji C (JmjC) etki proteinlerinin teşvik etmedeki aktivitesi ile kromatin demetilasyonunu etki yoluyla T-hücresi olgunlaşmasında bir rol oynadığını göstermektedir; son olarak adı geçen tam aktivitesi 4 askorbat için gerekli gibi görünmektedir. Gerçekten de, askorbat ve bu tür enzimlerin uyarılması HIF ve kollajen hidroksilazları ve askorbat ile uyarılmaya benzer bir mekanizma ile meydana geldiği görülmüştür. Diğer klasik etkileri arasında, askorbat, suda çözünür zincir açan kök sürükleyici 5 gibi hücresel antioksidasyon ve plazma membranının geri dönüşüm önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır α-tokoferol w, 6 α-tokoferoksil radikalin indirgenmesi ile (vitamin E)hich membran lipid peroksidasyonu 7 karşı korunması önemlidir. En memeliler D-glikozdan, askorbat de novo hepatik sentezinin sahip olmasına rağmen Önemli bir şekilde, yüksek primatlar, kobay ve bazı bitler vitamin 8 besin kaynağa bağlıdır. Bu gulo geninin inaktivasyonu nedeniyle, etkilenmemiş memelilerde en orthologues 9-13 oksidaz enzim,-γ-lakton gulono kodlar. Bu enzim, glukoz 13 ila askorbat biyosentezindeki son reaksiyon için gereklidir. Insanlarda bağırsak lümeninden taşıyıcı aracılı emme sonra, askorbat olarak dolaşım sistemiyle vücutta dağıtılır. Vitamin tipik haliyle (konsantrasyonlar tipik olarak geçerli olan plazma konsantrasyonu ile benzer olan eritrositlerin istisna ile) hücre milimolar konsantrasyonlarda mikromolar ve konsantre onun indirgenmiş formu bulunursaEn çok hücre dışı akışkanlar içinde 14,15 entrations (örneğin, 50-200 uM). Fizyolojik koşullar altında, genellikle askorbat askorbil serbest radikali tersine çevrilebilir bir elektron oksitlenme geçirmektedir (AFR, aynı zamanda ya da monodehydroascorbate semidehydroascorbate olarak da bilinir). AFR geri askorbat için hızla bir elektron enzimatik azalma yokluğunda, nispeten kararlı bir radikal 16 iken, iki AFRS bir askorbat ve bir dehydroascorbate (DHA) 9,13,17 için dismutate daha fazla olabilir. Hücresinin iç içinde, askorbat, DHA iki elektron oksidasyon ürünü, hızlı bir şekilde ve glutation-NAD (P) H-bağımlı enzimatik ve enzimatik olmayan reaksiyonları 13 geri askorbat indirgenebilir. Bu klasik demir metabolizması askorbat tek önemli rolü olmayan heme demir 18 diyet emilimini teşvik etmek olduğunu kabul ederken, biz ve diğerleri kanıt s sağladıtrongly bu askorbat düşündüren bu metal metabolizmasında büyük ölçüde genişletilmiş bir rol oynar. İlk olarak, askorbat-dolu hücreler tarafından salınır askorbat hücreleri 19,20 ile transferrine bağlanan demir alımını modüle edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır ve çok son kanıtlar askorbat da transferrin bağlı demir alımını modüle olduğunu gösterir gibi görünmektedir hücreleri 21 ile, ve ikinci bir ana fizyolojik demir alım yol 22 karşılık gelir. Askorbat memelilerde 23,24 normal merkezi sinir sistemi fonksiyonu için gereklidir. Birlikte adrenal korteks, hipofiz bezi, timus, retina ve korpus luteum ile, beyin diğer vücut dokularında 23,25-27 askorbat göreli yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Buna ek olarak, 28,29 ve nöron astrosit-benzeri hücreler glutamata 30 hem de maruz ascorbat hücre dışı alanı, içine askorbat salınmasını tetiklemek için bilinire glutamat kaynaklı nöronal disfonksiyon 31 karşısında nöronların korunması için düşünülmektedir. Astrositlerden glutamat kaynaklı askorbat serbest mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte, son zamanlarda astrocyte glutamat ve aspartat taşıyıcı (Glast tarafından glutamat alımı nedeniyle şişlik hücrenin katılımını gösteren kanıt sağladı, aynı zamanda bilinen uyarıcı amino asit taşıyıcı izoformdur 1 [EAAT1 ] insanlarda) ve bu askorbat 32 gibi küçük organik anyonları geçiren hacim duyarlıdır osmolite ve anyon kanalları (VSOACs) bunun sonucunda aktivasyonu. VSOAC oluşumunda rol plazma membran borularının 33,34 moleküler kimlikleri tespit edilmesi gerekmektedir. Birçok deneyler, spektrofotometrik fluorometrik tahliller ve kromatografik 35,36 dahil biyolojik numunelerde askorbat tayini için geliştirilmiş olmasına rağmen, seçicilik, hassasiyet, interferenc çok değişkenlik mevcutturkimyasal madde, etkili lineer aralığı ve son nokta analitin stabilite, e. Ayrıca, tahlil seçimini de etkileyecektir diğer önemli faktörleri hız, kullanım kolaylığı ve bu gibi bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) aygıtı nispeten özel ekipmanlara erişimi. Burada kültürlenmiş hücrelerde hücre içi askorbat belirlenmesi yanı sıra, kültürlenmiş hücrelerden askorbat-efflux tayini için ayrı bir tahlili için basit ve son derece spesifik mikro kolorimetrik deneyi mevcut. İkinci tahlil nedeniyle sodyum-bağımlı askorbat nakliyecilere (SVCTs) tarafından yayımlanan askorbat hızla yeniden alım hücrelerden askorbat serbest ardı sorunu aşmak için amaçlamaktadır. Bu yöntemlerin her ikisi de önceki yayınlarda 19,20,32,37,38 bazı ortaya çıkmış olsa da, bu el yazması talimatları ve etkin yürütülmesi için kurallar açık bir kümesi sağlar.

<table><tbody><tr><td>Nunc 96 kuyulu düz tabanlı plakalar</td><td>Thermo</td><td>269620</td><td>Herhangi bir düz tabanlı 96 kuyulu plaka kullanılabilir</td></tr><tr><td>Soğutmalı tezgah üstü mikrosantrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>Soğuk bir odadaki sıcaklığa dengelenmiş, soğutulmamış bir mikrosantrifüj de kullanılabilir</td></tr><tr><td>Soğutmalı tezgah üstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Döner kova</td></tr><tr><td>Bio-Rad Benchmark Plus Mikroplaka Spektrofotometresi</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>593 nm'de okuma yapabilen herhangi bir mikroplaka spektrofotometresi kullanılabilir ve tavsiye edilir. Filtre tabanlı bir plaka okuyucu kullanılıyorsa, mümkün olan en yakın dalga boyunu seçin ve standart eğri yöntemini kullanın.</td></tr><tr><td>Ependorf MixMate (mikroplaka orbital karıştırıcı)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Bu çok yönlü ve güvenilir bir mikroplaka karıştırıcıdır ve bu tahliller için çok iyi çalışır</td></tr><tr><td>Genel amaçlı tamponlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS tamponlu salin (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS + 5 mM D-glukoz (MBS/D)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponlu salin + 5 mM D-glukoz (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl<alt>2</alt> boğa; 2 H < alt > 2 < / alt >O, 0.8 mM MgSO<alt >4< / alt > ve boğa; 7 H2O, 5 mM D-glikoz, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre geçirgenlik tamponu (CPB; PBS'de %0.1 saponin)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genel kimyasallar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit veya sodyum L-askorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>En yüksek saflıkta müstahzarlar elde edilmelidir</td></tr><tr><td>Dehidro-L-askorbik asit (DHA) dimer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30790</td><td>Sulu çözeltiler teorik olarak mol DHA dimer başına 2 mol DHA monomeri verir</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>DMSO veya etanolde hazırlanan stok çözeltileri</td></tr><tr><td>Askorbat oksidaz (AO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Stok çözeltileri (120 U / ml) PBS veya MBS'de hazırlanabilir ve daha sonra alikotlarda dondurulabilir</td></tr><tr><td>Potasyum ferrisiyanür (FIC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>455989</td><td>Trihidrat</td></tr><tr><td>Feren-S (3- (2-Piridil) -5,6-di (2-furil) -1,2,4-triazin-5 & asal;, 5 & asal; &asal;-disülfonik asit disodyum tuzu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92940</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum L-glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>% 0.1 stok çözeltisi hazırlayın</td></tr><tr><td>Hücre içi askorbat tayini deneyi</td><td></td><td></td><td></td>için stok çözeltileri</tr><tr><td>3 M sodyum asetat (pH 6.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M sitrik asit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.3 mM FeCl<alt>3</alt> 0.1 M asetik asit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM feren-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%50 (h/h) asetik asit + %30 (a/h) trikloroasetik asit (TCA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Askorbat-akış deneyi</td><td></td><td></td><td></td>AO</tr><tr><td>(120 U/ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4 mM feren-S, 0,6 mM sodyum-sitrat</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>içinde 0,12 mM FeCl3</td></tr> için stok çözeltileri</tbody></table>

kültür hücrelerinin intra-ve ekstrasellüler askorbat belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir mikroplate deneyi

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

C Vitamini (askorbat) sadece son yıllarda ışık gelmiş birçoğu hücre metabolizmasında çok sayıda önemli rol oynar. Beyin askorbat homeostasis için çok önemli gibi görünen bir ilişki - Örneğin, beynin içinde, askorbat nöronlar ve komşu astrositlerden arasında askorbat bisiklet içeren bir nöroprotektif ve nöromodülatör şekilde davranır. Ayrıca, ortaya çıkan deliller güçlü askorbat klasik tanınır daha hücresel ve sistemik demir metabolizmasını düzenleyen bir ölçüde genişletilmiş bir role sahip olduğunu göstermektedir. Normal ve kuralsız hücresel ve organizma fizyolojisi askorbat ayrılmaz rolünün artan tanınması son derece pahalı uzman ekipman için gerek olmadan çalıştırılabilir orta verimlilik ve yüksek hassasiyetli analitik teknikleri bir dizi gerektirir. Burada, orta performans için açık talimatlar, bo tayini için özel ve nispeten pahalı olmayan mikro deneyi sağlarHücre kültüründe th içi ve hücre dışı askorbat.

Kültür Süspansiyon hücreleri içinde hücre içi Askorbat belirlenmesi İlk deneyde (Şekil 1) &#39;de, hücre içi askorbat, önceden yayınlanmış bir prosedüre göre 37 Ferrosiyanat son derece hassas saptaması kullanılarak, ferrosiyanür için ferrisiyanür (örneğin AO duyarlı) indirgeme askorbat-özgü ardından, tespit edilir. Askorbat tespiti ferrosiyanür ile demir ferrik demire indirgenmesi, ardından ferrosiyanür için ferrisiyanür askorbat bağımlı azalma, tarafından ü...

Askorbat sadece son yıllarda ışık gelmiş, birçoğu hücre metabolizmasında çok önemli rol oynar. Burada, orta hacmi, hücre kültürü içinde hem de hücre içi ve hücre dışı askorbat belirlenmesi için özel ve pahalı olmayan bir mikro-tahlili tarif eder.

Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kültüre edilmiş veya izole edilmiş hücrelerde hücre içi veya hücre dışı askorbat seviyelerini belirlemektir. Bu işlem, hücre ekstraktlarının veya tüm hücrelerin, sonraki adımlarda seçici olarak bir skor BA'yı tüketmek için bir skor oksidaz ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İlk yöntemde, hücre ekstraktları, askorbata bağımlı bir şekilde ferro siyanür üretmek için siyanür ile inkübe edilir ve bu işlem, ekstraktlardaki askorbat miktarının doğrudan bir temsilini sağlar.Ardından, spektrofotometrik olarak nicelendirebilen kromojenik bir demir(II)-ferne S kompleksi oluşturmak amacıyla, hücre ekstraktlarında oluşan ferrosiyanür miktarı, eklenen ferrik demirle kantitatif olarak oksitlenerek ferrisiyanür oluşturulması yoluyla belirlenir. İkinci yöntemde, tüm hücreler doğrudan demir(II) şelatörü ferne S ve ferrik sitrat ile inkübe edilir. Sonuçlar, tespit edilebilen hücre dışı demir komplekslerinin kantitatif ve spesifik indirgenmesine dayanarak hücre içi veya hücre dışı askorbik asit seviyelerindeki farklılıkları göstermektedir.Spektrometrik olarak. Mevcut tekniğin, HPLC tabanlı tespit gibi halihazırda kullanılan yöntemlere göre temel avantajı, bu yüksek

a-rapid-specific-microplate-assay-for-determination-intra

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, hücre dışı akı testi ile primer lösemik hücrelerin hücre dışı asitlenme oranını (ECAR) ve oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek için biyokimyasal bir yaklaşım sağlar. Bu hücrelerin metabolik profilinin değerlendirilmesi, taleplerinin karakterize edilmesine yardımcı olarak kişiselleştirilmiş tedaviye yol açar.

Hücre Dışı Akı Deneyi: Hücrelerin Metabolik Profilini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu video, 14C-radyoaktif işaretli substrat kullanılarak substrat oksidasyonu sırasında salınan CO2 için bir miktar belirleme tekniğini göstermektedir. Serbest bırakılan 14CO2, alkali bir çözelti içinde tutulur ve bir sintilasyon sayacı ile ölçülür. Farklı substratların oksidasyonu dokular arasında değişir ve dokunun patofizyolojik durumunu yansıtır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Substrat Oksidasyon Deneyi: Hapsolmuş CO2'den Radyoaktif Sinyalleri Ölçerek Hücrelerde Substrat Oksidasyonunu Ölçmek İçin Bir İn Vitro Test

Bu video, memeli hücrelerinde plazma zarının yeniden kapatılma verimliliğini incelemek için bir testi göstermektedir. Hücreler, hücre zarında gözenekler oluşturan bakteriyel gözenek oluşturan bir toksine maruz kalır. Hücre dışı kalsiyum iyonlarının varlığında, gözenek kalsiyum akışına neden olur ve zarın yeniden kapanması olaylarına neden olur. Yeniden mühürleme verimliliği, hücrelere yalnızca yeniden kapatılmış bir zar olmadan giren DNA bağlayıcı propidyum iyodür boyası kullanılarak...

Plazma Membranının Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğini Ölçmek için İn Vitro Floresan Bazlı Bir Test

Terapötik bileşikler genellikle ilk canlılığı deneyleri ile in vitro incelenmiştir. Bir insan gözlemci tarafından kör hücre sayımları hücre sayısındaki küçük değişikliklere son derece hassas olabilir ama fonksiyonunu değerlendirmek yok. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri, burada açıklandığı gibi, objektif bir şekilde yapı ve fonksiyon hem de değerlendirebilir.

Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Biz, kalitatif ve kantitatif çalışmalar için çeşitli amoeba ve memeli hücre modellerinde uygulanabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçümü için protokoller kümesi uyarlanmıştır.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Glikoliz, çoklu biyolojik sistemlerde tanımlayıcı bir metabolik belirteçtir. H + hücre dışı akışını ölçerek glikolizin izlenmesi yaygındır, ancak kantitatif ve açık olması için düzeltme gerektirir. Burada, hücre dışı asitlenmenin solunum ve glikolitik kaynaklarını ayırt etmek için hücre dışı akı verilerinin nasıl toplanacağını ve düzeltileceğini gösteriyoruz.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Bu iletişim kuralı spectrophotometrically trans-plazma membran elektron taşıma ekstraselüler elektron alıcısı kullanan izlemek ve bu hücre dışı elektron alıcısı ile oluşabilir enzimatik etkileşimleri analiz için hedeftir.

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bu protokol, birincil fare mikrogliasında metabolik yeniden programlamayı niceliklendirmek için glikoliz stres testi yapmanın maliyet etkin bir yolunu tanımlar. İzolasyon ve inflamatuar uyarımdan sonra, taze hazırlanmış, pH-ayarlanmış reaktiflerle hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ölçülür, ardından protein normalizasyonu uygulanarak glikolitik değişimlerin doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağlar.

Birincil mikrogliada glikolizin ekstraselüler akı testi kullanılarak araştırılması

Öğrenin, kültür hücrelerindeki intra- ve ekstrasellüler askorbat seviyelerini hızlı ve spesifik bir mikroplate deneyiyle nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, hücresel metabolizma araştırmalarında maliyet etkin bir çözüm sunar.

Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi

Daha fazla video keşfet