Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kültürlenmiş veya izole edilmiş hücrelerde hücre içi veya hücre dışı askorbat seviyelerini belirlemektir. Bu, sonraki adımlarda bir skor BA'yı seçici olarak tüketmek için hücre ekstraktlarının veya tüm hücrelerin bir skor oksidaz ile inkübe edilmesiyle elde edilir. İlk yöntemde, hücre ekstraktları, askorbata bağımlı bir şekilde ferro siyanür üretmek için siyanür ile inkübe edilir, bu da ekstraktlardaki askorbat miktarının doğrudan bir temsilini verir.

Daha sonra, hücre ekstraktlarında oluşan ferro siyanür miktarı, fotometrik olarak ölçülebilen bir kromojenik demir iki ferne S kompleksi oluşturmak için Ferris demir oluşturmak üzere ferro siyanürün ilave ferrik demir ile kantitatif olarak oksitlenmesiyle belirlenir. İkinci yöntemde, tüm hücreler doğrudan demir iki şelatör ferne S ve ferrik sitrat ile inkübe edilir. Sonuçlar, tespit edilebilen hücre dışı demir komplekslerinin kantitatif ve spesifik olarak azaltılmasına bağlı olarak hücre içi veya hücre dışı askorbat seviyelerinde farklılıklar olduğunu göstermektedir.

Metrik olarak spektro. Mevcut tekniğin, HBLC tabanlı tespit gibi halihazırda yürürlükte olan yöntemlere göre en büyük avantajı, bu son derece spesifik mikroplaka testinin çok hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilmesi ve tüm numunelerin ve standartların seri bir şekilde değil, paralel olarak işlenebilmesidir. Kültür: K 5 62 süspansiyon hücreleri ve hücresel ekstrakt içeren bir skor BA oluşturun.

Bunu takiben, buz gibi soğuk PBS'de 10 milimolar askorbik asitten oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın. Ardından, sıfır ile 20 mikromolar arasında bir dizi askorbat standardını dikkatlice hazırlayın. Her standarttan dört adet 100 mikrolitrelik alikotu dikkatlice çıkarın ve bunları yatay bir kuyucuk dizisine ekleyin.

PBS kuyusu başına 25 mikrolitre veya mililitre başına 45.5 birim içeren 96 kuyulu düz tabanlı bir plakada. PBS'deki L askorbat oksidaz veya AO'nun stok çözeltisi, 96 oyuklu plakayı folyo ve orbital ile kaplar. Oda sıcaklığında 550 RPM'de beş dakika karıştırın.

Bittiğinde, daha önce olduğu gibi aynı koşulları kullanarak, 96 oyuklu plakayı orbital olarak karıştırdıktan sonra bir milimolar nihai Ferris siyanür konsantrasyonu vermek için PBS'ye 50 mikrolitre 3.5 milimolar potasyum Ferris siyanür ekleyin. Hemen% 50 asetik asit ve% 30 trikloroasetik asit içeren taze yapılmış bir çözeltiden 25 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, her bir kuyucuk orbitaline 100 mikrolitre taze hazırlanmış bir Firavun siyanür belirleme çözeltisi ekleyin.

Plakayı karanlıkta 550 RPM'de oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın. Daha sonra kuyuların 593 nanometredeki absorbans değerlerini okuyun. Tahlillere başlamak için.

İlk olarak, mililitre başına 10 birimlik bir nihai AO konsantrasyonu elde etmek için eşleştirilmiş oyuklara üç kopya halinde eşleştirilmiş oyuklara mililitre AO veya HBSD başına 50 mikrolitre 120 birim ekleyerek seçilen kuyucuklarda hücre dışı askorbatı oksitleyin. Bu etiketi takiben, eşleştirilmiş kuyucuklar eksi AO ve artı ao olarak adlandırılır. Plakaları 37 santigrat derecede beş dakika boyunca hafif orbital karıştırma ile karıştırdıktan sonra, 200 mikromolarlık bir son eğrelti otu konsantrasyonu elde etmek için tüm kuyucuklara 50 mikrolitre 2.4 milimolar Ferne S ekleyin, plakaları yukarıdaki gibi 37 santigrat derecede beş dakika karıştırın.

Daha sonra, sırasıyla 10 mikromolar demir ve 50 mikromolar sitratın nihai demir ve sitrat konsantrasyonlarını vermek için tüm kuyucuklara 50 mikrolitre taze hazırlanmış 120 mikromolar ferrik sitrat ekleyin. Askorbat FLX tahlilinin sonunda iyice karıştırın. Üstteki ortamı her bir oyuktan hızlı bir şekilde aspire edin ve 24 oyuklu bir plakada uygun şekilde etiketlenmiş kuyucuklara ekleyin.

Bunu takiben, hücre dışı askorbatı belirlemek için 96 oyuklu bir plakaya süpernatantın üç mikrolitrelik alikotunu ekleyin. Kuyucukların 593 nanometredeki absorbans değerlerini bir mikroplaka spektrofotometresinde okuyun. Son olarak, gösterilen miligram protein başına hücre dışı askorbat miktarını m askorbat olarak hesaplayın.

İşte bir dizi askorbat standardı için tipik bir standart eğri, kuyu başına sıfır ila 20 mikromolar veya sıfır ila iki NMO askorbat. 96 oyuklu plakadan, burada gösterilmemesine rağmen, doğrusallık, oyuk başına sekiz NMO askorbata kadar korunur, bu da yaklaşık 80 mikromolar'lık bir numune askorbat konsantrasyonuna karşılık gelir. Test, kuyu başına 0.25 ole askorbatın altındaki askorbat seviyelerini başarılı bir şekilde tespit etmek için kullanılabilir.

K 5 62 hücreleri, hücre dışı dehidro L askorbik asitten hücre içi askorbatı hızla biriktirir, ancak askorbat biriktirmez. Bu temsili deneyde, PBS ile yıkanmış K 5: 62 hücreleri, PBS'de 500 mikromolar askorbat dehidro, L askorbik asit, dehidro L askorbik asit artı 50 mikromolar sito B askorbat artı beş milimolar siyanür veya askorbat artı mililitre AO başına 50 birim ile 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edildi. Hücre içi askorbat daha önce tarif edildiği gibi belirlendi.

K 5 62 hücreleri tarafından dehidro L askorbik asit alımı, dehidro L askorbik asit alımında kalçaların katılımını değerlendirmek için kolaylaştırıcı glikoz taşıyıcı kalça aracılı taşıma ile gerçekleşir. Bu temsili deneyde, K 5 62 hücreleri, dehidro L askorbik asit ile inkübe edilmeden önce artan konsantrasyonlarda sito B veya dihidro sito B ile inkübe edildi. Hem sito callin B hem de dihidro sito B, mikromolar konsantrasyonlarda hareketli süreçleri inhibe ederken, sadece tek bir çift bağın varlığı ile dihidro sito B'den farklı olan sito callin B'nin, düşük mikromolar konsantrasyonlarda glute bağımlı taşımayı inhibe ettiğini not etmek önemlidir.

Bu nedenle, dehidro L askorbik asit alımı, 2.5 mikromolar'dan daha az bir IC 50 ile cyto B tarafından inhibe edildi, ancak dihidro sit tarafından inhibe edilmedi. B dehidro. L askorbik asit alımı muhtemelen glut aracılı taşıma ile gerçekleşir.

Alternatif olarak, yıkanmış hücreler, dehidro L askorbik asit ile inkübasyon sırasında glut taşınabilir, ancak metabolize edilemeyen glikoz analog üç O metil D glikozu veya glute taşınamayan glikoz stereo izomeri L glikozunun artan konsantrasyonlarına maruz bırakıldı. Yine sonuçlar, hücre içi askorbat birikiminin inhibisyonu sadece glute taşınabilir glikoz analogunun varlığında meydana geldiğinden, dehidro L askorbik asit ithalatında glu katılımını göstermektedir. İkinci tahlilde.

Kültürlenmiş hücrelerden askorbat akış hızı belirlenebilir. Bu spesifik tahlil önemlidir, çünkü hücrelerden askorbat salınımı, hücreler tarafından transferrine bağlı olmayan demirin askorbat tarafından düzenlenen hücresel alımı için çok önemli görünmektedir. Transferrine bağlı olmayan demir alımının, hemokromatoz gibi aşırı demir yükü bozukluklarının patofizyolojisinin yanı sıra memeli beynindeki astrosit nöron demir değişimi ve homeostazı ile ilgili olduğu düşünülmektedir.

Gerçekten de, ana uyarıcı nörotransmiter L glutamat, astrositler için askorbat salınımını, L glutamata, camla alıma ve muhtemelen GLT'ye ve ardından varsayılan VSO'lar tarafından askorbat salınımını tetikleyen hücresel şişmeye bağlı bir şekilde tetikler. Benzer şekilde, A skor B yüklü astrositlerden A skor bate salınımı, uyarıcı amino asit L aspartat tarafından uyarılabilir, ancak uyarıcı olmayan amino asit L glutamin tarafından uyarılamaz. Bu etki, bir kez ustalaştıktan sonra askorbat yüklü fare astrositlerinin birincil kültürlerinden aspartat ve glutamin tarafından askorbat salınımının uyarılması için doz yanıt eğrilerini gösteren burada tasvir edilmiştir.

Bu teknik, doğru uygulandığı takdirde iki saat gibi kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.