İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

Doğrudan insan dokularından kanser kök hücreler (rulmanları) izolasyonu biyolojik karakterizasyonu için bir koşuldur. Ayrıca zor sorun giderme adımları konusunda ipuçları sağlarken Bu makale, insan dokularından prostat CSCS izolasyonu için bir yöntem anlatılmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, prostat kanseri kök hücrelerinin insan dokusundan faks ile izole edilmesini tanımlamaktır. Bu, ilk olarak cerrahi örneklerden toplanan prostat kanseri dokusunun işlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, doku bölümlerinden bir hücre süspansiyonu oluşturulur ve hücreler floresan antikorlarla etiketlenir.

Son adımda, prostat kanseri kök hücreleri gerçeklere göre sıralanır. Sonuç olarak, izole edilen hücrelerin moleküler ve fonksiyonel özellikleri, ksenotransplantasyon ve gen ekspresyon profili oluşturma ile karakterize edilebilir. Bu yöntem, insan örneklerinden kanser kök hücrelerinin moleküler ve fonksiyonel karakterizasyonunu kolaylaştırarak prostat kanseri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedürü gösteren, MD doktora öğrencisi Samuel Vidal, yüksek lisans öğrencisi Aiden Quinn ve jania olacak. Laboratuvardan yaptığımız araştırma A: Klinik tanı için gerekli olmayan kanser örneklerinden alınan fazla toplu dokuyu 15 mililitre ortam içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayarak başlayın. Tüpü, rezeksiyondan sonraki 24 saat içinde işlenmek üzere hemen dört santigrat derecede saklayın, ardından steril bir neşter ve forseps ile bir biyogüvenlik kabininde çalışın.

Kanser dokusu örneği içindeki makroskopik tümör nodüllerinden iki ila dört milimetre kalınlığında yatay doku kesitleri elde edin. Bu bölümleri ortam içeren 50 mililitrelik yeni bir tüpe yerleştirin. Daha sonra bir kısmı ayırın ve tümör dokusundan hücre süspansiyonları oluşturmak için prostat kanseri dokusunun varlığını doğrulamak için histolojik analiz için% 10 formalin içinde sabitleyin.

Daha sonra, iki ila dört milimetrelik doku bölümlerinin her birini bir mililitre steril PBS içeren 60 x 15 milimetrelik bir kültür kabına aktarın Steril bir neşter ve forseps kullanarak numuneleri mekanik olarak tritrate edin ve elde edilen hücre süspansiyonlarını tek bir steril 50 mililitrelik konik tüpe toplayın. Numune kabına bir mililitre daha PBS ekleyin ve her doku bölümü tamamen ayrılana kadar yinelemeyi üç ila dört kez daha tekrarlayın. Ve sonra hücre çözeltisini karıştırmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın.

Hücre çözeltilerini bir dakika boyunca maksimum hızda vorteksleyin ve daha sonra elde edilen hücre bulamacını 35 mikrometrelik bir hücre süzgecinden ikinci bir steril 50 mililitrelik konik tüpe süzün. Filtrelenmiş hücreleri oda sıcaklığında 450 kez G'de 10 dakika döndürün. Daha sonra peleti beş mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin.

Beş dakika sonra hücreleri tekrar aşağı doğru döndürün. Resus, kırmızı kan hücresi içermeyen peleti, trian mavisi dışlama ile sayım için% 5 FBS ile desteklenmiş az miktarda PBS içinde askıya alır. Canlı hücrelerin sayısını ölçtükten sonra, hücreleri mililitre süspansiyon başına bir kez 10 ila altı hücreye seyreltin ve bir saatten fazla olmamak üzere buz üzerinde saklayın.

Prostat kanserini izole etmek için, kök hücreler, sıralama sırasında hematopoietik ve endotel hücrelerini dışlamak için gösterildiği gibi beş adet 15 mililitrelik konik tüpü etiketleyerek başlayın. Tümör dokusu bölümlerinden üretilen hücre süspansiyonunu beş tüp arasında bölün ve daha sonra hücreleri uygun antikorlarla buz üzerinde 30 dakika boyunca bir ila 250 seyreltmede inkübe edin. Daha sonra, hücreleri döndürün ve ardından peletleri% 10 FBS ile desteklenmiş steril PBS'de yıkayın Yıkamadan sonra, peletleri mililitre DPI başına 10 mikrogram inkübe edin ve nihai çözeltileri 35 mikrometre süzgeç kapaklarından 12 x 75 milimetre polistiren tüplere süzün.

İleri saçılma, yan saçılma dpi, fite ve pe kapılarını ayarlamak için ilk dört tüpü kullanın. Son olarak, HLA Sınıf bir negatif ve HLA sınıf bir pozitif popülasyonları% 10 FBS ile desteklenmiş iki mililitre RPMI içeren ayrı steril 15 mililitre konik tüplere toplamak için beşinci tüpü kullanın. Daha sonra, sıralanmış hücre süspansiyonlarını aşağı doğru döndürün ve canlı hücrelerin trian mavisi dışlama ile miktarını belirlemek için peletleri 200 ila 500 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin.

Gösterilen protokol, HLA Sınıf bir negatif prostat kanseri kök hücrelerinin insan cerrahi örneklerinden izolasyonunu kolaylaştırır. Bu görüntüler, işlenebilen ve daha sonra mikroskopi ile doğrulanabilen, büyük ölçüde görünür makroskopik tümör nodüllerini göstermektedir. Gösterildiği gibi, canlı hücreler negatif dapi boyama ile izole edilir, HLA Sınıf bir negatif prostat kanseri kök hücrelerinin sıklığı daha sonra belirlenebilir.

HLA Birinci Sınıf negatif prostat kanseri kök hücrelerinin sayısı hastalar arasında farklılık gösterir, ancak genellikle bu prosedürü takiben toplam canlı popülasyonun %0,5 ila 8'ini oluşturur. Kemoterapi direncine ve hastalığın ilerlemesine katkıda bulunan mekanizmaları daha iyi karakterize etmek için gen ekspresyon profili oluşturma ve ksenotransplantasyon gibi diğer yöntemler kullanılabilir.