PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

Bu prosedürün amacı, regüle ekzositoz sırasında membranın yeniden şekillenmesi çalışması için polarizasyona dayalı toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl uygulandığını göstermektir. Bu, ilk olarak optik elemanların, yani çeyrek dalga plakası ve polarize küplerin, ayrı p ve s uyarma polarizasyonları oluşturmak için doğru şekilde konumlandırılmasının sağlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, p ve s ışınlarının koline olduğunu, mikroskobun optik ekseninden geçtiğini ve toplam iç yansıma floresan veya TIRF içindeyken görüntüleme alanının aynı bölümünü aydınlattığını doğrulamaktır.

Daha sonra, görüntülenecek hücreler karbo siyanür kalıbı, kalıp D ile boyanır ve ekzositozu tetiklemek için depolarize edici bir uyaranla uyarılır. Son adım, TIRF'deyken yoğun çekirdek veziküllerinin kaynaşmasının görüntülerini yakalamaktır. Sonuç olarak, P-T-I-R-F, kromin hücresi ekzositozundan kaynaklanan zar topolojik değişikliklerini izlemek için gerçek zamanlı olarak görüntü elde etmek için kullanılır.

Bu tekniğin pirometri ve membran kapasitansı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, ptro F'nin bir membran eğriliği ve buna bağlı olarak doğrudan füzyon portu genişlemesini bildirmesidir. Bu teknikle öğrenme eğrisinin en dik kısmı, önce p ve s uyarma polarizasyonlarını hizalamayı öğrenmektir, böylece bunlar mikroskobun optik ekseni boyunca birlikte hareket eder ve görüntüleme alanının aynı bölümünü aydınlatır. Sıklıkla ortaya çıkan ikinci bir sorun, hücre lekelenmesiyle ilgilidir, yani hücrelerin dd'ye ne kadar süreyle maruz bırakılacağı ve iyi lekelenmiş bir hücreye karşı kötü lekelenmiş bir hücrenin ne olduğu ile ilgilidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan TA kare sırası olacaktır. Tüm mikroskop bileşenlerini açmaya başlamak için, lazerler ve bilgisayarlar 488 nanometre lazerden bir ışını 1.49 sayısal açıklık merceğinin arka odak düzlemine yönlendirir. Lazer ışını arka odak düzlemine odaklanırsa, ortaya çıkacak, harmanlanacak ve doğrudan objektifin üzerinde tavanda küçük, iyi tanımlanmış bir nokta olarak görünecektir.

Ardından X galvanometre aynasını, lazer ışını eksenden hareket edecek ve objektiften objektif normaline doğru giderek daha dik açılarla çıkacak şekilde ayarlayın. Ardından, toplam iç yansıma veya TIR'ın elde edildiğini doğrulayın. Bir mililitre hacminde fizyolojik tuzlu su çözeltisine 10 mikrolitre floresan mikroküre ekleyin ve bir cam tabanlı tabak ekleyin, sadece TIR arayüzüne en yakın tabağın altındaki mikro kürelerden gelen floresan tespit edilmelidir.

Yüzen mikro küreciklerin tespiti, gelen ışık ile objektif normal arasındaki açının yetersiz olduğunu gösterir. Polarizasyona dayalı görüntüleme için, hizalanmış 488 nanometre ışınını kılavuz olarak kullanın ve ham 561 nanometre lazer ışınının konumunu, aynı optik yol boyunca hareket edecek şekilde ayarlayın. 561 nanometre lazer, karbo siyanür boyasının görüntülenmesi için kullanılacak.

Uzaklaşan bir mercek ve aynalar, 561 nanometre lazerin akış aşağısındadır. Aynalardaki ayar düğmelerini kullanarak, ışını 488 nanometre ışınla aynı hizada olacak ve nokta tavana odaklanacak şekilde ayarlayın. Galvanometre aynaları sıfır konumunda olduğunda, bir polarizasyon küpü elektrik alanının dikey bileşenini yansıtır ve yatay bileşeni geçer.

Eliptik olarak polarize edilmiş ışının akış aşağısına, küçük bir çevirme aşamasına yerleştirilir. Polarizasyonun daha sonra hizalanmasını kolaylaştırmak için, ışın yolları, ışınları yeniden birleştirmek için ikinci bir polarizasyon küpü ve aynalar kullanır. İlk polarizasyon küpü ile dikey bileşen aynası arasına bir deklanşör yerleştirilir.

Yatay bileşen aynası ile ikinci polarizasyon küpü arasına ikinci bir deklanşör yerleştirilir. Bu panjurlar, kullanıcının ışın polarizasyonları arasında hızlı bir şekilde seçim yapmasını sağlayan görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilir. Her ışın yolundaki elektrik alanı yönünü doğrulamak için bir polarize filtre kullanın.

Bir polarize filtre, yalnızca filtrenin ekseni ile aynı hizada iletime izin verecektir. Lazer ışınının dikey ve yatay bileşenlerinin birbiriyle ve 488 nanometre ışını ile hizalandığını doğrulayın, gerektiği gibi ayarlamalar yapın. Üç ışının tümü arka odak düzlemine odaklanmalı ve objektiften tavandaki aynı noktaya harmanlanmış olarak çıkmalıdır.

Bu nokta, gelecekteki hizalamayı kolaylaştırmak için bir X ile işaretlenebilir. Ardından, hedefe bir damla daldırma yağı yerleştirin. Floresan mikro küreler içeren tabağı yerleştirin.

Objektif üzerinde, TIR'daki ayna hareket yazılımındaki X galvanometre aynasını hareket ettirerek TIR'a girin. Işının dikey bileşeni S polarizasyonudur ve ışının yatay bileşeni artık P polarizasyon merkezi, ışın yolunda bir çeyrek dalga plakası veya qw'dir. Lazer açıklığının hemen aşağısında, rastgele yönlendirildiği tahmin edilen bir çubuk domin numunesi ile her polarize evanescent alanını görüntüleyin.

Ortalama piksel yoğunluklarına uyması için qw plakasını döndürün. Bir hemo sitometre kullanarak hücre sayımı metin protokolünde açıklandığı gibi kedi adrenal bezinden sağlıklı kromin hücrelerini izole edin ve üreticinin tavsiyelerine göre elektroporasyon sistemini kullanarak ilgilenilen proteini kodlayan DNA ile transfeksiyon transfekt hücreleri hazırlayın. Transfeksiyon verimliliği ve hücre hayatta kalma oranı arasında en iyi dengeyi sağlayan ayarlar.

Sığır kromin hücrelerinin bu hazırlığı için 1, 100 volt, 40 milisaniye ve transfeksiyon plaka hücrelerini takip eden bir darbe, bir mililitre ısıtılmış elektro geçit ortamında poli de lisin ve kollajen ile muamele edilmiş tabaklar üzerinde nazikçe uygulanır. Bulaşıkları 37 santigrat derece inkübatöre koyun. Her yemeğe bir mililitre iki x antibiyotik besiyeri ekleyin Altı saat sonra, ertesi gün besiyerini normal besiyerine değiştirin.

Kromin hücreleri tipik olarak, başlatma toplama yazılımı üzerindeki görüntüleme sistemi ile elektroporasyondan 48 saat ila beş gün sonra görüntülenir. Lazerlerin hizalandığını doğrulayın. Mikro küreler kullanarak buharlaşan alan profilini kontrol edin.

Küresel ve yerel bolluk sistemini hazırlayın. Çözelti rezervuarlarını filtrelenmiş deiyonize su ile temizleyin ve bazal ve uyarıcı fizyolojik tuzlu su çözeltileri ile doldurun. Görüntülemeden önce, kromin hücreleri, P polarizasyonunun ve S polarizasyon uyarımının görüntüleme alanının aynı bölgesini aydınlattığını ve aydınlatma yoğunluklarının metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kabaca eşdeğer olduğunu doğrulayın.

Şimdi sığır kroma hücrelerini DD ile boyamaya devam edin.Kromin hücrelerini içeren tabaktan kültür ortamını durulayın ve iki mililitre bazal fizyolojik tuzlu su çözeltisi ile değiştirin. 10 mikrolitre 10 milimolar DD'yi doğrudan hücreleri içeren tabağa ekleyin. Çözeltiyi çıkarmadan önce tabağı iki ila 10 saniye hafifçe çalkalayın.

Kalan DD'yi çıkarmak için bulaşığı bazal fizyolojik tuzlu su çözeltisi ile üç ila dört kez yıkayın, hücreler artık lekelenmiştir ve kullanıma hazırdır. Hedefe bir damla daldırma yağı ekleyin. Dai D lekeli kromin hücreleri içeren kabı objektifin üzerine yerleştirin.

Lokal perfüzyon iğnesini hücreden yaklaşık 100 mikron uzakta olacak şekilde konumlandırın. Hücre zarına odaklanın ve hücre stimülasyonu görüntü alımından hemen önce otomatik odaklama donanımını etkinleştirin. Görüntü elde etme perfüz hücrelerini bazal bir çözelti ile 10 saniye ve ardından depolarize edici 56 milimolar potasyum klorür çözeltisi ile 60 saniye boyunca başlatın.

DD ve 488 nanometre uyarmanın p ve s emisyonlarındaki değişiklikleri izlemek için 561 nanometre P polarizasyonu ile 561 nanometre s polarizasyonu arasında hızla deklanşöre binerken görüntüler elde edin. Transfekte edilmiş vezikül probunu görüntülemek için, kromin hücrelerinin coşkulu zar etiketlemesi, Dai ile kısa bir inkübasyondan sonra elde edilir D.In bu örnekte, hücre zarı iyi boyanır. Sağlıklı bir yapışık hücre, p ve s emisyonlarında belirgin farklılıklar gösterecektir.

P emisyon görüntüsü, hücrenin geri kalanına göre daha parlak bir hücre sınırı gösterir. S emisyon görüntüsü, hücre ayak izi boyunca kabaca tek tip floresan gösterir, S üzerinden piksel P'ye ve p artı iki s'ye hesaplanmıştır. Görüntüler sırasıyla membran eğriliğine ve boya konsantrasyonuna duyarlıdır.

Gösterilen CHRO ve hücre ayrıca salgı veziküllerini etiketlemek için sinap, OIN, bir florin ile transfekte edilmiştir. CHRO ve hücre, hücre zarını depolarize etmek ve ekzositozu tetiklemek için potasyum klorür ile uyarılır. Yoğun çekirdek vezikülleri kaynaştıkça bir dizi doğru floresan nokta aniden belirginleşir.

Bir füzyon olayının etrafına beyaz bir kutu çizilmiştir: Bu füzyon olayını kare kare analiz etmek için, bir florin po VS ve p artı iki s görüntü yoğunlukları incelenmiştir. CIT bir'in floresan floresan yoğunluğu, protein füzyon bölgesinden uzaklaştıkça hızla azalır. Kaynaşmış vezikül plazma zarı kompleksini temsil eden girinti, nispeten daha yavaş bir oranda azalır.

Bu çizim, bu ölçümlerin bir yorumunu göstermektedir. Hızlı ve lokalize membran deformasyonu, uyaran kalsiyum akışının bir sonucudur, membran depolarizasyonu, G Camp 5G floresansında önemli bir artışa neden olur, bu da subplazma kalsiyum seviyelerinde bir artışa işaret eder. Hücrenin 30'a 20 piksellik bir bölgesi seçilir ve G kampı 5G PS ve p artı iki s'de kare kare değişir.

Piksel yoğunlukları görüntülerde ve grafiklerde gösterilir. Sıfır zamanı, PS'de bir değişiklik belirgin olmadan önceki çerçeveyi belirtir. Beyaz ok uçları, membran deformasyonuna p artı iki S emisyonunda bir azalma eşlik ettiğini gösterir.

Sitozolik G CAMP 5G proteini, kaynaşmış yoğun çekirdek vezikülü tarafından bölgeden dışarı atılır. Ayrıca G kampı 5G yoğunluğundaki ani düşüşü de sıfır kez not edin. POS'taki uzun süreli artış ve p artı iki s'deki azalma, gösterildiği gibi yavaşça genişleyen bir füzyon gözeneğini düşündürür.

İşte bu videoyu izledikten sonra, geliştirildikten sonra çimdeyken membran topolojik değişikliklerini gözlemlemek için bir PTU F sisteminin ve görüntü hücrelerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların canlı hücrelerde ekzositoz, endositoz, sitokinez ve hücre motilitesi sırasında zar şeklindeki değişiklikleri keşfetmelerinin yolunu açtı.