Serbestçe Böcekler Yürüyüş Beyin Ektraselüler Tel Tetrode Kaydı

Bu prosedürün genel amacı, beyindeki karmaşık nöral aktiviteyi kaydetmek ve bunu serbestçe hareket eden böceklerin video ile kaydedilmiş davranışlarıyla koordine etmektir. Bu işlem, önce aşırı ince tellerin bilenmesi, ucun ve konumunu işaretlemek için kullanılan malzemenin test edilip kaplanması ve telin polietilen tüp içinde sabitlenmesiyle esnek kayıt tetrotlarının üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kayıt tetrodunun beyne yerleştirilmesi, asetat ve mum ile sabitlenmesi ve başa bir gerilme önleyici döngü yerleştirilmesidir.

Ardından, lokomotor davranışın video kaydıyla birlikte nöral aktivite kaydedilir. Videoyu, bir LED'e ve amplifikatöre gönderilen senkronizasyon darbesiyle kayda senkronize edin. Son adım, kayıt bölgesini görselleştirmek için sürekli elektrik akımı kullanarak bakır çöktürmek ve Tims yöntemiyle boyamayı yoğunlaştırmaktır.

Nihayetinde, yüksek yoğunluklu çok üniteli hücre dışı sıralama teknikleri nöral üniteleri tanımlarken, davranışların eş zamanlı olarak kaydedilen videolarının analizi, nöral aktivite ve davranış arasında ince ölçekli korelasyon kurulmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, bir böceğin karmaşık bir davranış sergilediği sırada beyninden yüksek yoğunluklu hücre dışı nöral aktivite kaydetmek için mevcut prosedürleri kullanmamıza olanak tanımasıdır. Bu sayede Tet yollarının beynin neresinde olduğunu tanımlayabiliriz ve tüm bunlar nispeten düşük maliyetlerle gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, belirli beyin bölgelerindeki nöral aktivitenin zamanlamasını ve yoğunluğunu serbestçe hareket eden bir hayvanın davranışı ile ilişkilendirerek nöropatolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, duyusal motor kontrol hakkında bilgi sağlayabilir; ancak öğrenme, yönelim veya navigasyon gibi serbestçe hareket eden böceklerin gerektirdiği her türlü davranışa da uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler zorluk yaşayacaklardır çünkü kayıt TE S'lerini yerleştirmek zordur ve bunları kayıt için yerleştirip sabitlemek çok hassas mikrocerrahi teknikler gerektirir.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Tero yapımı ve implantasyon prosedürlerinin öğrenilmesi zordur; çünkü bu işlemler çok küçük ve hassas malzemelerle gerçekleştirilir ve beyin dokusuna zarar vermemek için büyük özen gösterilmesi gerekir. Tet Road tellerini hazırlamak için, iki adet çekilmiş rom telini motorlu bir döner sarma cihazına yerleştirin.

Tero'yu dakikada 60 devir hızla iki dakika boyunca tek bir yönde sarın, ardından 30 saniye boyunca ters yönde çözün. Daha sonra, ısı tabancasının tellere temas etmemesine dikkat ederek telleri birbirine kaynaştırmak için bir ısı tabancası kullanın. Her biri yaklaşık 10 saniye süren, farklı yönlerden gelen üç yukarı ve aşağı geçiş yapın.

Ardından, 30 santimetre uzunluğundaki polietilen tüpten yapılmış bir destek tüpü ekleyin. Tetrayı, katlanmaması için destek tüpünün içine yavaşça geçirin. Birleşmiş uç tüpün diğer ucunda göründüğünde, kılavuz tüpünün her iki ucunda eşit uzunlukta tel kalacak şekilde çekip çıkarın.

Şimdi, bir gaz brülörünün alevinin tabanını kullanarak her bir telin ayrı ucunu pensle tutun. Her telin son iki veya üç milimetresindeki yalıtımı dikkatlice yakın. Teli, kıvrılmadan kızarana kadar ısıtın.

Ardından, tero'yu kayıt cihazına uygun bir erkek-dişi IC soket adaptörüne bağlamak için bir pens kullanın. Her bir telin yalıtımı kaldırılmış ucunu adaptörün farklı bir soketine yerleştirin. Tellerin sabit durmasına yardımcı olmak için bir pirinç pin ekleyin.

Ardından, soketi eritilmiş lehimle doldurmak için ince uçlu bir havya kullanın. Daha sonra, ekteki metin protokolünde açıklandığı şekilde bir empedans metre kullanarak elektrik bağlantılarının uygunluğunu test edin. Kullanılmayan ayrı bir adaptör kullanarak, altında delikler bulunan küçük bir kağıt kalıp oluşturun.

Erkek pinler için, çalışma adaptörünü erkek tarafı altta ve pinler kutudan dışarı çıkacak şekilde kutuya yerleştirin. Kutuyu metin protokolünde açıklandığı gibi bantladıktan sonra iki bileşenli epoksiyi hızlıca karıştırın ve kutuya dökün.

Adaptörü ve tüm telleri sabitlemek için, kılavuz borusunun yakın ucunu dişçi mumu ile kutunun bir yanına tutturun, ancak tel tero'nun her iki uçtan serbestçe çekilebilmesi için boruyu açık bırakın. Epoksi sertleşip tüm düzenek kuruduktan sonra, sonraki adım tero'yu sivriltmektir. Tero'nun ucunu keskin bir bistüri bıçağıyla keserek başlayın.

Ardından, orta ve ince kumlu zımpara diskleri takılmış, dikey konumlandırılmış küçük bir döner alet kullanarak tero'yu cilalayın. Döner aleti orta hızda döndürecek şekilde ayarlayın ve demeti ucuna yakın bir noktadan tutun. Penset yardımıyla, tel set ucunu zımpara diskine göre 45 derecelik bir açıyla eğik tutun.

Zımpara disklerinin dönüş yönünün, tel uçlarının sığ açısının tersi olması kritik önem taşır. Aksi takdirde tellerin ayrılması meydana gelebilir. Demeti orta kumlu zımpara diskine bir ila iki saniye boyunca nazikçe değdirin ve ardından ince kumlu zımpara diskine bir ila iki saniye daha değdirin.

Bu işlemi üç kez daha tekrarlayın. Her seferinde demeti eksenel olarak 90 derece döndürün. İşlem tamamlandığında, her bir telin ucundan küçük miktarlarda izolasyonun kaldırıldığını ve demet ucunun sivri bir uçla bittiğini ve herhangi bir saçaklanma olmadığını bir diseksiyon mikroskobu ile doğrulayın. Hem tekil teller arasında hem de her tel ile toprak plakası arasındaki empedanslar yeniden kontrol edildikten sonra.

Bakır sülfat doymuş çözeltisine ucunu daldırarak ilk teli 2,5 µA akımla kaplayın. Bir stimülasyon izolatörü kullanarak akımı bir saniye boyunca uygulayın. Bir saniye bekleyin ve bu işlemi üç kez tekrarlayın.

Ardından, kalan üç teli de aynı şekilde yerleştirin. Empedansı tekrar kontrol ettikten sonra, adaptörü çok kanallı bir kayıt sisteminin kafa aşamasına monte edin.

Metin protokolünde açıklandığı gibi bir hamamböceğini anestezi altına alıp sabitledikten sonra, bükülmüş bir böcek iğnesini bir mikro manipülatöre takın ve tero telinin ucunu dişçi mumu ile böcek iğnesine tutturun; kütikülü kaldırdıktan sonra O hücresi gözü arasında küçük bir pencere açmak için bir jilet kullanın. Beyni açığa çıkarmak için bağ dokularını ve yağları temizlemek üzere pens kullanın. Ardından, beynin kılıfını soymak için beyin dokusunu kaplayacak şekilde kafa kapsülüne hamamböceği salini ekleyin.

Beynin üzerindeki kılıfı nazikçe tutmak için ince bir pens kullanın ve tel implantasyon bölgesindeki kılıfı yırtmak için başka bir ince pens kullanın. Ardından, beynin ön tarafındaki baş kapsülünde küçük bir delik açmak için bir entomolojik iğne kullanın. Deliğe, 56 mikron çapında, yalıtılmış üç bakır telden oluşan bir örgü yerleştirin.

Referans toprak elektrodu olarak hizmet etmesi için, tetronun ucunu mikromanipülatör ile beyin yüzeyine indirin ve ilgi bölgesinin yakınına konumlandırın. Tetronun ön ve arka kısımlarına, kafa kapsülündeki delikten biraz daha büyük olan, iki çarpı bir milimetrelik iki küçük ince asetat levha parçasını dikkatlice yerleştirin.

Kayıt kalitesini izlerken, tetrodu beyin yüzeyinin 150 ila 250 mikron altına yavaşça indirin. Hem ilgilecek alanı hem de genel nöral doku canlılığını belirlemek için orta ila büyük boyutlu spontan hücre dışı spike'lar arayın. Tetrod konumundan memnun kaldığınızda, iki asetat levhayı tetroda değmeyecek şekilde ona mümkün olduğunca yakınlaştırın.

Kabloları koparmamak için dissection ve implantasyon sırasında son derece dikkatli olmak çok önemlidir. Hipodermik iğnenin ucunun düzleştirilmesiyle oluşturulmuş küçük bir spatula kullanarak, spatulayı bir alkol brülörü ile ısıtın. Ardından, spatulanın ucunda sıvı mum olacak şekilde spatulayı dental muma batırın.

Sıvı mumu, asetat sayfasının tero'dan en uzak olan ucuna dikkatlice değdirerek, sıvı mumun asetat sayfası ile kafa kütikülü arasındaki boşluğu kapatmasını sağlayın. Spatulayı ısıtmaya devam edin ve asetat sayfası üzerine az miktarda sıvı mum damlatın. Kademeli olarak tero'ya doğru ilerleyin ve son olarak tero'yu az miktarda dental mum ile sabitleyin.

Sıcak mumun boşluğa ve beynin üzerine gelmesini önleyin. Ardından, referans elektrodunu benzer şekilde mumla sabitleyin. Şimdi, tero'yu mikro manipülatöre bağlayan mumu, tero'yu ondan ayırmak için ısıtın.

Ardından, gerilimi azaltmak için tero'yu baş kısmındaki balmumuna halka şeklinde sabitleyin ve bu gerilim önleyici halkayı balmumuyla kaplayın. Bu noktada, kısıtlamaları dikkatlice kaldırın ve preparatı buz üzerinde bulunan bir Petri kabına aktarın. Preparatı, sırt tarafı yukarı gelecek şekilde büyük eyer iğneleriyle sabitleyin. Bir sıcak silikon tabancası kullanarak, pronotumdan karın bölgesine kadar uzanan bir tahta çubuk takın.

Ardından, tero tüpünün ucunu dental mum kullanarak çubuğun posterior ucuna sabitleyin. Daha sonra tero ve referans elektrodu dental mum ile çubuğun anterior ucuna sabitleyin. Ardından tero tüpünü soket ucundan mümkün olduğunca çekin, ancak sertçe asılmayın.

Hayvanın tero'nun açıkta kalan kısmına zarar verme ihtimalini ortadan kaldırmak için onu mum ile adaptöre sabitleyin. Tüm kısıtlamalar kaldırıldıktan sonra, referans elektrodu dental mum ile tero tüplerine tutturun. Yürüme deneyleri için davranışsal deneylere başlamadan önce, metin protokolünde belirtildiği gibi kaliteli nöral ve video kayıtları sağlayın; tırmanma deneyleri için hamam böceğinin pleksiglas bir arenayı keşfetmesine izin verin.

Hayvanın üzerinden tırmanabileceği veya altından geçebileceği bir raf engelinin veya hayvanın tırmanabileceği bir pleksiglas bloğun bulunduğu uzun ve dar bir arena kullanın. Kayıt sırasında, özelleştirilmiş bir MATLAB komutu kullanarak bilgisayardan bir TTL palsi oluşturun. TTL palsi, kayıt sistemi için bir zaman damgası oluşturur ve stimülasyon denemeleri için LED ışığını açar veya kapatır.

Beş mikro ampirlik DC akımın, bakırın beyne birikmesi için elektrot referans elektrodu ve tellerden birinin uçları üzerinden beş saniye boyunca uygulanmasının ardından deney tamamlandığında, kayıt telleri arasındaki akım darbesi dizileri davranışı uyarmak için kullanılabilir. Tel ucunun konumunu işaretlemek için, tek bir tero demeti içindeki tekil elektrotlardan alınan ham voltaj izleri burada gösterilmektedir. Farklı elektrotlar arasındaki voltaj izlerinin farklılığına dikkat ediniz.

MLU'lar kullanılarak üç ünite ayrıştırılmıştır. Dört elektrotun üçünde kaydedilen dalga formu enerjisinin üç boyutlu görünümü burada çizilmiştir. Her bir nokta, nihayetinde atandığı kümeye göre renk kodlanmış tek bir eşik olayıdır.

Bu anlık görüntü bir tırmanma denemesi videosundan alınmıştır; her karenin üzerinde normalize edilmiş hız, hamam böceğinin yüksekliği ve iki ayrıştırılmış ünitenin anlık ateşleme oranı gösterilmektedir. Zaman sıfır, tırmanmanın başladığı anı belirtir; ateşleme oranı sıfır ile bir arasına, hız ve yükseklik ise görüntüleme amaçlı olarak sıfır ile 0.5 arasına normalize edilmiştir. Her karenin altındaki işaretler, mevcut kareden önceki bir saniye içindeki iki ayrıştırılmış ünitenin spike'larını belirtir. Turuncu çizgi her karenin kapsadığı zamanı, mavi dikdörtgen ise mevcut karenin anlık ateşleme oranını hesaplamak için kullanılan kernel genişliğinin iki katını göstermektedir.

Bu kayıt, sağ yelpaze şeklindeki gövdede gerçekleştirilmiştir. Birinci birimin ateşleme hızı tırmanma sırasında artmış ve ateşleme hızındaki bu artış hız artışından önce gerçekleşmiştir. İkinci birim tırmanma öncesinde sessizdi ancak tırmanma başladıktan sonra ateşlemeye başlamıştır.

Arena Keşif Deneyi'nden alınan bu karede, kırmızı oval çizgi hamam böceğinin o karedeki şeklini, kırmızı kesikli çizgi ise hamam böceğinin kütle merkezinin önceki 10 karedeki konumunu göstermektedir. Dönüş ve ileri yürüme hızının yanı sıra unit two one'ın anlık ateşleme hızı burada gösterilmiştir. Mevcut karenin dört saniye öncesi ve sonrasındaki unit two, one spike'ları karenin altında gösterilmektedir.

Önceden olduğu gibi, turuncu çizgi her bir karenin kapsadığı süreyi ve mavi dikdörtgen, mevcut kare için anlık ateşleme hızını hesaplamak için kullanılan çekirdek genişliğinin iki katını belirtmektedir. Bu kayıt orta yelpaze gövdesinde yapılmıştır. Hamamböceğinin her karedeki konumu ve vücut yönelimi, metin protokolünde açıklanan takip yazılımı kullanılarak çıkarılmış ve ileri yönlü hız ile yönelim hızının yanı sıra anlık ateşleme hızını hesaplamak için kullanılmıştır.

Hamamböceği yürümeye başladığında Birim iki birin ateşleme hızı artmış ve bu durum yürüme hızıyla korelasyon göstermiştir. Birçok merkezi kompleks birimi için ateşleme hızındaki artış, belirli lokomosyon durumlarıyla sınırlıydı. Örneğin, birim iki bir, dönüş hızından bağımsız olarak ileriye doğru yürümeye ayarlıydı.

Videodaki hamam böceğinin yörüngesi burada gösterilmiştir. Büyük siyah nokta hamam böceğinin başlangıç noktasını, her bir küçük siyah nokta ise hamam böceğinin her karedeki konumunu belirtir. Yörünge, ikinci birimin anlık ateşleme hızını göstermek için mavi (düşük ateşleme hızını belirtir) ile kırmızı (yüksek ateşleme hızını belirtir) arasında renklerle kodlanmıştır.

Birim iki birin bu ateşleme hızı haritasında, X ekseni dönme hızını ve Y ekseni ileri yürüme hızını temsil eder. Pozitif dönme hızı sağa dönmeyi, negatif dönme hızı ise sola dönmeyi belirtir. Elektrot yerleşimi, metinde açıklanan histolojik prosedür sonrası görünen bakır çökelmeleri ile belirlenmiştir.

Alternatif olarak, elektrot floresan bir boya ile kaplanabilir ve konfokal mikroskopi ile konumlandırılabilir. Bu, ustalaşılmış olsa dahi toplamda birçok saat gerektiren karmaşık bir teknikler dizisidir; bu nedenle, implantasyon deneyine başlamadan önce unsurları alt kümelere ayırmak, birden fazla tero üretmek ve bunları test etmek en iyisidir.

Bir tero'nun teller arası ve bireysel empedansının uygunluğunu önceden test etmenin ve beyne implante ederken ve eşik değerlerini sabitlerken son derece dikkatli olmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Analiz prosedürünü basitleştirmek için otomatik gerçek zamanlı izleme gibi yöntemler dahil edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, serbestçe hareket eden bir böceğin fizyolojik aktivitesini karmaşık davranışlarla koordine etmek amacıyla tero'ların nasıl üretileceği ve implante edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.