Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, üç boyutlu bir invazyon testi kullanarak kanser hücrelerinin invaziv yeteneğini değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle kanser hücrelerinin bir bazal membran matriksinde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, hücrelerin matriks içerisindeki invazyonu beş veya daha fazla gün boyunca ışık mikroskobu aracılığıyla gözlemlenir.

Son adımda, ilgilenilen proteinlerin lokalizasyonu için hücreler floresan antikorlarla işaretlenir. Nihayetinde, kanser hücresi invazyon hızı ve protein ekspresyonunda meydana gelen değişiklikler immunofloresan mikroskopi ile analiz edilebilir. Bu tekniğin, Transwell haznesi invazyon deneyi gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, 3D major jel invazyon deneyinin kanser hücrelerinin büyüdüğü in vivo ortamı daha iyi taklit etmesidir.

Bu tekniğin önemi, kanser invazyonu ve metastazında rol oynayan yeni proteinlerin tanımlanabileceği kanser tedavisi alanına yöneliktir. Kültür prosedürüne başlamadan önce, bazal membran matrisini, bir P 200 pipeti ve pipet uçlarını gece boyunca dört santigrat derecede buz üzerinde bekletin. Ertesi gün, buz gibi soğuk 200 microliter pipetin ucunu kullanarak, konfokal numara bir cam tabanlı bir kabın tabanına 50 microliter matrisi spiral bir desen şeklinde yayın.

Ardından, matris katılaşırken kabı %5 karbon dioksit içeren 37 °C sıcaklıktaki bir hücre kültürü inkübatörüne en az 30 dakika boyunca yerleştirin. Hücreler ayrışmaya başladığında, %70 ila %80 konfluens düzeyindeki 100 mm'lik bir hücre plağına tripsin ekleyin. Tripsini 10 mL besiyeri ile inaktive edin ve ardından hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreler çökerken, hücreleri 4 °C'de 100 G kuvvetinde üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Her bir bazal membran matrisi plağı için bir adet bir mililitrelik mikro santrifüj tüpüne 50 µL matris alikotlayın ve hücrelerin santrifüj işlemi bittiğinde tüpleri buza yerleştirin. Pellete zarar vermeden süpernatantı aspire edin ve ardından hücreleri bir mililitre medyada süspanse edin; sonrasında hücre sayımı yapın.

2,5 x 10⁴ hücreyi yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu besiyeri ile 50 µL nihai hacme tamamlayın. Ardından, hücrelere bir bire bir oranda 50 µL buz gibi soğuk bazal membran matrisi ekleyerek nihai hacmi 100 µL'ye çıkarın. Matris ve hücre karışımını katılaşmış bazal membran matrisinin üzerine nazikçe ekleyin ve hücrelerin hücre kültür inkübatöründe matrise gömülmesini sağlayın.

30 dakika sonra, matrisi iki mililitre besiyeri ile kaplayın ve kabı inkübatöre geri yerleştirin; deney süresince besiyerini her gün değiştirin. Deney süresince her gün bir kez, bazal membran matrisi içinde süspansiyon halindeki kolonilerin 20 diferansiyel kontrast görüntüsünü almak için ışık mikroskobunun 10 x objektifini kullanın. Hücre kolonilerinin stellat oluşumunu belirlemek için görüntüleri körleme yöntemiyle analiz edin.

Hücre steroidinden bir veya daha fazla çıkıntı gözlemlenirse, koloni stellat olarak kabul edilir. 3D kolonilerin morfojenik özelliklerini incelemek için hücreleri inkübatörden çıkarın ve buzlu bir tepsiye yerleştirin. Medyumu aspire edin ve ardından koloniyi iki mililitre soğuk PBS ile üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, hücreleri iki mililitre %20 aseton, %80 metanol çözeltisi içerisinde dört santigrat derecede 20 dakika boyunca sabitleyin ve ardından kapları oda sıcaklığına getirin. Bazal membran matriksi oda sıcaklığına ulaştığında, sabitleyiciyi aspire edin ve plakayı az önce gösterildiği gibi üç kez PBS ile yıkayın. Son yıkamanın ardından, hücrelerdeki spesifik olmayan bağlanmaları engellemek için iki mililitre %3 BSA ile oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca bloklama yapın.

Ardından hücreleri, %3 BSA içinde seyreltilmiş ilgili primer antikorlar ile oda sıcaklığında inkübe edin. Bir saat sonra, bağlanmamış primer antikoru PBS ile üç kez yıkayarak uzaklaştırdıktan sonra primer antikor çözeltisini kaldırın; %3 BSA içinde uygun seyreltmede çözünmüş sekonder antikoru ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. Bağlanmamış sekonder antikoru PBS ile yıkayıp uzaklaştırdıktan sonra, hücre çekirdeklerini PBS içindeki iki mililitre hext 3, 3, 2, 5 8 ile karanlıkta beş dakika boyunca boyayın.

Ardından, hücrelerdeki bağlanmamış heksti beş kez PBS ile yıkayın. Beşinci yıkamadan sonra, bazal membran matriksi ile hücre karışımının bütünlüğünün bozulmasını önlemek için, mountlama medyumunu doğrudan karışıma ekleyin ve mountlama medyumunu bir lamelli camla dikkatlice kapatın. Kabı oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya bırakın, ardından bu görüntülerde kullanılan antikorlar için uygun lazer dalga boylarında floresan mikroskobu ile görüntüler elde edin.

3D bir matrise invaze olan MDA MB 2 3 1 hücreleri gösterilmiştir. Hücreler birinci günde matrise gömülmüş ve üçüncü güne gelindiğinde invaziv stelat yapılar oluşturmaya başlamıştır. Beşinci günde, matrisin tamamen invaze olduğu gözlemlenebilmiştir.

Ardından, oluşan stellat kolonilerin sayısı sayıldı ve her kap başına düşen toplam invaziv ve non-invaziv koloni sayısının yüzdesi olarak ifade edildi. Ayrıca, ölçümler beş gün boyunca günlük olarak tamamlandığı için, bu immünofloresan görüntülerde invazyon hızı da değerlendirilebildi. Membran bütünlüğü kaybı ve bazal membran proteini laminin beşin difüz lokalizasyonu sergileyen MDA MB 2 3 1 hücrelerinin temsili invaziv stellat kolonileri, MDA MB 2 31 meme kanseri hücrelerinde gözlemlenenlerle belirgin bir kontrast oluşturacak şekilde gösterilmiştir.

Laminin five, tedavi edilmemiş malign olmayan MCF 10 A hücrelerinin hafıza asinine bölgesini çevreleyen bozulmamış bir bazal membran tabakasında lokalize edilmiştir. Bu prosedürün ardından, kanser hücrelerinin mikroçevre gelişiminden sonra stromal hücrelerle etkileşime girip girmediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla stromal hücrelerle ko-kültür yapılabilir. Bu teknik, onkoloji alanındaki araştırmacıların, kanser hücrelerinin metastatik yayılımı için gerekli olan kanser invazyonu ve migrasyonunu incelemelerinin önünü açmıştır.