Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, üç boyutlu bir invazyon testi kullanarak kanser hücrelerinin invaziv yeteneğini değerlendirmektir. Bu, ilk olarak kanser hücrelerinin bir bazal membran matrisinde kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Matrisin hücresel istilası daha sonra ışık mikroskobu ile beş veya daha fazla gün boyunca gözlenir.

Son adımda, hücreler, ilgilenilen proteinlerin lokalizasyonu için floresan antikorlarla etiketlenir. Sonuç olarak, kanser hücresi istilasının hızı ve bunun sonucunda protein ekspresyonundaki değişiklikler immünofloresan mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu tekniğin Transwell oda istilası testi gibi mevcut tekniklere göre ana avantajı, 3D majör jel istila testinin, kanserin büyümeyi çözdüğü in vivo ortamı daha iyi taklit etmesidir.

Bu tekniğin anlamı, çalışmada kanser invazyonu ve metastazında rol oynayan yeni proteinlerin tanımlanabildiği kanser tedavisine yöneliktir. Kültür prosedürüne başlamadan önce, bazal membran matrisi a P 200 pipetini ve pipet uçlarını gece boyunca dört santigrat derecede buz üzerine yerleştirin. Ertesi gün, buz gibi soğuk 200 mikrolitrelik pipetin ucunu kullanarak 50 mikrolitrelik matrisi spiral bir desende konfokal bir numaralı cam tabanlı tabağın altına yayın.

Daha sonra, matris katılaşma sürecinden geçerken, en az 30 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin, tripsin gözleri,% 70 ila 80 birleşen 100 milimetrelik bir hücre plakası, hücreler ayrılmaya başladığında. Tripsini 10 mililitre ortamla etkisiz hale getirin ve ardından hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreler dönerken hücreleri 100 Gs ve dört santigrat derecede üç dakika santrifüjleyin.

50 mikrolitre matrisi, bazal membran matrisinin çanak başına bir mililitrelik mikro santrifüj tüpüne ayırın ve hücreler dönmeyi bitirdiğinde tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı aspire edin ve ardından yeniden canlandırın. Hücreleri bir mililitre ortamda askıya alın ve daha sonra sayın.

Dördüncü hücrelere 2,5 kez 10 kez yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu ortamla 50 mikrolitrelik bir son hacme kadar doldurun. Daha sonra 50 mikrolitre buz gibi soğuk bazal membran matrisini, 100 mikrolitrelik son hacim için bire bir oranında hücrelere ekleyin. Matrisi hücre karışımına katılaşmış bazal membran matrisi üzerine nazikçe kaplayın ve hücrelerin hücre kültürü inkübatöründeki matrise gömülmesine izin verin.

30 dakika sonra, matrisi iki mililitre ortamla örtün ve çanağı inkübatöre geri yerleştirin, deney süresince ortamı her gün değiştirin, deney süresince her gün bir kez bir ışık mikroskobunun 10 x objektifini kullanın 20 diferansiyel girişim almak için. Bazal membran matrisinde asılı duran kolonilerin kontrast görüntüleri. Hücre kolonisi yıldız oluşumunu belirlemek için görüntüleri körü körüne analiz edin.

Hücrelerin steroidinden bir veya daha fazla çıkıntı gözlenirse, bir koloni yıldız olarak kabul edilir. 3D kolonilerin morfojenik özelliklerini incelemek için, hücreleri inkübatörden çıkarın ve bir buz tepsisine yerleştirin. Ortamı aspire edin ve ardından koloniyi iki mililitre soğuk PBS ile üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, hücreleri iki mililitre% 20 aseton,% 80 metanol çözeltisinde dört santigrat derecede 20 dakika boyunca sabitleyin ve ardından bulaşıkları oda sıcaklığına geri getirin. Bazal membran matrisi oda sıcaklığına geldiğinde, fiksatifi aspire edin ve plakayı az önce gösterildiği gibi PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca iki mililitre% 3 BSA ile hücreler üzerindeki spesifik olmayan bağlanmaları bloke edin.

Daha sonra, oda sıcaklığında% 3 BSA içinde seyreltilmiş birincil antikorlardaki hücreleri inkübe edin. Bir saat sonra, bağlanmamış birincil antikoru PBS ile üç kez yıkadıktan sonra birincil antikor çözeltisini çıkarın, uygun seyreltmede% 3 BSA içinde çözünmüş ikincil antikoru ekleyin ve hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bağlanmamış ikincil antikoru PBS ile yıkadıktan sonra, hücrelerin çekirdeklerini karanlıkta beş dakika boyunca PBS'de iki mililitre hext 3, 3, 2, 5, 8 içinde boyayın.

Daha sonra bağlanmamış hext'i hücrelerden PBS ile beş kez yıkayın. Beşinci yıkamadan sonra, montaj ortamını doğrudan matrisin üzerine hücre karışımına ekleyin ve bazal membran matrisinin hücre karışımına bütünlüğünde herhangi bir bozulmayı önlemek için montaj ortamını bir cam kapak kızağı ile dikkatlice örtün. Çanağı gece boyunca oda sıcaklığında kurutun, ardından bu görüntülerde kullanılan antikorlar için uygun lazer dalga boylarında floresan mikroskop ile görüntüler elde edin.

Bir 3D matrisi istila eden MDA MB 2 3 1 hücreleri gösterilmiştir. Hücreler birinci günde matrise gömüldü ve üçüncü günde istilacı yıldız yapıları oluşturmaya başladı. Beşinci günde, matrisin tam bir istilası gözlemlenebilir.

Oluşan yıldız kolonilerinin sayısı daha sonra sayıldı ve tabak başına toplam istilacı ve invaziv olmayan koloni sayısının yüzdesi olarak ifade edildi. Ek olarak, ölçümler beş gün boyunca günlük olarak tamamlandığından, bu immünofloresan görüntülerde invazyon oranı da değerlendirilebildi. MDA MB 2 3 1 hücrelerinin temsili invaziv yıldız kolonileri, membran bütünlüğü kaybı ve bazal membran proteini laminin beşinin yaygın lokalizasyonu, MDA MB 2 31 meme kanseri hücrelerinde gözlenenin tam tersidir.

Laminin beş, tedavi edilmemiş malign olmayan MCF 10 A hücrelerinin hafıza asininini çevreleyen sağlam bir bazal membran tabakasına lokalize edildi. Bu prosedürü takiben, kanser hücrelerinin geliştikten sonra mikroçevredeki stromal hücrelerle çapraz iletişim kurup oluşturmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için stromal hücrelerle ko-kültür gerçekleştirilebilir. Bu teknik, her ikisi de kanser hücrelerinin metastatik yayılması için gerekli olan kanser istilası ve göçünü araştırmak için onkoloji alanındaki araştırmacıların yolunu açtı.