Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma Toto yılında Gürüntülenmesi C. elegans Gelişme
May 5th, 2014
Bu protokol, bir ışık mikroskobu tabaka setup ve C in vivo görüntüleme için uygulanmasını açıklamaktadır elegans embriyolar.
Bu prosedürün genel amacı, floresan ışık tabakası mikroskobu kullanarak C Allergan'ın gelişimini görüntülemektir. Bu, önce bir ışık tabakası oluşturmak için dik bir mikroskop ve küçük bir optomekanik eleman setinden oluşan ışık tabakası tabanlı mikroskobun kurulmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı embriyoyu monte etmektir.
Son adımlar, ışık tabakasını embriyo üzerine ayarlamak ve gelişimini kaydetmektir. Sonuçlar, 3D ve hızlandırılmış videoların analizi yoluyla CL egan'ın gelişimi sırasında floresan olarak işaretlenmiş proteinlerin dinamiklerini gösterebilir. Işık gemisi mikroskobunun konfokal mikroskopi gibi diğer mevcut yöntemlere göre temel avantajları, daha düşük fototoksisite ile daha hızlı görüntülemeye izin vermesidir.
Üçüncüsü, bu yöntem gelişime karşı mühür hakkında fikir verebilir. Roil veya zebra balığı gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürün gösterilmesi açık olacaktır.
Benim laboratuvarımdan bir mühendis olan Shales ve Van laboratuvarından bir mühendis olan Pauline Linac. Bu bölüm, kurulum montajını açıklar ve tüm deneyler için montajlı olarak bırakılabilir. Lazerler, filtreler, teleskop ve periskop optik masaya yerleştirildikten sonra, ışık tabakasını oluşturmak için silindirik lensi sabitleyin.
Odak için farklı bir lens ayarlanır. Aydınlatma hedefinin odak noktası, algılama hedefinin nesne odak noktası ile aynı olmalıdır. Şimdi, ışını duvara veya ekrana yansıtın ve projeksiyonun konturları keskin olana kadar aydınlatma nesnesini ışın ekseni boyunca hareket ettirin.
Mikroskop kurulumuna dört hatlı bir emisyon filtresi ve EMCD kamera dahil edin. İkinci manuel çeviri aşamasını birinciye dikey bir şekilde sabitleyin. Düzeneği mevcut mikroskop aşamasına vidalayın.
Ayarlanan silindirik lens aydınlatma objektifini çıkardıktan sonra, düzeneği mikroskobun üzerine yerleştirin ve aydınlatma setini sahnelere geri koyun. Qve tutucuyu aydınlatma yolu ile algılama yolunun dikey kesişimine takın. Şimdi, ışıklı sayfayı kontrol edin.
Bir cam damarı floresein solüsyonu ile doldurun ve sahnelerin üzerindeki tutucuya yerleştirin. Işık tabakası görünür olmalıdır. Algılama objektif merceğine göre yatay ve ortalanmış olmalıdır.
Ardından, silindirik lensi çıkarın. Aydınlatma hedefinin 3D çevirisi ile ışık tabakasını optimize edin ve ışık tabakasının kalınlığını ölçmek için bir görüntü elde edin. Bu, objektif merceğin diyafram açıklığına bağlıdır.
Ardından silindirik lensi değiştirdiğinizden emin olun. İlk önce, 10 milimetre x 20 milimetre kalınlığında bir cam parçası kesin. Elmas işaretleme kalemi kullanın.
Ardından, bir tarafa 20 mikrolitre poli L lizin ekleyin ve kuruduktan sonra ikinci bir slaytla yan yana getirin. Sabit bir konumda, %5'lik bir damla agar ekleyin ve üstüne yerleştirilmiş üçüncü bir sürgünün ağırlığı ile düzeltin. Agar kuruduktan sonra, üçüncü sürgüyü çıkarın ve agar pedini, poli L lizin içermeyen slayt üzerinde kalan iki sürgünün kenarından üç milimetre kesin.
Ardından, bir agar çıkıntısı bırakarak sabit sürgüyü çıkarın. Agarı 20 mikrolitre poli L lizin ile kaplayın ve kurumasını bekleyin. Şimdi GR solucanlarını bir diseksiyon mikroskobu altında M dokuz besiyeri ile doldurulmuş bir saat camına koyun.
Solucanları vulvaya bir neşter ile kesin, böylece yumurtaları serbest bırakın. Daha sonra ilgilenilen aşamada olan embriyoları belirleyin ve bunları bir mikro kılcal pipet ile toplayın. Embriyoları, agarın sınırında değil, lamın kenarının hemen yanında hazırlanan slayttan agar çıkıntısına aktarın.
Daha sonra sıvıyı çıkarırken embriyoları bir mikro kılcal pipetle hizalayın. Aspirasyon ile embriyolar poliol lizine yapışacaktır. İyi bir kayıt elde etmek için embriyoların iyi konumlandırılması çok önemlidir ve bunun için doğru aptüre sahip bir kılcal damar gerekir.
Çok küçükse, embriyoları serbest bırakmak zor olacaktır. Çok büyükse, sızan akışı sıkı bir şekilde kontrol etmek ve embriyoları hizalamak zor olacaktır, Slaytı bir Petri kabında M dokuz besiyeri ile örtün ve embriyoların büyütme kullanarak hala agar'a bağlı olduğunu onaylayın. Şimdi, embriyolarla hazırlanan slaytı bir damara sığan numune tutucuya sabitleyin.
Tutucu, bir damara uyacak şekilde tasarlanmış, şirket içi yapım bir mekanizmadır. Ardından, vete'yi bir Pizo elektrik sahnesine sabitleyin ve parlak alan aydınlatması altında bir embriyo bulun. Şimdi akustik optik ayarlanabilirliği kontrol eden yazılım paketini başlatın.
Kamerayı ve sahneyi filtreleyin. Buradaki bu yazılım şirket içinde yazılmıştır, ancak ücretsiz mikro yönetici yazılımı da kullanılabilir. İlk önce lazer çizgisini seçin.
Ardından, ışık tabakası en parlak olana kadar sahneyi x ekseni boyunca ayarlayın. Ardından, diğer iki boyutu, Y ve Z'yi, gürültü sinyali en iyi olana kadar ayarlayın. Bunun her embriyo için tekrarlanması gerekebilir.
Bu anahtar, iyi bir kayıt elde etmek için sinyal-oranı optimize etmek için serbest bir aşamanın çevirisini yapar, embriyonun ous simülasyonunu ve en iyi kontrastı elde etmek için sadece ilişki kurduğumda ve eliminasyon hedefini destekler. Şimdi hızlandırılmış görüntüler elde edin, lazer gücüne maruz kalmayı, zaman kazancını ve görüntüleme aralığını embriyonun floresan seviyesine ve analiz edilen biyolojik işlemin hızına göre ayarlayın. Zack için.
Görüntüleme, dilimler arasındaki mesafeyi ve başlangıç ve bitiş konumlarını bir histon GFP yapısını ifade eden bir şekilde ayarlar. Her 37 saniyede bir alınan 20 dilim yığını ile iki saatlik hızlandırılmış görüntüleme yapıldı. Hücre bölünmeleri, GFP'ye kaynaşmış tübülini ve m kirazına kaynaşmış taşını eksprese eden bir suşta açıkça görüldü Kayıtlar her 105 saniyede bir 16 dakika boyunca alındı.
3D işlemeler üç zaman noktasında gösterilir. Mitotik iğcikler ve yoğunlaştırılmış kromozomlar açıkça görülebilir ve hücre bölünmeleri boyunca kolayca izlenebilir. Üçüncü bir suşta, GFP'ye kaynaşmış APO lipoprotein vit iki, hücre zarının mCherry etiketlemesi ile görüntülendi.
13 dakikadan fazla, her 27 saniyede bir 10 dilim yığını alındı. Hızlı hareket eden lipoprotein parçacıklarını takip etmek kolaydı. Burada üretmek için daha karmaşık yöntemlerle oluşturulan ışık levhasını kullanıyoruz.
Işık levhası, uzamsal çözünürlüğü daha da iyileştirmek için uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, bir ışık tabakası mikroskobunun kurulumunu ve C. elegans embriyolarının in vivo görüntüleme için uygulanmasını açıklamaktadır. Yöntem, konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında daha hızlı görüntüleme ve daha düşük fototoksisite sağlar.
Ana Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Mikroskopi
Arka Plan
- Işık tabakası mikroskopi, biyolojik numunelerin görüntülemesinde eşsiz bir yaklaşım sunar.
- Bu teknik özellikle canlı embriyoları gözlemlemek için yararlıdır.
- Fotohasarı en aza indirirken hızlı görüntüleme sağlar.
- Uygulamalar C. elegans ötesinde çeşitli model organizmaları kapsar.
Çalışmanın Amacı
- Floresan ışık tabakası mikroskopi kullanarak C. elegans embriyolarının gelişimini görselleştirmek.
- Gelişme sırasında floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin dinamiklerini analiz etmek.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla ışık tabakası mikroskopinin avantajlarını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Optomekanik elemanlarla ışık tabakası mikroskobunun kurulumu.
- Agar pedleri ile hazırlanmış slaytlara embriyoların yerleştirilmesi.
- Görüntüleme için ışık tabakası hizalamasının optimizasyonu.
- Gelişimin işlenmesini yakalamak için embriyoların zaman-tarama görüntülemeleri.
Ana Sonuçlar
- C. elegans embriyolarında hücre bölünmeleri ve protein dinamiklerinin başarılı bir şekilde görüntülendirilmesi.
- Mitoz işipleri ve kromozomların 3D render'ları elde edildi.
- Hızlı hareket eden proteinlerin izlenmesinin mümkün olduğu gösterildi.
- Organizmanın gelişimsel süreçleri hakkında içgörüler sağlandı.
Sonuçlar
- Işık tabakası mikroskopi, in vivo görüntüleme için güçlü bir araçtır.
- Bu yöntem, embriyonik gelişimin anlaşılmasını geliştirir.
- Diğer model organizmalar ile kullanılmak üzere adapte edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
