Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma Toto yılında Gürüntülenmesi C. elegans Gelişme
5 Mayıs 2014
Bu protokol, bir ışık mikroskobu tabaka setup ve C in vivo görüntüleme için uygulanmasını açıklamaktadır elegans embriyolar.
Bu prosedürün genel amacı, floresan ışık tabakası mikroskobu kullanarak C Allergan'ın gelişimini görüntülemektir. Bu, önce bir ışık tabakası oluşturmak için dik bir mikroskop ve küçük bir optomekanik eleman setinden oluşan ışık tabakası tabanlı mikroskobun kurulmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı embriyoyu monte etmektir.
Son adımlar, ışık tabakasını embriyo üzerine ayarlamak ve gelişimini kaydetmektir. Sonuçlar, 3D ve hızlandırılmış videoların analizi yoluyla CL egan'ın gelişimi sırasında floresan olarak işaretlenmiş proteinlerin dinamiklerini gösterebilir. Işık gemisi mikroskobunun konfokal mikroskopi gibi diğer mevcut yöntemlere göre temel avantajları, daha düşük fototoksisite ile daha hızlı görüntülemeye izin vermesidir.
Üçüncüsü, bu yöntem gelişime karşı mühür hakkında fikir verebilir. Roil veya zebra balığı gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedürün gösterilmesi açık olacaktır.
Benim laboratuvarımdan bir mühendis olan Shales ve Van laboratuvarından bir mühendis olan Pauline Linac. Bu bölüm, kurulum montajını açıklar ve tüm deneyler için montajlı olarak bırakılabilir. Lazerler, filtreler, teleskop ve periskop optik masaya yerleştirildikten sonra, ışık tabakasını oluşturmak için silindirik lensi sabitleyin.
Odak için farklı bir lens ayarlanır. Aydınlatma hedefinin odak noktası, algılama hedefinin nesne odak noktası ile aynı olmalıdır. Şimdi, ışını duvara veya ekrana yansıtın ve projeksiyonun konturları keskin olana kadar aydınlatma nesnesini ışın ekseni boyunca hareket ettirin.
Mikroskop kurulumuna dört hatlı bir emisyon filtresi ve EMCD kamera dahil edin. İkinci manuel çeviri aşamasını birinciye dikey bir şekilde sabitleyin. Düzeneği mevcut mikroskop aşamasına vidalayın.
Ayarlanan silindirik lens aydınlatma objektifini çıkardıktan sonra, düzeneği mikroskobun üzerine yerleştirin ve aydınlatma setini sahnelere geri koyun. Qve tutucuyu aydınlatma yolu ile algılama yolunun dikey kesişimine takın. Şimdi, ışıklı sayfayı kontrol edin.
Bir cam damarı floresein solüsyonu ile doldurun ve sahnelerin üzerindeki tutucuya yerleştirin. Işık tabakası görünür olmalıdır. Algılama objektif merceğine göre yatay ve ortalanmış olmalıdır.
Ardından, silindirik lensi çıkarın. Aydınlatma hedefinin 3D çevirisi ile ışık tabakasını optimize edin ve ışık tabakasının kalınlığını ölçmek için bir görüntü elde edin. Bu, objektif merceğin diyafram açıklığına bağlıdır.
Ardından silindirik lensi değiştirdiğinizden emin olun. İlk önce, 10 milimetre x 20 milimetre kalınlığında bir cam parçası kesin. Elmas işaretleme kalemi kullanın.
Ardından, bir tarafa 20 mikrolitre poli L lizin ekleyin ve kuruduktan sonra ikinci bir slaytla yan yana getirin. Sabit bir konumda, %5'lik bir damla agar ekleyin ve üstüne yerleştirilmiş üçüncü bir sürgünün ağırlığı ile düzeltin. Agar kuruduktan sonra, üçüncü sürgüyü çıkarın ve agar pedini, poli L lizin içermeyen slayt üzerinde kalan iki sürgünün kenarından üç milimetre kesin.
Ardından, bir agar çıkıntısı bırakarak sabit sürgüyü çıkarın. Agarı 20 mikrolitre poli L lizin ile kaplayın ve kurumasını bekleyin. Şimdi GR solucanlarını bir diseksiyon mikroskobu altında M dokuz besiyeri ile doldurulmuş bir saat camına koyun.
Solucanları vulvaya bir neşter ile kesin, böylece yumurtaları serbest bırakın. Daha sonra ilgilenilen aşamada olan embriyoları belirleyin ve bunları bir mikro kılcal pipet ile toplayın. Embriyoları, agarın sınırında değil, lamın kenarının hemen yanında hazırlanan slayttan agar çıkıntısına aktarın.
Daha sonra sıvıyı çıkarırken embriyoları bir mikro kılcal pipetle hizalayın. Aspirasyon ile embriyolar poliol lizine yapışacaktır. İyi bir kayıt elde etmek için embriyoların iyi konumlandırılması çok önemlidir ve bunun için doğru aptüre sahip bir kılcal damar gerekir.
Çok küçükse, embriyoları serbest bırakmak zor olacaktır. Çok büyükse, sızan akışı sıkı bir şekilde kontrol etmek ve embriyoları hizalamak zor olacaktır, Slaytı bir Petri kabında M dokuz besiyeri ile örtün ve embriyoların büyütme kullanarak hala agar'a bağlı olduğunu onaylayın. Şimdi, embriyolarla hazırlanan slaytı bir damara sığan numune tutucuya sabitleyin.
Tutucu, bir damara uyacak şekilde tasarlanmış, şirket içi yapım bir mekanizmadır. Ardından, vete'yi bir Pizo elektrik sahnesine sabitleyin ve parlak alan aydınlatması altında bir embriyo bulun. Şimdi akustik optik ayarlanabilirliği kontrol eden yazılım paketini başlatın.
Kamerayı ve sahneyi filtreleyin. Buradaki bu yazılım şirket içinde yazılmıştır, ancak ücretsiz mikro yönetici yazılımı da kullanılabilir. İlk önce lazer çizgisini seçin.
Ardından, ışık tabakası en parlak olana kadar sahneyi x ekseni boyunca ayarlayın. Ardından, diğer iki boyutu, Y ve Z'yi, gürültü sinyali en iyi olana kadar ayarlayın. Bunun her embriyo için tekrarlanması gerekebilir.
Bu anahtar, iyi bir kayıt elde etmek için sinyal-oranı optimize etmek için serbest bir aşamanın çevirisini yapar, embriyonun ous simülasyonunu ve en iyi kontrastı elde etmek için sadece ilişki kurduğumda ve eliminasyon hedefini destekler. Şimdi hızlandırılmış görüntüler elde edin, lazer gücüne maruz kalmayı, zaman kazancını ve görüntüleme aralığını embriyonun floresan seviyesine ve analiz edilen biyolojik işlemin hızına göre ayarlayın. Zack için.
Görüntüleme, dilimler arasındaki mesafeyi ve başlangıç ve bitiş konumlarını bir histon GFP yapısını ifade eden bir şekilde ayarlar. Her 37 saniyede bir alınan 20 dilim yığını ile iki saatlik hızlandırılmış görüntüleme yapıldı. Hücre bölünmeleri, GFP'ye kaynaşmış tübülini ve m kirazına kaynaşmış taşını eksprese eden bir suşta açıkça görüldü Kayıtlar her 105 saniyede bir 16 dakika boyunca alındı.
3D işlemeler üç zaman noktasında gösterilir. Mitotik iğcikler ve yoğunlaştırılmış kromozomlar açıkça görülebilir ve hücre bölünmeleri boyunca kolayca izlenebilir. Üçüncü bir suşta, GFP'ye kaynaşmış APO lipoprotein vit iki, hücre zarının mCherry etiketlemesi ile görüntülendi.
13 dakikadan fazla, her 27 saniyede bir 10 dilim yığını alındı. Hızlı hareket eden lipoprotein parçacıklarını takip etmek kolaydı. Burada üretmek için daha karmaşık yöntemlerle oluşturulan ışık levhasını kullanıyoruz.
Işık levhası, uzamsal çözünürlüğü daha da iyileştirmek için uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, bir ışık sayfası mikroskobunun kurulumunu ve C. elegans embriyolarının in vivo görüntülemesi için uygulanmasını açıklamaktadır. Bu yöntem, konfokal mikroskopiye kıyasla daha düşük fototoksisite ile daha hızlı görüntüleme sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyofizik
- Mikroskopi
Arka Plan
- Işık levhası mikroskopisi, biyolojik örneklerin görüntülenmesi için benzersiz bir yaklaşım sunar.
- Bu teknik, özellikle canlı embriyoların gözlemlenmesinde oldukça faydalıdır.
- Hızlı görüntüleme imkanı sunarken fotohasararı minimize eder.
- Uygulamaları, C. elegans dışındaki çeşitli model organizmalara kadar uzanır.
Çalışmanın Amacı
- Fluoresan ışık sayfası mikroskobisi kullanarak C. elegans embriyolarının gelişimini görselleştirmek.
- Gelişim sırasında floresanla işaretlenmiş proteinlerin dinamiklerini analiz etmek.
- Işık sayfası mikroskobisinin geleneksel yöntemlere göre avantajlarını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Optomekanik elementler içeren bir ışık sayfası mikroskobunun kurulumu.
- Embriyoların agar pedli hazırlanmış lamlara yerleştirilmesi.
- Görüntüleme için ışık sayfası hizalamasının optimizasyonu.
- Gelişimsel süreçleri yakalamak için embriyoların zamanla seyreden (time-lapse) görüntülemesi.
Ana Sonuçlar
- C. elegans embriyolarında hücre bölünmelerinin ve protein dinamiklerinin başarılı şekilde görüntülenmesi.
- Mitotik iğlerin ve kromozomların 3D görüntülemeleri elde edildi.
- Hızlı hareket eden proteinleri takip etme yeteneği kanıtlandı.
- Organizmanın gelişim süreçlerine dair içgörüler sağlandı.
Sonuçlar
- Işık sayfa mikroskobisi, in vivo görüntüleme için güçlü bir araçtır.
- Bu yöntem, embriyonik gelişim anlayışını geliştirir.
- Diğer model organizmalarla kullanıma uygun hale getirilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Işık sayfası mikroskopisi, tüm organizma gelişiminin yüksek çözünürlüklü ve düşük fototoksisiteye sahip görüntülemesini sağlayarak, kantitatif ve dinamik fenotipik veriler sunarak erken keşif aşamasında hedef doğrulamasını destekler. Bu yaklaşım, canlı sistemlerdeki hücresel süreçlerin ve protein dinamiklerinin boylamsal takibine olanak tanıyarak preklinik modellerdeki biyolojik belirsizliği azaltır. Yöntem, yüksek içerikli tarama iş akışlarıyla uyumlu, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir görüntüleme çıktıları sağlayarak öncü bileşik belirlemede öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gelişen embriyolarda protein dinamiklerinin ve hücre bölünmelerinin hücre altı çözünürlükte görselleştirilmesi yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Düşük fototoksik koşullar altında gelişimsel fenotiplerin tekrarlanabilir ve kantitatif okumalarını sağlayarak biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Öngörücü Değer: Moleküler perturbasyonları gelişimsel sonuçlarla ilişkilendiren boylamsal, çok parametreli veri setleri oluşturarak portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tüm organizma bağlamlarında güvenilir bileşik etkisi değerlendirmesine olanak tanıyan, alt hücresel çözünürlüğe sahip standartlaştırılmış, 3D zaman atlamalı görüntüleme sağlar.
- Operasyonel Değer: Hassas ışık tabakası hizalaması ve stabilizasyon yoluyla analiz tekrarlanabilirliğini sağlar ve boylamsal görüntüleme oturumlarındaki değişkenliği minimize eder.
- Ölçeklenebilirlik: Çok kuyucuklu gözlem odaları ve otomatik tabla kontrolü ile uyumlu olup orta ölçekli tarama kampanyalarını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Standartlaştırılmış görüntüleme protokolleri kullanarak model sistemler genelinde tutarlı fenotipik değerlendirmeye olanak tanıyarak, keşif ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hedef etkileşim etkilerinin gelişimsel süreçler üzerindeki doğrudan gözlemlenmesine izin vererek, etki mekanizması çalışmalarındaki belirsizliği azaltır.
- Riskle Dengelenmiş İlerleme: Gelişimsel toksisite ve fenotipik normalizasyon metriklerine dayalı olarak, devam veya durdurma kararları için kantitatif eşikler sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif sürecine entegre olarak, tüm organizma modellerinde fenotipik tarama ve mekanistik çalışmalar için tahribatsız, kantitatif bir görüntüleme modalitesi sunar.
- Keşif Biyolojisi: Embriyogenez sırasında floresan işaretli proteinlerin ve hücresel yapıların gerçek zamanlı takibini sağlayarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Görüntüleme tutarlılığını sağlayan standartlaştırılmış lam hazırlama, ışık sayfası karakterizasyonu ve embriyo sabitleme protokolleri aracılığıyla analiz hazırlığı sunar.
- Analizler: Deneysel koşullar arasında objektif karşılaştırmaya olanak tanıyan kantitatif 3D ve zaman ayarlı okumalar (örneğin, mitotik iğ dinamiği, protein taşınımı) üretir.
- Translasyonel Araştırma: Korunmuş gelişimsel yolaklar için valide edilmiş bir model olan C. elegans'ta hastalıkla ilgili fenotipik okumalar sağlayarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Bir optik masa üzerinde modüler, sola monte edilen bir sistem olarak tasarlanmıştır ve projeler arasında minimum yeniden kalibrasyon ile tekrarlanan kullanıma imkan tanır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Protein dinamiklerinin ve hücresel davranışın doğrudan, boylamsal gözlemi aracılığıyla mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış opto-mekanik hizalama, lam hazırlama ve embriyo yerleştirme prosedürleri ile tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Gelişimsel toksisitenin erken tespitini sağlayarak sermaye verimliliğini artırır ve tanımlanamayan biyolojik riskler nedeniyle geç aşamadaki kayıpları azaltır.
- Portföy Etkisi: Hedef sınıfları genelinde ilerleme kararlarını bilgilendiren kantitatif, görüntüleme tabanlı fenotipik skorlar sunarak riskten arındırılmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Optik hizalama, floresan mikroskopisi ve canlı görüntüleme için numune hazırlama konularında uzmanlık gerektirir.
- Stabil bir optik masa, lazer kaynakları, objektifler, translasyon aşamaları ve tespit için EM-CCD veya sCMOS kamera gereklidir.
- Kullanıcılar ve merkezler arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için lam hazırlama, embriyo evreleme ve görüntüleme parametrelerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Diğer model sistemlere (örneğin, zebrafish, Drosophila) genişletme sırasında adaptasyon değerlendirmeleri; embriyo boyutunu, optik berraklaştırmayı ve montaj ortamı uyumluluğunu kapsar.
- Pratik sınırlamalar arasında, daha uzun görüntüleme oturumları için optimizasyon gerektirebilen embriyo immobilizasyon verimliliği ve geniş görüş alanlarında ışık sayfası düzenliliği yer alır.
