Name: Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Öğrenin hücre yüzeyi proteomik analizi için glikopeptid yakalama yöntemini. Bu teknik, düşük yoğunluklu glikosile hücre yüzeyi proteinlerini zenginleştirerek LC-MS analizi için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Simon Fraser Üniversitesi başlangıç ​​fonu tarafından desteklenmiştir.

1.. Hasat Membranlar <ol><li> Bir hücre peleti (~ 10 8 hücreleri) üzerine proteaz inhibitör kokteyli ile, hipotonik tampon maddesi (10 mM Tris-HCI, 10 mM KCI, 1.5 mM MgCl2, pH 8.0) ilave edilir ve buz üzerinde 15-30 dakika boyunca inkübe edin. Lyse şırınga iğneleri (5-10 geçiş) ile örnek geçen ya da bir Dounce homojenleştirici (15-30 vuruş) ile homojenize ile hücreler. Lisisin verimliliğini kontrol etmek Hemasitometre ve tripan mavi boya kullanın. </li><li> 3000 gx 15 dk lizatının bir diferansiyel santrifüjleme ile mikrozomal fraksiyonu elde edilir ve daha sonra da 100,000 gx 2 hr. İlk santrifüj nükleer fraksiyonu olan bir pelet alır ve süpernatan daha sonra santrifüj plazma membranı hem de zara bağlı organelleri 8 içerir, mikrozom kısmı olan bir ikinci pelet, oluşturur. Nihai süpernatan, sitosolik fraksiyonu. Daha fazla analizana için -80 ° C dondurucu içinde mikrozomal fraksiyonlar saklayınaşağıda gösterildiği gibidir. </li></ol> 2.., Çözülür denatüre ve Digest Membran Proteinleri <ol><li> Denatürasyon tampon maddesi (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP,% 0.5 Rapigest, pH 8) &#39;de mikrozomal fraksiyonu çözündürülür ve daha sonra 10 dakika boyunca 100 ° C&#39;de çözelti inkübe edin. </li><li> , Oda sıcaklığına kadar ısıtılmış çözeltisini 8 M nihai konsantrasyona kadar çözelti içinde çok yüksek saflıkta üre toz ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe örnek. </li><li> 15 mM nihai konsantrasyona kadar numuneye iyodoasetamid stok solüsyonu ekleyin ve numune içinde serbest tioller alkillemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe çözeltisi. 10 mM nihai konsantrasyona kadar numuneye DTT stok solüsyonu ilave edin ve aşırı iodoasetamid söndürmek için oda sıcaklığında diğer bir 10 dakika için çözelti inkübe edin. </li><li> PH 8 40 mM Tris tampon maddesi ile elde edilen çözelti 10x seyreltilir, ve daha sonra trypsi bir 01:20 oranında numuneye tripsin eklemektoplam proteine ​​n. Reaksiyon tamamlandıktan emin olmak için bir 37 ° C fırın içinde gece boyunca reaksiyonu sindirim koruyun. </li><li> Yani Rapigest HCI, aynı zamanda deterjan bozulduğu bir durum ile pH 1&#39;e numune solüsyonu asitleştirilerek sindirim iptal eder. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de Rapigest düşürebilir ve santrifüjleme ile geliştirilen çökelmesini çıkarın. </li><li> Bir C-18 katı faz ekstraksiyonu (SPE) kartuşlardan örnek peptidleri içeren ve hızlı vakumla ile elde edilen numunenin kuru süpernatantı temizlemek. </li><li> Önce ve sindirim etkinliğini doğrulamak için ise tripsin hazmından sonra numune SDS-PAGE analizi yapın. </li></ol> 3.. Glikopeptid Yakalama <ol><li> Bağlama tamponu (100 mM sodyum asetat, pH 5.5) &#39;de temizlenmiş peptidler çözülür. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 30 dakika için bir 10 mM nihai konsantrasyonda en peptit çözeltisi içine sodyum periodat ekleyin. Bu aldehitlere glikanlarında cis-diol grubu oksitlenir, Burada hidrazid kimya aracılığıyla reçineye bağlanması için glikanlar izin verir. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, 20 mM nihai konsantrasyona ve pH 5 sodyum sülfit ile aşırı periodat söndürülür. </li><li> Reçineye çift glikopeptidlere 01:04 (çözeltiye reçine) bir oranda peptit çözeltisi içine hidrazid türevlendirilmemiş reçine tanıtılması. , Tam bağlanma için uç uca rotasyon ile 1-2 gün boyunca 37 ° C&#39;de reaksiyonu inkübe edin. </li><li> Aşağıdaki her bir kez 1 ml reçine yıkanarak bağlanmamış peptidleri kaldırın: DI su, 1.5 M NaCl, metanol ve% 80 asetonitril. Son olarak, 100 mM NH4 HCO 3 sistemin tampon alışverişi için pH 8, 100 mM NH4 HCO 3 1 ml reçine, 3 kez yıkayın. <ol><li> (Isteğe bağlı) bağlı olmayan peptidlerin analizi için supernatant toplamak ve yıkar. </li></ol></li><li> Bir 37 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübasyona PNGase F ile reçineden N-peptidi bırakınn sonuna kadar uç dönme. Santrifüj ve% 80 asetonitril yıkama tarafından yayımlanan peptidler toplayın. LC-MS analizi için hızlı vakumla elde edilen çözelti kurutun. </li></ol> 4.. Ayrıca Fraksiyonu (İsteğe bağlı) Daha fazla örnek karmaşıklığını basitleştirmek için, elde edilen N-glıkopeptıtlerı ayırımlamak. Örneğin, 10 mM amonyak format,% 20 asetonitril ile pH 3&#39;e kurutuldu peptidler içinde yeniden çözülür ve peptidleri fraksiyonlanması güçlü katyon alışveriş (SCX) kromatografisi kullanır. Elde edilen yıkama sıvısı kurutun ve daha sonra, ters fazlı LC-MS ile 8,17,18 Elde edilen peptid fraksiyonları analiz. Çıkış N-glıkopeptıtlerın 5. Temizleme (İsteğe bağlı) Endişeler peptidlerin potansiyel kirlenme artış ise,% 0.1 formik asit içine kurutuldu peptidleri yeniden çözünmesine ve daha fazla ters fazlı LC-MS analizi, önceki peptidleri temizlemek için bir MCX SPE kolon. <strong&gt; Not: Veritabanı arama parametreleri. Reçine N-glıkopeptıtlerın seçici olarak ayrılması sırasında, PNGase F bir aspartik asit N-glikan bağlantılı asparagin dönüştürür. Bu nedenle, serbest N-glıkopeptıtlerın bir 0,9840 Da kütle kayma yoktur. Doğru bu peptidleri belirlemek için, bu değişiklik bu metionin ve sistein oksidasyon karbamido gibi ortak değişikliklerle birlikte, arama parametre ilave edilmesi gerekmektedir.

<ol><li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics+and+biomolecular+structure%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li>
<li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane%3A+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+dissection+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li>
<li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology. </a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li>
<li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+%28PROSPECTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li>
<li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation%2C+immunity%2C+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li>
<li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+spectrometry+reviews%22%5BJournal%5D)">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li>
<li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin+affinity+capture%2C+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li>
<li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry%2C+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li>
<li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li>
<li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li>
<li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+%28gagQP%29+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada hücre yüzey proteinleri profil için bir glikopeptid-yakalama stratejisini tanıtmak. Yöntem, bu tür salgılanmış kan gibi proteinler, yanı sıra diğer vücut sıvılarında veya hücre kültür ortamı içinde incelemek için uygulanabilir. Yöntemin başarısı numunelerin tam sindirim dayanır; bu nedenle, sindirim bir verimlilik SDS-PAGE karakterizasyonu, özellikle numunenin ilk kez analizi için, gereklidir. Tam bir sindirim zar proteinleri için zor olabilir ve sadece membran fraksiyonunun tam çözün...

Hücre yüzey proteinleri, hücre dışı çevre ile etkileşim ve bir hücrenin içine dışarıdan gelen sinyalleri iletir. Bu nedenle, hücre dışı matris proteinleri de dahil olmak üzere, bu proteinler, hücre biyolojisi ve çoğalma, büyüme, göç, farklılaşmadan benzeri yaşlanma ve fizyoloji kadar tüm yönleriyle kritik roller oynar. Yüzey proteinleri diğer hücrelerin, proteinler ve küçük moleküller 1-3 etkileşerek çalışır. Ilaçların fazla% 60 hücre yüzeyi proteinleri 4 hedeflenir gibi hücre yüzeyi proteinlerinin moleküler karakterizasyonu, biyologlar için değil, aynı zamanda farmasötik şirketler için sadece büyük bir ilgi çekmektedir. Üstün duyarlılık, ve protein ve peptitlerin tanımlanması için verim ile tandem kütle spektrometrisi (MS), küresel, proteomik 5,6 çalışmalar için güçlü bir araç olmuştur. Oysa, yüzey proteinleri gibi, MS tabanlı Proteomikte için önemli sorunlar teşkilÇoğu yüzey proteinleri düşük miktarlarda ve ağır değişiklikler ile mevcut. Yüzey proteinleri membran-yayılan bölgeleri bunları hidrofobik hale getirmek; Bu, özellikle çok pasolu zar proteinleri için geçerlidir. Bir deterjan yardımı olmadan, sulu çözeltiler içinde zar proteinleri çözmek için olan, böylece zordur; Bununla birlikte deterjanların kullanımı genellikle protein tanımlama HPLC ve MS 1,7,8 performansını engeller. Bu nedenle, membran proteinleri zayıf doğrudan LC-MS tabanlı proteomik karakterize edilmiştir. Glikozilasyon hücre yüzey proteinleri 9 içinde yer alan en önemli ve bol post-translasyonel modifikasyonlar biridir. Glikanların muazzam karmaşıklığı ve heterojenite peptidin MS sinyali 10 engelleyebilir. Bununla birlikte, pek çok yöntem proteomik yüzey proteinlerini zenginleştirmek ve önceki LC-MS analizi için proteinlerden şeker bölümlerine kaldırmak için bu tek değişiklik kullandık. Bu yöntems lektin bazlı afinite yakalama 11 ve hidrazid bazlı ya da borik asit bazlı kimyasal yakalama 12 hem de hidrofilik kromatografisi ayrımı 8,13 içerir. Glikanların kaldırılması normal proteinlere dönüştüren zar proteinleri ve büyük ölçüde MS karakterizasyonu kolaylaştırır. Glikosilasyon da zar proteinleri aksine, yüksek çözünürlüğe sahip olan salgılanmış proteinler yer alır, çünkü birçok glycoproteomic yöntem çözünür proteinler için optimize edilmiş, ve daha düşük seçicilik ve glikopeptid proteinleri 8,14 zar konuşlandırılmış olan duyarlılığı sahip olma eğilimi vardır. Başka yöntemler de ettirecek vardır, özellikle de, bu tür ultrasantrifüjleme 15 ve markalama stratejileri 16 kullananlar gibi hücre yüzeyi proteinleri. Membran proteinleri karakterize bizim yöntem ve diğer mevcut yöntemler arasında ayrıntılı bir karşılaştırma son zamanlarda 17 yürütülen ve sonuçları bizim yöntem eşit derecede iyi gerçekleştirebilirsiniz belirtti, eğer değildiTüm karşılaştırıldığında membran proteomiks yöntemlere göre daha iyi, ancak daha yüksek sadeliği ile. Araştırmacılar bu yöntemi kullanmak yardımcı olmak için, burada detay genel bir protokol. Bu yöntem, mevcut Glycoproteomics stratejileri çeşitli avantajları entegre ve zar glikoproteinlerinin için özel olarak tasarlanmış olan, ancak yöntem salgılanan proteinler için de aynı derecede iyi çalışır. Bu yöntemin özellikleri şunlardır: 1) zar proteinlerinin tam bir çözünmesi, 2) kullanılarak bir katı madde yakalama alt katmanını kullanırken, potansiyel sterik engellemeyi ortadan kaldırmak için glikoproteinlerin glıkopeptıtlerın bir zenginleştirme, 3) hidrazid kimyası kullanımı ile kovalent bağlar oluşturmak için glikopeptidler ve yakalama alt-tabaka, bağlı glikopeptitler yüksek glycoselectivity için sıkı yıkama tolere edebilir, ve 4) yeteneği azalır örnek kaybı ve daha kısa işlem süresi için, bir tüp içinde tüm yakalama işlemi yapmak için bu gibi. Bir değişken okuyan için bu yöntemi uyguladıktan sonrahücreler ve dokular dahil olmak üzere, biyolojik örneklerin ety biz glikoproteinler 8,17,18 için yüksek seçicilik (&gt; 90%) gözlenmiştir.

<table><tbody><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF</td><td>Suları</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum periodat</td><td>Sigma</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Jel Hz hidrazid jel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-6047</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Worthington Biyomedikal</td><td>LS02115</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C-18 kartuş</td><td>Sular</td><td>WAT054955</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX kartuş</td><td>Sular</td><td>186000252</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyl</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Amersco</td><td>568</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sülfit</td><td>Caledon</td><td>8360-1</td><td></td></tr><tr><td>İnvertaz</td><td>Sigma</td><td>I0408</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-1 tripsin</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Ribonükleaz B</td><td>Sigma</td><td>R7884</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Konalbümin</td><td>Sigma</td><td>C0755</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre yüzey proteomics için glikopeptiddir yakalama

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Hücre-dışı matris proteinleri de dahil olmak üzere hücre yüzeyi proteinleri, örneğin büyümesi, farklılaşması ve proliferasyonu gibi tüm önemli hücresel süreçleri ve fonksiyonlar, katılabilir. Bu proteinlerin kapsamlı bir karakterizasyonu biomarker keşif, hücre tipi belirlenmesi ve ilaç-hedef seçimi yanı sıra, hücre biyolojisi ve fizyolojisi anlayışımızı ilerletmek için yardımcı olmak için zengin bilgi sağlar. Yüzey proteinleri Ancak nedeniyle doğal olarak düşük yoğunlukta, yüksek hidrofobik ve ağır post-translasyonel modifikasyonlar, önemli analitik zorluklar oluşturmaktadır. Yüzey proteinleri üzerinde yaygın glikolizasyon yararlanarak, biz burada birkaç mevcut N-Glycoproteomics araçlarının avantajlarını entegre bir yüksek verimli glikopeptit yakalama yaklaşımını tanıtmak. Bizim yöntem yüzey proteinleri elde glıkopeptıtlerı zenginleştirmek ve LC-MS kullanılarak uyduruk Proteomikte için kendi glikanları kaldırabilirsiniz. Çözülmüş N-glycoproteome inf içerirprotein kimlik ve miktarı gibi glycoslasyonun sitelerinin ormation. Bu yöntem, kanser, kök hücreler ve ilaç zehirlenmesi gibi alanlarda bir dizi çalışma uygulanmıştır. Bu yöntemin örnekleri sınırlama nispeten büyük bir miktarı, sitosolik proteinler merkezli çalışmalara göre bu analiz için gerekli olan şekilde, bir yüzey zar proteinleri, en düşük yoğunlukta yer alır.

Deneysel prosedür temsili bir akış şeması Şekil 1 &#39;de özetlenmiştir. Etiketleme ve daha fazla fraksinasyon adımlar isteğe bağlıdır ve bilgilerini yeni yayın 18 tarif edilmiştir. Başka bir seçenek reçine ile reaksiyona girmeyen, değiştirilmemiş peptidleri, analiz etmektir. Değiştirilmemiş peptidleri analiz avantajları bu sıkı birleşme bölgesindeki klaudin gibi glikosile edilmemiş peptidler ve proteinler, potansiyel belirlemek; Ek bir avantaj daha doğru kantitatif olduğunu. Bu avantajlara d...

Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Bu prosedürün genel amacı, düşük bolluktaki hücre yüzeyi membran proteinlerini zenginleştirmektir. Bu işlem, öncelikle membran proteinlerinin denatüre edilmesi ve sindirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise glikanların oksitlenmesi ve glikozillenmiş peptidlerin bir reçine yüzeyinde yakalanmasıdır.Ardından, glikopeptit olmayan maddeler reçineden yıkanarak uzaklaştırılır. Son adım, lc MS analizi için N-bağlı glikopeptitlerin reçineden salınmasıdır. Nihayetinde, tanımlanan peptit dizisi, tanımlama ve nicelleştirme amacıyla proteinlerle yeniden eşleştirilebilir.Bugün size Geico peptit yakalama yönteminin nasıl çalıştığını göstereceğim. Bu tekniğin glikoprotein yakalama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, membran proteininin önce sindirilmesi ve glikopeptit yakalamanın tek bir kapta gerçekleştirilebilmesidir. Bu tekniğin uygulaması, hastalık biyobelirteçlerinin keşfine kadar genişleyebilir.Gator proteini kan ve diğer vücut sıvılarında salgılanabildiğinden ve kandaki dolaşıma giren, patolojik sürece özgü glikoproteinler prognoz ve tanı biyobelirteçleri olarak kullanılabildiğinden; ilk olarak, 1/100 oranında proteaz inhibitör kokteyli içeren dört mililitre hipotonik tampon h

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lektin-konjuge Poros boncuk HPLC için istihdam edildi. Glikopeptid standartları, pozitif ve negatif kontroller olarak görev yaptı. MARS-14 tükenmiş, tripsin-sindirilmiş insan plazma Kromatografi ve flow-through (FT) ve bağlı kesirler ESI-LC-MS/MS analizler için toplanmıştır. FT'ye göre glikopeptid bağlı fraksiyon zenginleştirilmiş.

Kompleks Biyolojik örnekler seçerek glikozile Peptitler zenginleştirin lektin HPLC Yöntemi

Her yerde bulunan ikinci haberci c-di-GMP, birçok bakterinin büyümesini ve davranışını kontrol eder. Hemen hemen her bakteri türünde c-di-GMP bağlayıcı proteinleri biyokimyasal olarak tanımlamak ve karakterize etmek için yeni bir Yakalama Bileşik Kütle Spektrometresi tabanlı teknoloji geliştirdik.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Bu kağıt, ECM protein bileşiminin (1) analizi, glikozilasyon yerleri (2) tespit edilmesi ve glıkan formlarının (3) yapısal karakterizasyon için sağlar, MS analizi için kardiyovasküler doku örnekleri hazırlamak için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji, diğer dokularda ECM'nin çalışma, minör modifikasyonlarla, uygulanabilir.

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Açık arama, daha önce bilinmeyen glikan bileşimleriyle süslenmiş glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar. Bu makalede, Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanan bakteriyel örnekler için açık arama ve müteakip glikan odaklı glikopeptid aramaları yapmak için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunulmuştur.

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) protein yapılarını ve fonksiyonlarını değiştirir. Birden fazla PTM tipinin aynı anda zenginleştirilmesi yöntemleri, analizlerde kapsama alanını en üst düzeye çıkarabilir. Çift fonksiyonlu Ti(IV)-immobilize metal afinite kromatografisini ve ardından pankreas dokularında protein N-glikozilasyon ve fosforilasyonun eşzamanlı zenginleştirilmesi ve analizi için kütle spektrometresini kullanan bir protokol sunuyoruz.

İnsan pankreas dokularından N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için spin-tip zenginleştirme stratejisi

Biyobelirteç progastrin salgılayan peptid (ProGRP) ile örneklenen kurutulmuş serum örneklerinden düşük bollukta biyobelirteçlerin belirlenmesi için bir protokol sunulmuştur. Antikor kaplı manyetik boncuklar, proteotipik bir ProGRP peptidinin seçici temizliği ve zenginleştirilmesi için kullanılır. Yakalanan peptit daha sonra sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi ile analiz edilir.

Düşük Bolluktaki Proteinlerin Hedeflenen Kütle Spektrometrisine Dayalı Protein Analizinde Mikro Örnekleme

Burada, çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu için bir proteomik iş akışını açıklıyoruz. Bu iş akışı, hücre yüzeyi proteini zenginleştirmeyi, müteakip numune hazırlamayı, bir LC-MS/MS platformu kullanarak analizi ve özel yazılımla veri işlemeyi içerir.

Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

Bu protokol, kanserlerin glikobiyolojisini daha iyi anlamak için gerekli olan karmaşık tümör mikro ortamlarındaki heterojen glikoproteom hakkında kapsamlı bilgiler sunan entegre bir omik teknolojisi olan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini detaylandırır.

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Öğrenin hücre yüzeyi proteomik analizi için glikopeptid yakalama yöntemini. Bu teknik, düşük yoğunluklu glikosile hücre yüzeyi proteinlerini zenginleştirerek LC-MS analizi için uygundur.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Daha fazla video keşfet