Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Bu prosedürün genel amacı, düşük bollukta hücre yüzey zarı proteinlerini zenginleştirmektir. Bu, önce zar proteinlerinin denatüre edilmesi ve sindirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, glikanları oksitlemek ve bir reçine yüzeyindeki glikosile peptitleri yakalamaktır.

Glikopeptid olmayanlar daha sonra reçineden yıkanır. Son adım, lc MS analizi için N-Bağlı Glikopeptidlerin reçineden salınmasıdır. Sonuç olarak, tanımlanan peptit dizisi, tanımlama ve niceleme amaçları için proteinlere geri eşlenebilir.

Bugün size Geico peptid yakalama ralinin nasıl çalıştığını göstereceğim. Bu tekniğin aşırı dozun temel avantajı, örneğin glikoprotein yakalama gibi mevcut olanların, önce zar proteininin sindirilmesi ve glikopeptidin yakalanmasının tek bir damarda gerçekleştirilebilmesidir. Bu tekniğin uygulanması, hastalık biyobelirtecinin keşfine kadar uzanabilir.

Timsah proteini kanda ve diğer vücut sıvılarında satılabildiğinden ve kanda dolaşan glikoprotein patolojik sürece özgü olduğundan prognoz ve tanı biyobelirteçleri olarak kullanılabilir. İlk olarak, bir ila 100 proteaz inhibitörü kokteyli ile dört mililitre hipotonik tampon hazırlayın. Yaklaşık 10 ila sekizinci hücre içeren bir hücre peletine bir mililitre hipotonik tampon ekleyin ve karışımı 15 ila 30 dakika inkübe edin Buz üzerinde, hücreleri iki mililitrelik bir şişeye aktarın ve numuneyi bir şırınga iğnesinden beş ila 10 kez geçirerek hücreleri bitleyin.

Sonra bir hemo sitometre ve trian mavisi boyama kullanın. Lizisin etkinliğini kontrol etmek için, bir mililitre lizatı üç mililitre artık hipotonik tampon ile birleştirin. Tüpü 15 dakika boyunca dört santigrat derecede 3000 kez G'de döndürün.

Süper süpernatanı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve peleti eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Ultrasantrifüj tüpünü iki saat boyunca dört santigrat derecede 100.000 kez G'de döndürün. Daha sonra, mikrozomal fraksiyonu 200 mikrolitre denatürasyon tamponunda çözün ve ardından çözeltiyi 10 dakika boyunca 100 santigrat derecede kaynatın.

Isıtılmış çözeltiyi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, sekiz molar nihai konsantrasyon elde etmek için ultra yüksek saflıkta üre tozu ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra 500 milimolar ekleyin. 15 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için numuneye Asetamid stok çözeltisi sunuyorum.

Daha sonra, numunedeki serbest tiyolleri alkillemek için çözeltiyi karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bunu takiben, 10 milimolar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için numuneye bir molar DTT stok çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika daha inkübe edin. Aşırı I oto Asetamid'i söndürmek için, elde edilen çözeltiyi PH sekizde 40 milimolar tris tamponu ile 10 kez seyreltin ve ardından numuneye toplam protein miktarına bir ila 20 oranında tripsin ekleyin.

Bradford testini kullanarak toplam protein miktarını elde edin. Reaksiyonun tamamlandığından emin olmak için sindirim reaksiyonunu gece boyunca 37 santigrat derece fırında tutun. Bittiğinde, numune çözeltisini 10 milimolar hidroklorik asit ile pH 1'e asitleştirerek sindirimi sonlandırın, bu aynı zamanda en hızlı bozunan bir durumdur.

Deterjan daha sonra bir inkübatörde bir saat boyunca 37 santigrat derecede en hızlı şekilde bozunur. İnkübasyondan sonra, geliştirilen çökeltmeyi santrifüjlemeyi takiben santrifüjleme ile uzaklaştırın. Numune peptitlerini içeren SUP natini bir C 18 katı faz ekstraksiyon kartuşu ile temizleyin ve elde edilen numuneyi hızlı vakum ile kurutun.

Sindirim verimliliğini doğrulamak için gezilerden ve sindirimden önce ve sonra numunelerin bir SDS sayfası analizi yapın. Bu noktada, temizlenmiş peptitleri 200 mikrolitre birleştirme tamponunda çözün. 10 milimolar nihai konsantrasyon vermek için peptit çözeltisine sodyum püriat ekledikten sonra.

Numuneyi oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin İnkübasyon tamamlandığında, oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyondan sonra 20 milimolar nihai konsantrasyon ve beş pH vermek için fazla rafı sodyum sülfit ile söndürün, 200 mikrolitre hidrosit türevi reçine çözeltisi ekleyin, pree dengelendi ve peptit çözeltisine tampon bağlayın. Reaksiyonu 37 santigrat derecede bir ila iki gün boyunca tam bağlantı için uçtan uca döndürme ile inkübe edin. Bittiğinde, reçineyi bir mililitre deiyonize su, bir mililitre 1.5 molar sodyum klorür, bir mililitre metanol ve bir mililitre %80 aseto nitril ile iki kez yıkayarak bağlanmamış peptitleri çıkarın.

Daha sonra, bağlanmamış peptitlerin analizi için süpernatanı ve yıkamaları toplayın. Numuneleri analize kadar eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Daha sonra reçineyi pH sekizde bir mililitre 100 milimolar amonyum bikarbonat ile üç kez yıkayın.

Son olarak, numune şişesine 300 mikrolitre amonyum bikarbonat ekleyin. N glikopeptidlerini reçineden serbest bırakmak için. PNG ACE F ekleyin ve numuneyi uçtan uca döndürme ile 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bunu takiben, salınan peptitleri santrifüjleme ile toplayın, ardından reçineyi bir mililitre% 80 asetil nitril ile yıkayın. Yıkamayı daha önce toplanmış olanla birleştirin. Son olarak, elde edilen çözeltiyi lc MS analizi için hız VAC'de kurutun.

Zenginleştirme yönteminden sonra alınan atipik glikopeptid spektrumu burada elde edilen glikopeptidde gösterilmiştir. N glikan uzaklaştırıldı ve glikana bağlı parçalama, P-N-G-A-F ile bir spartik aside dönüştürüldü. Bu nedenle, spektrum, herhangi bir proteomik arama motoru tarafından yaygın protein dizisi veritabanlarına karşı kolayca aranabilir.

Atipik lc MS. Yakalanan n glikopeptidlerin sonucu, bir hücre mikrozomal fraksiyonunun tek bir lc MS çalışmasından 100'den fazla glikoproteinin tanımlanabildiği burada gösterilmiştir. Hem glikoproteinler hem de glikopeptitler için zenginleştirme seçiciliği genellikle %90'dan fazladırBaşarılı bir analiz, daha fazla fraksiyonlama için bir SCX sütunu ve adım gradyanı kullanılarak %95'lik bir zenginleştirme seçiciliğine sahip olabilir. LCMS analizinden önceki numuneler genellikle glikoprotein tanımlamalarının sayısını iki katına çıkaracaktır.

Bazen elde edilen glikopeptidlerin miktarı düşük olduğunda, şişelerden biriken safsızlık son numunede gözlemlenebilir. Bu kirleticiler bir MCX sütunu ile giderilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, self servis membran proteinini incelemek için glikopeptid yakalama yöntemlerimizi nasıl kullanacağınızı iyi anladığınızı umuyorum.

Bu protokolü denerken, sorun giderme için her adım için örnekler ayırmak da önemlidir. Reaktifin hacmi, özel çalışmanız için de optimize edilebilir.