Lazer kaynaklı Arıza Spektroskopisi: Organ Doku Nanopartikülün en Mapping ve Nicelik için Yeni Bir Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, geleneksel optik mikroskopi ile tam uyumlu masaüstü cihazlar kullanarak biyolojik dokudaki organik ve inorganik elementlerin haritalanması ve miktarının belirlenmesi için basit ve sağlam bir yöntem sunmaktır. Bu işlem, materyalin parçalanmasını ve kıvılcım oluşumunu başlatmak için bir lazer darbesinin ilgili numuneye odaklanmasıyla gerçekleştirilir. Plazma, daha sonra bir spektrometre tarafından analiz edilen bir radyasyon yayar.

İkinci adım, ilgilenilen elementlere karşılık gelen spektral çizgilerin seçilip tanımlanması ve numune yüzeyinin taranmasıdır. Ardından, element konsantrasyonlarının belirlenmesine olanak tanımak için kalibrasyon ölçümleri gerçekleştirin. Son adım, kaydedilen tüm spektrumlardan faydalanarak, bir bağıl yoğunluk veya konsantrasyon ölçeği kullanarak numune dokusunun elementel haritalamasını oluşturmaktır.

Sonuç olarak, lazerle indüklenen plazma spektroskopisi, herhangi bir işaretleme yapmadan çeşitli elementlerin doku dağılımını göstermek için kullanılır. Mikro X-ışını floresansı veya kütle spektroskopisi tabanlı teknikler gibi mevcut diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, lazerle indüklenen plazma spektroskopisi veya LIBS uygulaması basit, atmosferik basınçta çalışan ve çoğu optik mikroskop sistemiyle uyumlu bir yöntemdir.

Ayrıca, mikron düzeyinde çözünürlük ile PPM seviyesinde hassasiyete ulaşılmasını sağlar. Bu yöntem, nanoparçacık etiketlemesine gerek kalmadan, metalik element içeren nanoparçacıkların bir doku örneği içindeki dağılımı gibi biyolojik çalışmalara uygulanan nanoteknolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Teknik, vücudun farklı organlarında, özellikle beyinde bulunabilecek bakır, demir ve alüminyum gibi anormal metalik elementleri saptamadaki düşük tespit limiti sayesinde patoloji alanına da genişletilebilir. Bu yöntem, nanoparçacık tespiti ve tanımlanması konusunda bilgi sağlayabilir.

Aynı zamanda TCU içindeki inorganik elementlerin saptanması veya heterojen element dağılımı gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu tür deneyler yürütecek olan bilim insanlarının, numunelere çok fazla zarar vermeden mümkün olduğunca yüksek bir sinyal elde etmek için görüntüleme ayarlarıyla uğraşmaları gerekecektir. Deneye, bu protokol için incelenecek numune lamlarını hazırlayarak başlayın.

Lam hazırlamak için gadolinyum nanopartikül solüsyonu enjekte edilmiş, tümör taşıyan farelerden organlar alınır. Organlardan alınan 100 µm kalınlığındaki kesitler bir kuvars lama veya Petri kabına yerleştirilir. Lamlar daima -80 °C'de saklanır.

Ardından, kalibrasyon için örnekleri hazırlayın. Sıfır nanomolar ile başlayıp beş milimolar ile sona eren konsantrasyonlarla birkaç viyali etiketleyin. Her bir viyal için, uygun konsantrasyonda 100 µL gadolinyum-su karışımı hazırlayın.

Bu işlem tamamlandığında, bir lam hazırlayın. İlk şişeden beş µL ölçün ve bunu kuvars lam veya Petri kabı boyunca damlatın. Damlayı, daha sonra kullanmak üzere tanımladığınızdan emin olun.

Çevresi boyunca üç milimetre ilerleyin ve bir sonraki konsantrasyondan beş mikrolitre lam üzerine yerleştirin. Geriye kalan çözeltilerin her biri için aynı işlemi tekrarlayın. Lam içeriğini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kurutun.

Bu düzenek, 1064 nanometre dalga boyunda bir ışın üreten nanosaniyelik bir neodimyum-alüminyum garnet lazer kullanır. Işının bir kısmını spektrometre sistemini senkronize etmek için kullanın. Diğer kısmı ise tüm deney boyunca lazer darbe enerjisini ayarlamak ve stabilize etmek için kullanılan, bilgisayar kontrollü bir atenüatör üzerinden yönlendirin.

Ardından, ışını oradaki numune bölgesine yönlendirin. Işını, yazılım kontrollü translasyon tablasına odaklayın. Bu tabla, numune tutucuyu sabit tutacaktır; numune yüzey tutucusunu izlemek için bir CCD kamera kullanılır.

Bir diğeri ise plazma püskürtmesini izlemek içindir. Örnek bozunmasından gelen ışığı, -26 °C'ye sabitlenmiş bir ICCD kameraya sahip döner bir spektrometre ile analiz edin. Ölçüm için, lazeri stabilize etmeye ve kamerayı -26 °C'de soğutmaya başlayın.

Deneyden 10 dakika önce. Hazır olduğunda, daraltıcıyı (attenuator) kullanarak darbe enerjisini beş millijoule değerine sabitleyin. Ardından, incelenecek bir örnek lamı alın ve bunu örnek tablasına yerleştirmeye hazırlanın.

Numuneyi motorlu numune tutucuya sabitleyin. Bu işlem tamamlandığında bilgisayara geri dönün. Numuneyi konumlandırmak için, numunenin bir kısmı lazer ışınının içinde kalacak şekilde sahneyi hareket ettirin.

Lazer odağını numune yüzeyinin yaklaşık 100 mikrometre altına ayarlayın. Bu işlem gerçekleştirildiğinde, lazer 50 mikrometre veya daha küçük kraterler oluşturur. Spektrometre giriş yarığı değerini 40 mikrometreye ve haritalama ölçümü için ICCD parametrelerini ayarlamak üzere bilgisayarı kullanın.

Numunenin belirli bir bölgesini hedeflemek için tutucu konumunu ayarlayın. Geniş spektrumlu bir ışık kaynağı kullanarak numunenin yüksek çözünürlüklü panoramik bir görüntüsünü alın. Ardından, libs tarama bölgesini ve çözünürlüğünü tanımlamak için yazılımı ve yakalanan görüntüyü kullanın.

Burada ızgara, noktalar arasında 100 µm olacak şekilde 100'e 100 boyutundadır. Izgara üzerindeki her bir noktada verilerin otomatik kazanımını başlatın. Bir spektrum ölçülür ve dosyaya kaydedilir.

Ölçümler yaklaşık 30 dakika içinde tamamlandığında, örnek diliminin ikinci bir görüntüsünü alın ve ardından tüm spektrumları daha sonra kullanılmak üzere tek bir veri dosyasında birleştirin. Sonrasında, örnek lamını çıkarın ve kalibrasyon örneklerini yerleştirmeye hazırlanın. Kalibrasyon örneklerinin bulunduğu kuvars lamı, bilgisayar başındayken taşıma tablasına sabitleyin.

İlk kalibrasyon örneğinin merkezini lazer yoluna yerleştirin. Deney parametrelerini sabit tutun ve bir spektrum kaydedin. Farklı gadolinyum konsantrasyonuna sahip her bir örnek için aynı işlemi tekrarlayın.

Bunlar, böbrek dokusunun farklı bölgelerinden kaydedilen tek çekim spektrum örnekleridir. Mavi spektrum böbreğin merkezi bölgesinden kaydedilmiştir. Kırmızı spektrum böbrek membranına karşılık gelirken, yeşil spektrum periferik bölgeye aittir.

Enjekte edilen gadolinyum tabanlı nanoparçacıklar, yüzeylerinde doca ligandı ile şelatlanmış gadolinyum iyonu içeren bir polislaan matrisinden oluşmaktadır. Kullanılan 286 nanometre ile 320 nanometre spektral aralığında gadolinyum, kalsiyum, demir, silikon ve alüminyum tespit edilebilmektedir. Örneğimin farklı bölgelerinde yoğunlukların nasıl değiştiğine dikkat ediniz; bu durum, element konsantrasyonlarının yüksek heterojenliğe sahip olduğunu göstermektedir. Fare böbreği kesitindeki gadolinyum, silikon ve demirin doku haritalaması, yaklaşık 100 mikrometre çözünürlüğe sahip LIBS verileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Ölçek yoğunluğu keyfi bir birimle ifade edilmiştir. Bu, doğal ışık görüntüsüdür. Karşılaştırma amacıyla, tümör örnekleri ile benzer sonuçlar elde edilmiştir.

Gadolinium ve SQ 20 B tümör dokusunun bu haritasında olduğu gibi, doğal ışık görüntüsünün üzerine yalancı renk ölçeği bindirilmiştir. Bu deney için nanopartiküller doğrudan tümöre uygulanmıştır. Bir saat sonra tümör çıkarılmış ve analiz için hazırlanmıştır.

Tümör hacminin yaklaşık yarısının bazı partiküller içerdiğine dikkat edin. Bu teknik, düzgün bir şekilde uygulandığında, bir santimetrekarelik örnekler için 100 mikrometre çözünürlükte bir saatten kısa sürede tamamlanabilir. LIBS işlemi yapılırken, ölçümlerin lazerle indüklenen plazmadan gerçekleştirildiğini hatırlamak önemlidir ve prosedürü takip ederek tüm deney boyunca tüm parametrelerin kontrol altında tutulması kritik önem taşır.

İlgilenilen süreçte yer alan hücre tipi gibi daha ileri soruları yanıtlamak amacıyla, komşu kesitler üzerinde immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, biyoloji ve tıbba uygulanan nanoteknoloji alanındaki araştırmacıların, biyolojik dokulardaki metalik element içeren bileşiklerin dağılımını incelemelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik dokulardaki çoklu elementleri haritalamak için LIBS tekniklerinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.