Name: Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Öğrenin, teleostlardan epaksiyal kas dokusunun diseksiyonu ve enzimatik ayrıştırılmasıyla miyojenik öncü hücreleri nasıl izole edip Laminin üzerinde kültüre edeceğinizi. Bu yöntem kas gelişimini in vitro çalışmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr için çok teşekkürler sunarım. Küçük balıklar ve kurbağalar için bu kültür protokol geliştirme ve uygulama, mesleki uzmanlık için Josep Planas ve Juan Castillo. Teşekkürler nedeniyle yorulmadan Matthew, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall Şarj dahil olmak üzere birçok balık (türlerin ve sayı hem de), kas dokusu diseksiyonu ve ayrışma ile destekli olan sayısız bireyler de vardır Ben Meyer, Ethan Remily ve Sinibaldo Romero. Bu çalışma Biyoloji start-up fonları Birmingham Bölümü, Proteaz Araştırma NIH Hibe # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 için Merkezi&#39;nde Alabama Üniversitesi tarafından desteklenen ve SORUN için NDSU Advance İLERİ NSF Grant # İKG-0811239 edildi. Desteği de UAB Beslenme Obezite Araştırma Merkezi ödülü # P30DK056336, NIH NIDDK tarafından sağlandı. Onun içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka illeNIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Etik Açıklama: Burada açıklanan omurgalı hayvanları kapsayan tüm deneyler Birmingham Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından önceden onaylanan ve Laboratuar Hayvan Refahı, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Ofisi tarafından oluşturulan kurallar ile tutarlı edildi Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı. Kültür 1. Hazırlanması <ol><li> (, 2 L başına 26,96 g 13,48 g / L) 9 mM NaHCO 3 (2 L başına 1.51 g), DMEM içinde 20 mM HEPES (2 L başına 9.53 g) aşağıdaki gibidir: orta taban hazırlayın. <ol><li> PH belirlemek HCI veya NaOH ile 7,40 ayarlayın. </li><li> Ozmolaliteye belirleyin ve (gerekirse) NaCl ile ~ 300 mOsm ayarlayın. </li><li> Filtre kadar 2-3 ay boyunca ışıktan korumalı 4 ° C (2) 1 L vakumlu sterilizasyon sistemleri ve mağaza ile sterilize edin. NOT: komple reaktif için Tablo 1 ve 2&#39;ye bakınız, araçları, consumables ve ekipman bilgisi. </li></ol></li><li> Ultra saf, steril su, 50 ml γ-ışınlanmış poli-L-lisin, 5 mg (&gt; 300,000 mw) eritilmesi ile poli-L-lizin ile muamele edilmiş plakalar hazırlayın. Lizin polimerlerin tam çözülmesini sağlayarak, oda sıcaklığında 10 dakika için ters çevirme ile yavaşça karıştırın. </li><li> Plaka tipi (Tablo 3) uygun olarak, her bir kuyuya, poli-L-lisin çözeltisinin gerekli miktarda Pipet. Plakalar 5 dakika için laminar akış başlığı içinde beklemeye bırakın. </li><li> Sonra, poli-L-lizin çözeltisi çıkarın ve steril su ile iki kez yıkanır. 20 dakika laminar akış başlığı içinde havada kurumaya plakaları izin verin. </li><li> Laminin 1 mg (Engelbreth-Holm-Swarm kökenli) elde edilir ve 20 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar, taban ortamı, 50 ml içinde çözülür. / Cm 2 2 mg poli-L-lizin ile muamele hücre kültürü plakalarına laminin çözüm uygulanır. (Farklı plaka boyutları bkz. Tablo 3) </li><li> Yavaşça fu sağlamak için bir çözüm girdapkapsama iyi ll. 24 saat boyunca laboratuvar bant ve inkübatör içinde yer plakaları Seal. Kuluçka kullanılan türleri için uygun bir sıcaklıkta (bkz. Tablo 7) ayarlanması gerekir, ve ek bir gaz kuluçka makinesine ilave edilmesi gerekir. NOT: laminin tohum hücreleri 24 saat önce plakalara uymak için izin verilmelidir. Aksi takdirde hiçbir hücre yapışması kötü sonuçlanacaktır. </li><li> Tablo 4&#39;te tarif edildiği gibi ortam hazırlar. Komple ortam iyi kullanım günü hazırlanır. </li><li> Doku izolasyonu için hazırlık olarak, aşağıdaki öğeleri ve otoklav monte: 300-500 ml beher (ler); cam Petri kapları; neşter kolları; forseps (ince ve kaba); Diseksiyon makas; ve su itici otoklav kağıt birkaç yaprak. NOT: diseksiyon işlemi ile yardım her kişi için, (2) neşter sapları, (1) forseps (tip kişisel tercihinize bağlı), (1) diseksiyon makas ve su itici otoklav kağıt (5-10) levhalaryeterlidir. </li><li> Yukarıdaki otoklavlanmış maddelerine ek olarak,% 70 etanol, ağırlık dengesi, steril 50 ml konik tüp (sayı kültür büyüklüğüne göre değişir) ve buz monte edin. </li></ol> 2.. Doku Diseksiyon <ol><li> Başlamadan önce, balık yeterli stok mevcut olduğundan emin olun. NOT: kullanılacak balık yaş kritik bir önem taşımaktadır. İki farklı türlerin balık benzer ağırlıkları olabilir, bir türün bir başka küçük balık türlerinin büyük bir balık daha fazla MPCs sahip olacaktır. Genel bir kural olarak, salmonidler çalışırken özellikle küçük balıklar gibi, en iyisidir. 4-6 aylık yaş ya da daha küçük (en fazla 15 g) alabalık uygun ise danionins için, bir yıla kadar eski balık, en iyi şekilde kullanılabilir. </li><li> Bir steril 50 ml konik tüp içine izolasyon ortamının, kısım 25 ml kesilmiş edilecek doku, her 5 g için. </li><li> , Kayıt kitle, ve sayı tüp (ler) tartılır. Tüpler buz üzerine yerleştirin. </li><li> 2-3 balık Euthanize&gt; 300 mg / L sodyum bikarbonat tamponlu tricaine metansülfonat daldırılarak bir zamanda. &gt; 5 dakika son verilmesine ve daha sonra 30 saniye boyunca (steril kap içinde bulunan)% 70 etanol içinde balık daldırılması için operküler hareketine izin verir. </li><li> % 70 etanol balık çıkarın ve su itici otoklav kağıda yerleştirin. Doğrudan opercula arkasında, yüzeysel, sığ bir kesi yapmak için bir neşter kullanabilirsiniz. Anılan kesi cilt tutarak ölçekler ve cilt kaldırmak ve balık kuyruk doğru çekin. </li><li> Cilt çıkarıldıktan sonra epaxial, her iki taraftan balık hızlı glikolitik &#39;beyaz&#39; kas (yan çizgi yakınında bulunan yavaş oksidatif &#39;kırmızı&#39; kas kaçınarak) ve izolasyon ortamında yer tüketim. Kurum tarafından gerektiği gibi balıkların kalan atın. Not: epaxial m izole kırmızı kas kaynaklı kültür MPCs tamamen mümkün olmakla birlikte, teleost MPCs kullanılarak neredeyse her yayın kullanmıştır hücreleriyotome. </li><li> Kas yeterli bir miktarı elde edilene kadar tekrar 2,4-2,6 adımları tekrarlayın. Diseksiyonu sırasında, havuza alınan kas dokusu hücre canlılığını korumak için buz üzerinde kalmasını sağlamak. </li></ol> 3.. Mekanik Ayrılma <ol><li> , Cam bir Petri kabı içine, kas dokusu 25 ml / 5 g bir tüp dökün. İki neşter kullanılarak bağlı ekli # 10 neşter, bir bulamaç veya püre kıvamına kıyma doku ile işler. Birbirine geçmiş neşter bıçakları çekerek bir &quot;arka-ve-ileri&quot; hareket iyi çalışır. NOT: doku homogenızers uygun görünse kaldırıldı değilse, canlı hücrelerin sayısı önemli ölçüde azalacaktır. </li><li> 25 ml serolojik pipet ve serolojik pipet kullanarak, bulamaç haline dokuyu çıkarmak ve orijinal konik tüp içinde değiştirin. </li><li> Tüm tüplerindeki tüm doku mekanik ayrışmış kadar tekrarlayın 3,1-3,2 adımları. </li><li> 300 xg 5 dakika ve 10 ° C için doku santrifüj </li><li> Follsantrifüj ötürü, 25 ml&#39;lik bir pipet serolojik, vakum aspiratör veya dikkatli olarak süzüldü medya süpernatanın 25 ml atın. </li><li> Her bir tüp, tekrar süspansiyon dokuya yıkama ortamı içinde 25 ml ilave edilir, ve yukarıdaki gibi recentrifuge. </li><li> Süpernatan her kaldırma yıkama ortamı ile iki kez yıkanır. </li></ol> 4. Enzimatik Ayrılma <ol><li> Aşama 3.4 esnasında (0.11 g/0.22 ml &#39;de ya da yeterli bir miktarda) Tip IV kolajenaz 0.22 g ve taban ortamı 44 ml birleştirerek kolajenaz solüsyon hazırlanır. </li><li> 4 ° C&#39;de 10-15 dakika süreyle bir beher içinde ilave edin Filtre 50 ml&#39;lik bir şırınga ve bir 0.45 um şırınga filtre ile sterilize edin. NOT: Birden fazla şırınga filtre kollajenaz hazırlık bağlı olarak gerekli olabilir. Worthington Biyokimyasal dışındaki satıcılarından elde Kolajenaz filtrasyon sırasında fazla zorluk teşkil etmektedir. Kolajenaz endomysium oluşturan kollajen peptid bağlar ayırmak için kullanılır. Busindirim myofibers bu koruyucu bariyeri kaldırır. </li><li> Kas dokusunun her bir g için,% 0.2 &#39;lik kolajenaz çözeltisi içinde tekrar süspansiyon doku. Kas dokusunun 5 g için, kollajenaz çözelti 10 ml ve taban ortamı 15 ml ekleyin. </li><li> Kolajenaz çözeltisi / baz ortamında (25 ml, örneğin 250 ul) içinde ml başına PSF 10 ul ekle. Bu enzimatik sindirme verimini etkileyecek gibi, doku de süspansiyon haline olduğundan emin olun. </li><li> Hafif sallama ile 18 ° C &#39;de 60 dakika boyunca kolajenaz kas dokusu inkübe edin. Bu hücre canlılığı etkileyebilir, ancak mekanik ayrışma ve türlerin derecesine bağlı olarak, sindirim kolajenaz, 90 dakika için uzatılabilir. </li><li> 12 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de kolajenaz sindirimi, konik santrifüj tüpleri izlenerek Yıkama ortamı içinde 25 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon doku atın. </li><li> Recentrifuge 5 dakika boyunca 300 x g &#39;de 12,6; C. Yıkama ortamının ile ikinci kez tekrarlayın. </li><li> Yıkama doku iki kez, 10 ml serolojik pipet ile yıkama ortamı ve trituratının 25 ml tekrar süspansiyon kas dokusu dokusu / orta homojenatında göreli kolaylıkla pipet ve geçinceye kadar sonra. 5-10 toz haline getirilmesini genellikle yeterlidir. <ol><li> 5 ml&#39;lik bir pipet serolojik ve daha sonra bir şınngaya bağlanmış bir 16 gauge metal kanül ile tekrarlayın. </li></ol></li><li> 12 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin konik borular Süpernatant süzün. </li><li> Yukarıdaki 5 dakika santrifüj sırasında, taban ortamının 5 ml tripsin 0.25 g birleştirerek tripsin sindirim solüsyon hazırlanır. </li><li> 10-15 dakika ve filtre, bir 20 ml şırınga ve 0.45 um şırınga filtre ile sterilize boyunca 4 ° C&#39;de karıştırılır. </li><li> Konik tüpler almak ve her bir tüpe kas dokusunun her 1 g tripsin çözeltisinin 100 ul ve ayrışma ortamı içinde 4.9 ml. EXA içinör., Tripsin çözeltisi 500 ul ve kas dokusunun 5 g ayrışma ortamı içinde 24.5 ml. Not: Tripsin bazal lamina kas kaynaklı öncü hücreleri ayrı bir serin proteazdır. </li><li> Süspanse tripsin / ayrışma doku orta iyi. 18 ° C&#39;de 20 dakika inkübe </li><li> 12 ° C&#39;de 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de ilk tripsin inkübasyon, ardından santrifüj tüplerine konik </li><li> Izolasyon ortamının 4 hacimlerine yüzer 1 hacim konsantrasyonunda izolasyon ortamı ile süpernatantlar birleştirerek tripsin nötralize. İkinci tripsin sindirim sırasında 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Dokusunun geri kalan topak için, tekrar birinci tripsin sindirimden süpernatan / izolasyon ortamı ile adım 4.15 sonra süpernatant birleştirerek, 4,12-4,15 yineleyin. </li><li> Alternatif olarak: kolajenaz ve tripsin sindirimler hücre verimi maksimize etmek için birleştirilebilir. &lt;ol&gt; <li> Bunu yapmak için, homojenat kolayca kanül geçer kadar kolajenaz, 20 ml şırıngaya bağlanmış bir metal (uzunluğunda, 6 ve 16 ölçü en uygun) bir kanül ile sindirmek çiğnemek. </li><li> Homojenat için (adım 4.10 hazırlandı) tripsin çözeltisi 500 ul ekleyin ve 20 dakika boyunca 18 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 12 ° C&#39;de 1 dakika boyunca 300 xg&#39;de inkübasyon, konik santrifüj tüpleri izlenerek </li><li> Izolasyon ortamının 4 hacimlerine yüzer 1 hacim konsantrasyonunda izolasyon ortamı ile süpernatantlar birleştirerek tripsin nötralize. </li><li> İkinci tripsin sindirim sırasında 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Standart protokol gibi adım 4.18 ile devam edin. </li></ol></li><li> 300 x g hızında 50 ml konik santrifüj tüpleri ve içine nihai süpernatan / izolasyon ortamı karışımı dağıtın 12 ° C&#39;de 10 dakika boyunca </li><li> Kaldır hücre bozmamaya özen yüzerPellet. Pipet her bir hücre pelletini eritilmesi Her tüpe tam ortam 2 ml,. </li><li> Bir 50 ml konik bir tüp içinde tam bir ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler birleştirin. </li><li> Yeniden süspansiyon haline getirilmiş, daha önce hücre havuzu ile birleştirerek, komple ortam 1 ml her bir tüp durulayın. </li><li> Bir metal kanül ile toz haline getirin ve 5-10 kez şırınga. </li><li> Tam ortam ile durulama, bir 100 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre. </li><li> 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre. </li><li> 50 ml için yeterli tam ortamı ilave edin ve 15 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj </li></ol> 5.. Sayma, seyreltme ve Hücre Tohumluk <ol><li> Adımda 4.25 final santrifüj takiben, dikkatli aktarmadan veya serolojik bir pipet ile süpernatant kaldırmak. Tam ortam 5 ml hücre pelletini. </li><li> Hücreler tamamen yeniden süspanse ile, 20 ul kaldırmak, Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu ile yer. </li><li> Trypan mavi boya 5 ul ekleyin ve 5 dakika bekleyin. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını belirler. </li><li> Belirlenmesi üzerine, gerekli konsantrasyona hücreleri seyreltin. Teleostlar&#39;ın MPCs iyi cm2 başına 150.000-200.000 hücre tohumlanır. Altı-çukurlu kaplama strateji için, 1.5 x 10 6 hücre seyreltilmesi -, ml başına 2.0 x 10 6 yeterli proliferasyonunu ve farklılaşmasını destekler. </li><li> Poli-L-lizin ile muamele edilmiş, laminin kaplanmış plakalar ve tohum hücreleri al. (Levha özel dilüsyonları ve kaplama miktarlar için Tablo 5 e bakınız.) Not: Tablo 6 çeşitli teleost türlerinden izole edilmiş kas dokusunun her bir gramı izole edilmiş hücrelerin ortalama sayısını tasvir etmektedir. Gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) do zebrabalıkları (D. rerio) göre kas dokusunun her bir gramı başına daha az MPCs gösterirler ve böylece uygun tohumlama için izole etmek için daha fazla balık gerektirir. </li><li> Uygun sıcaklıkta soğutma inkübatör laboratuvar bant ve yer plakaları Seal. (Fareler için kaydetmek) Burada listelenen tüm türlerden MPCs karbon dioksit (CO 2) takviyesi olmadan normal atmosferik koşullar altında inkübe edilebilir. (Bkz Tablo 7). </li><li> ALTERNATİF: Bazı laboratuvarlar MPCs 40 dakika boyunca kültür katmanlarından uymak için izin gerektiren bir protokol kabul etmiştir. <ol><li> Daha sonra herhangi bir gevşek biçimde bağlanmış ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için yıkama ortamı ile plakaları yıkayın. Uyarı: Bu adım kültür katmanlarından diğer hücrelerin &quot;non-spesifik&quot; yapışma (örneğin fibroblastlar) önlemek için çok önemlidir. </li><li> Inkübatör tam medya ve yer hücreleri ekleyin ve aşağıda detaylı olarak bakımı. </li></ol></li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Miyojenik programı, hangisi incelenen türlerin içinde, en kolay bir in vitro sistemi ile incelenebilir. Nitekim, izolasyon üzerine, miyojenik öncü hücreler (MPCs) balık veya memelilerde myosatellite hücreler (MKH) kolayca çoğalması, hücre döngüsü çekilmesi ve miyoblastların terminal farklılaşma ve doğmakta myotubes bu miyoblastların kaynaşmasını içeren çok iyi düzenlenmiş bu süreci girin. (Zebrabalıkları 67 ve 69 gökkuşağı alabalığı olası hariç) balık türlerinin transgenik gen haberci soyl...

Memeli Miyogenesis arasında dikkate değer bir anlayış C2C12 5, her iki primer fare (Mus musculus) miyoblast kültürleri ve iyi tanımlanmış bir fare-türevi hücre hattı bu sürecin tekrarlama yoluyla elde edilmiştir. 1950 6 başlayarak, bu kültürler diğer omurgalılarda uzantısı, Miyogenesis ile murinemyogenic programın anlayışında çok ilerleme yol açmış ve var. Buna ek olarak, tek bir hücre miyofiberde oluşan eksplant teknikleri uydu hücreleri ve çevreleyen myofibers 7-9 arasındaki etkileşimlerin bir anlayış üzerinden artmıştır. Hücre kültürleri edilir Miyogenesis araştırmalar için özellikle çekici dolayı kısa bir süre için ön-farklılaşmış hücre 10, RNAi için transfeksiyon nispi kolaylığı 11-14, 15,16 ve transgenik aşırı ekspresyonu çalışmaları 14,17,18, in vitro ve in vivo nakli 18-20 ardından genişleme ve hatta comptakson 21,22 karşısında miyojenik öncü hücreleri ve bunların düzenleyici ajanlar Arison&#39;ın. Nedeniyle, kültür sisteminin yapay çevreye farkları 5,23 tarif edilmiş olsa da, bu in vitro sistemler çok çekirdekli oluşumunu düzenleyen karmaşık program eden diseksiyon vazgeçilmez olduğu kanıtlanmıştır, terminal olarak farklılaşmış myofibersfrom myosatellite olarak bilinen çoğalma progenitör hücreler mononükleer memeliler arasında hücreler (MSC). Memeliler sınıfının dışında, ancak, Miyogenesis kontrol mekanizmalarının korunması ve / veya sapma kötü büyük ölçüde nedeniyle çeşitli takson miyojen öncü hücreleri (MPCs) ve miyoblastları kültüre de zorluk, anlaşılmaktadır. Gerçekten de, birinci miyoblast kültürler üç kuş 24-26, bir sürüngen 27, birkaç amfibiler, 28-30 ve bazı balıklar 1,3,4,31-33 &#39;de tarif edilmiştir. Ettik ikinci sürekli miyojenik hücre çizgilerikemirgenler 34-36 dışındaki rtebrates Japon bıldırcını (Cortunix japonica) türetilmiş olan tek memeli olmayan miyogenik hücre hattı, QM7 37 ile daha da nadirdir. Ölümsüzleşme birçok girişimlerine rağmen, bir teleost miyojenik hücre hattı sürüncemede kalır ve bu hücrelerin etkili tarnsfeksiyon için bir protokol, bu yıl sadece 15 yayınlandı. Böylece, omurgalıların çeşitli birincil MPCs ve miyoblastları kültürleme için açık ve iyi optimize edilmiş protokoller çok daha miyojen programın evrim bilgimizi genişletmek için değil sadece, ama atılımlar yapmak için karşılaştırmalı fizyoloji gücünü istihdam için gerekli insan iskelet kası hastalık ve bozuklukların tedavisi. Edebiyat MPC / myoblast izolasyon 38-49 birçok raporlar içerir iken, yazarlar kısa, genellikle eksik, biçimleri gibi izolasyonların protokolleri tanımlamak için yaygındır. Ayrıca, en öğretici protokolleri reported fareler 50-53 için geliştirilmiştir ve bunlardan bazıları bu protokoller kullanılamaz veya kas biyologlar tarafından kullanılan pratik içteki olmayan kemirgen türü yapma, antikor seçiminde 54,55 veya floresan transgenler 56,57 güveniyor. Görsel-işitsel rehberlik ve uzak akraba türlerde gösterdiği verimlilik ile tarif piscine, amfibiyene ve sürüngen Miyogenesis, ayrıntılı ve kapsamlı protokol, hakkında az bilinen ile, alanında en yararlı olacaktır. Ilk kez 1989 yılında 58 Powell ve arkadaşları tarafından açıklanan, aşağıdaki protokol başlangıçta (yani, gökkuşağı alabalığı, Oncorhynchus mykiss, ve Atlantik somon, Salmo salar) salmonid balıklar ve bazı büyük sazanlar (yani balığı, Carassiusauratusauratus) den MPCs ve miyoblastları izole etmek için geliştirilmiştir . 2000 yılında, Fauconneau ve Paboeuf gökkuşağı alabalığı 59 için birincil myoblast kültür optimize edilmiş ve minoroptimizations maDanioninae dalının (zebra balığı, Danio rerio ve dev danio, Devario aequipinnatus) nedeniyle Zebra balığı iş için kullanılabilir birçok genetik araçları 32 ve böylece yakın akrabaları birkaç küçük balıklardır kullanılamaması bu protokol de. Kemikli balıklar nedeniyle (en azından çoğu türlerde) onların farklı büyüme stratejisi için çalışma için cazip organizmalardır. Büyük alabalık, çoğu balıklar gibi, hatta yaşlılıkta 60-62 yılında, olgunluk bir asimptot münezzehtir büyüme potansiyeline sahip, belirsizcesine büyür. Zebra balığı aksine, bu tür dev danio 63 ve teleost balık tipik bıyıklı danio ekran büyüme potansiyelleri, onların doğrudan yan yana PPK hücre kaderinin seçim hipertrofisi karşı iskelet kas hiperplazi bir rolü olup olmadığını anlamak için ideal bir platform yapmak gibi büyük danionins. Aynı şekilde, nispeten yüksek hücre verimi ve VIAB ile, bu protokol, fareler ve axolotls ile kullanılabileceğini göstermiştirility endeksleri. Böyle Meksika Axolotl (Ambystomamexicanum) olarak Urodele semender, tüm uzuvlar ve kuyrukları 64-66 gibi dokularını yenilemek için olağanüstü bir yeteneği, sahip. Bu karakteristik iskelet kas kaybı ve yaşlanma bu amfibi ilginç modeller yapar. Bu tür çalışmalar için daha geniş bir karşılaştırmalı bağlam sağlayan, birçok balık türünün de yapıldığı gibi, aşağıda açıklanan protokolünü kullanarak, benzer bir yaklaşım yapılabilir. Gibi birçok gerçekten karşılaştırmalı biyolog veri (burada, bütün omurgalı soy) geniş spektrumu içinde analiz edildiğinde temel biyoloji ve dönüşümsel biyomedikal en anlamlı gelişmeler yapılabilir, takdir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tablo 1. Ayrıntılı Reaktif Bilgileri</td></tr><tr><td>Reaktif</td><td>Şirketi (Tercih Edilen V. Alternatif)</td><td>Katalog Numarası (Tercih Edilen V. Alternatif)</td><td>Kültür başına miktar</td></tr><tr><td>&gama;ışınlanmış poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich (MP Biyomedikal)</td><td>P5899 (ICN19454405)</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>DMEM (yüksek glikoz)</td><td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td><td>MT-50-003-PB (D7777)</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences ( Sigma-Aldrich)</td><td>CB-40232 (L2020)</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP328-500 (S5761)</td><td>1.51 g</td></tr><tr><td>HEPES (C8H18N2O4S)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP310-1 (H6147)</td><td>9.53 g</td></tr><tr><td>Antibiyotik/Antimikotik</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SV3007901 (A5955)</td><td>17-20 mL</td></tr><tr><td>Gentamisin Sülfat</td><td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td><td>BW17-519Z (G1397)</td><td>2-3 mL</td></tr><tr><td>Donör At Sera</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007403 (H1270)</td><td>75 mL</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Sera</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007103 (F2442)</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Kollajenaz (Tip IV)</td><td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td><td>LS004189 (C9891)</td><td>0.44 g</td></tr><tr><td>Tripsin (Pankreastan)</td><td>MP Biyomedikal (Sigma-Aldrich)</td><td>ICN15357125 (T5266)</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 2. Sarf Malzemeleri, Araçlar ve Ekipmanlar</td></tr><tr><td>Sarf Malzemeleri</td><td></td><td>Ekipman</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakaları</td><td>Forseps (kaba)</td><td>Serolojik pipetleyici</td><td></td></tr><tr><td>Steril 50 mL Konik tüpler</td><td>Forseps (İnce)</td><td>pH Metre</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar bandı</td><td>Neşter Kolları</td><td>Soğutma İnkübatörü (Ekoterm)</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m Vakumlu Sterilizasyon Sistemleri</td><td>Neşter Bıçakları (#10, #11)</td><td>Laminer Akış Başlığı</td><td></td></tr><tr><td>Su İtici Otoklav</td><td>Kağıdı Cerrahi Makas</td><td>Vakum Manifoldu</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipetler</td><td>Cam Petri Kapları</td><td>Mikroozmolalite Ölçer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>12-16 G Luer Kilitli Kanüller</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 3. Hücre Kültürü Plakalarının Kaplanması için Optimize Edilmiş Hacimler</td></tr><tr><td>Plaka Boyutu</td><td>cm^2 Kuyu başına</td><td>Poli-L-lizin*</td><td>Laminin**</td></tr><tr><td>6 kuyu</td><td>9.5</td><td>1.6 mL</td><td>1</td></tr><tr><td>24 kuyu</td><td>1.9</td><td>0.32</td><td>0.2</td></tr><tr><td>48 kuyu</td><td>0.95</td><td>0.16</td><td>0.1</td></tr><tr><td>96 kuyu</td><td>0.32</td><td>0.06</td><td>0.03</td></tr><tr><td>*0.1 mg/mL konsantrasyon</td><td>** 0.020 mg/mL konsantrasyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 4. İzolasyon, ayrışma ve kültür</td></tr><tr><td>reaktifi</td><td>ortamı İzolasyon</td><td>yıkama</td><td>ayrışma</td></tr><tr><td>baz ortamı</td><td>419.25 mL</td><td>395.40 mL</td><td>297.00 mL</td></tr><tr><td>gentamisin sülfat**</td><td>0.75 mL</td><td>0.60 mL-Donör</td><td></td></tr> <tr><td>At Serumu</td><td>75.00 mL</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu ***</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>* PSF: penisilin / streptomisin / fungizone kokteyli (100x); ** 50 mg / mL konsantrasyon; Characterized</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 5. Önerilen Seyreltmeler ve Kaplama Hacimleri</td></tr><tr><td>Plaka Boyutu</td><td>cm^2 Kuyu başına</td><td>Seyreltme</td><td>Kaplama Hacmi</td></tr><tr><td>6 kuyu</td><td>9.5</td><td>1.5-2.0x10^6 hücre/mL</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>24 kuyu</td><td>1.9</td><td>1.5-2.0x10^6 hücre/mL</td><td>250 &mu; L</td></tr><tr><td>48 kuyu</td><td>0.95</td><td>1.5-2.0x10^6 hücre/mL</td><td>150 &mu; L</td></tr><tr><td>96 kuyu</td><td>0.32</td><td>1.5-2.0x10^6 hücre/mL</td><td>50-100 &mu; L</td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 6. G doku başına ortalama hücre sayısı</td></tr><tr><td>Tür</td><td>Ortalama # hücre/g doku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio</td><td>6.400.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio dangila</td><td>1.783.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Devario aequipinnatus</td><td>1.797.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus mykiss</td><td>66.800</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 7. Önerilen Kuluçka Sıcaklıkları</td></tr><tr><td>Tür Sıcaklığı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio/ Devario spp.</td><td>26 - 28 & derece; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus/Salmo spp.</td><td>10* - 18 derece > C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambystoma mexicanum</td><td>18&deg; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>* Daha düşük sıcaklıklar, daha düşük çoğalma oranlarını destekler.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bazal omurgalı soylarından İlköğretim andmyogenic Öncü hücre / miyoblast kültürlerinin hazırlanması

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Nedeniyle in vivo miyojen programı eğitim ile ilgili doğasında zorluk ve zaman, iskelet kasının yerleşik yetişkin kök hücrelerinden elde edilen primer kültür sistemleri, miyojenik öncü hücreler (MPCs), memeli iskelet kas gelişimi anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmış ve var büyüme. Özellikle OMURGALI bazal takson arasında, ancak, veri kendini yenileme, çoğalmasını ve MPCs farklılaşmasını kontrol eden moleküler mekanizmaları açıklayan sınırlıdır. Özellikle ilgi apendiksinde kaybı (yani urodele amfibi) sonra hatırı sayılır postlarva iskelet miyofiberde oluşan hiperplazi (yani Kemikli balıklar) ve tam rejenerasyon geçmesi bazal omurgalıların yeteneğini altında yatan potansiyel mekanizmaları vardır. Buna ek olarak, kültürlü miyoblastların kullanımı rejenerasyonu ve kas kaynaklı programın tekrarlama ve aralarındaki farklar anlaşılmasına yardımcı olabilir. KarşıBu amaçla, biz detaylı olarak sağlam ve verimli bir protokol tarif (ve varyasyonlar burada) daha ile başlayan, miyojenik programın evrimini anlamak için bir platform olarak hücre kültüründe, MPCs ve döl, miyoblastları ve olgunlaşmamış miyotüpleri izole ve bakımı için bazal omurgalılar. Zebra balığı (Br.rerio) model organizma durumuna Capitalizing, biz sazan dalının Danioninae küçük balıklar, bu protokolün uygulanması hakkında rapor. Paralel olarak, bu protokol Meksika Axolotl (Ambystomamexicanum) ve hatta laboratuar kemirgenlerden MPCs izole edilmesi suretiyle daha geniş bir karşılaştırmalı bir yaklaşım gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu protokol, artık yaygın gökkuşağı alabalık, somon, ve çipura 1-4 dahil olmak üzere çeşitli balık türleri, Miyogenesis okuyan kullanılmaktadır.

Yirmi dört saat sonra tohumlama, miyojenik öncü hücreleri (MPCs) (Şekil 1a ve 1d bakınız) laminin alt tabaka bağlı görünür olmalıdır. Tohumlamadan sonra, hücreler (MPCs) bu hücre tipi göstergesi olan bir mil benzeri bir şekle, (Şekil 1) kabul etmek ve MyoD1 + (Şekil 2) vardır. Danio türlerde, MPCs Oncorhynchus ve Salmo türlerden MPCs göre daha küçük bir bipolar işlemleri ile daha küçük olduğu görülmektedir. Ancak, kültür dört ...

Vitro kültürü sistemleri omurgalı Miyogenesis anlayışımıza vazgeçilmez kanıtlanmıştır. Ancak, çok özellikle bazal taksa içinde, memeli olmayana iskelet kas gelişimi ve büyüme öğrendi gerekmektedir. Bu doku, kas kaynaklı öncü hücreleri (MPCs) yetişkin kök hücrelerin izole edilmesi ve bir birincil kültür ortamda kendi kendini yenileme, proliferasyon ve farklılaşma korumak için etkili ve güçlü bir protokol boyunca korunmuş ve farklı düzenleyici mekanizmaların tanımlanması için sağlar: omurgalı soy.

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Bu prosedürün genel amacı, teleost balıklardan miyojenik öncül hücrelerin kültürü yapılarak in vitro miyogenezin gerçekleştirilmesidir. Bu işlem, öncelikle organizmadan epaksiyal kasın diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise izole edilen dokunun mekanik olarak ayrıştırılmasıdır.Ardından, istenen hücreleri dağıtmak için doku enzimatik olarak ayrıştırılır. Son adım, izole edilen miyojenik öncül hücrelerin Lamin alt tabakasına ekilmesidir. Nihayetinde in vitro.Miyogenez; çeşitli tedavilerin gen düzenlemesi ve ekspresyonundaki değişiklikler, protein ekspresyonu ve hücre fenotipi değişiklikleri üzerindeki etkilerini göstermek için kullanılır. Bu video, teleost miyojenik öncül hücrelerinden bir birincil kültür sisteminin nasıl kurulacağını gösterecektir. Bazı disosiyasyon adımlarının öğrenilmesi zor olabileceğinden, bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi büyük önem taşımaktadır.Sonraki kültürleme aşaması için yeterli miktarda hücre peleti izole edebilmek adına, uygun ve yeterli bir disosiyasyon hayati önem taşır. Başlamak için, prosedür için gerekli olan tüm besiyerlerini ve çözeltileri hazırlayın. Ardından, doku izolasyonu için gerekli olan ek malzemeleri bir araya getirin.

preparation-primary-myogenic-precursor-cellmyoblast-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Üretimli kas dokusu hastalığı modeli olarak hem de eti için alternatif bir kaynak olarak, rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahiptir. Burada fare miyoblast projenitör hücreleri ve elektrik sinyalleri tarafından uyarılması, bu durumda, bir kas yapısının mühendislik açıklanmaktadır.

Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Bu protokol, kas veya cilt dokusundan miyojenik ve fibroblast hücre hatlarının canlı hücre izolasyonu ve birincil kültürü için teknikleri açıklar.  Bu hücre dizilerinin ölümsüzleştirilmesi için bir teknik de tarif edilmiştir.  Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Burada, paralel sirkadiyen biyolüminesansı ve insan adacık hücrelerinin ve birincil miyotüplerin salgı aktivitesini izlemek için ayarları açıklıyoruz. Bunun için, bir lusiferaz çekirdek saat raportörünün lentiviral gen iletimini, ardından in vitro senkronizasyonu ve sürekli hücre perifüzyonu ile çıkış ortamının toplanmasını kullandık.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Bu protokol, yetişkin ve yaşlı insanların iskelet kasından izole edilmesi ve miyoblast progenitör hücrelerin kültür sağlam tekrarlanabilir ve basit bir yöntem tarif eder. Burada kullanılan kaslar ayak ve bacak kaslarını içerir. Bu yaklaşım, fonksiyonel çalışmalar için birincil miyoblastların zenginleştirilmiş popülasyonun izolasyon sağlar.

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Kas iskelet farklılaşma özellikle nükleer konumlandırma üzerinde dayanır son derece dinamik bir süreçtir. Burada, yanında canlı hücre düşsel myoblast farklılaşma ve myotube oluşumu sırasında çekirdeği hareketlerini takip ve otomatik izleme bilgileri ayıklanıyor tarafından çekirdek dynamics nicel bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

İskelet kası, her biri kas homeostazına ve rejenerasyonuna özel bir katkısı olan yerleşik kök hücreler de dahil olmak üzere birden fazla hücre tipinden oluşur. Burada, fizyolojik, in vivo ve çevresel özelliklerin çoğunu koruyan ex vivo bir ortamda kas kök hücrelerinin 2 boyutlu kültürü ve kas hücresi nişi açıklanmaktadır.

Niş ve Kök Hücre Sessizliğini Özetlemek için Fare İskelet Kasının Fraksiyone Edilmemiş Toplu Kültürü

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Öğrenin, teleostlardan epaksiyal kas dokusunun diseksiyonu ve enzimatik ayrıştırılmasıyla miyojenik öncü hücreleri nasıl izole edip Laminin üzerinde kültüre edeceğinizi. Bu yöntem kas gelişimini in vitro çalışmak için kullanılır.

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

Daha fazla video keşfet