GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, hipokampal nöronlarda gabaa reseptörü yüzey lokalizasyonunu ve endositozu ölçmektir. Bu, önce hipokampal nöronların etiketli gabaa reseptörü alt birimi ile transekte edilmesi ve kültürlenmiş nöronların inkübatörde gelişmesine izin verilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, yüzey gabaa reseptörlerini alfa bungalov toin birleştirilmiş floresan Alexa kalıbı ile etiketlemektir.

Daha sonra, etiketli reseptörlerin endositoz olmasına izin vermek için nöronlar çeşitli zaman noktaları için inkübe edilir. Son adım, numuneleri uygun zaman noktalarında sabitlemek ve toplam etiketli reseptör havuzunu gözlemlemek için anti GFP kullanarak immüno boyama yapmaktır. Sonuç olarak, sabit veya canlı görüntüleme yaklaşımları kullanılarak etiketli gabaa reseptörlerinin yüzey lokalizasyonu ve endositozundaki değişiklikleri göstermek için konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem, ligand bağlanmasının reseptör endositozu ve yerleştirme oranları üzerinde ne gibi bir etkisi olabileceği ve farklı ligandların ve modülatörlerin reseptör geri dönüşümünü ve bozunmasını etkileyip etkilemeyeceği gibi reseptör kaçakçılığı alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu yöntem, öncelikle sinir sistemi bağlamında bağlanmış iyon kanallarını ve G-proteinine bağlı reseptörleri incelemek için kullanılmış olsa da, hücre kültüründe ve çeşitli dokuların birincil hücrelerinde diğer zar proteinlerinin dinamik lokalizasyonunu ve ticaretini incelemek için de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler iki nedenden dolayı mücadele edeceklerdir.

Birincisi, işlevsel yapılar oluşturmak ve ikinci olarak birkaç zaman noktasını aynı anda işlemek için gereken uygulama ve deneyimleri oluşturmak. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi her 3,5 santimetrelik doku kültürü kabının içine dört ila beş yuvarlak poli de lizin kaplı cam kapak fişi hazırlayın. Daha sonra, kültür gününde yeni ayrışmış nöronları bir ila dört mikrogram maxi hazırlanmış yapı DNA plakası ile transfekte edin.

Poli de lisin kaplı örtü üzerindeki transfekte nöronlar, 3.5 santimetrelik çanak başına yaklaşık 200.000 nöronluk bir nihai yoğunlukta kayar. Nöronal kültürlerin hazırlanmasından dört ila 24 saat sonra ortamı değiştirin. Daha sonra nöronların inkübatörde 14 ila 17 gün in vitro veya endositoz testini gerçekleştirmek için istenen aşamaya kadar gelişmesine izin verin.

İlk olarak, bir tezgah üstü soğutma ısıtma cihazını 16 santigrat dereceye ayarlayın. Hücre dışı yığınları, tamponlu tuzlu suyu veya HBS'yi bir su banyosunda 16 santigrat dereceye kadar soğutun. Nöron çanaklarını 16 santigrat derecede alüminyum plakaya aktarın ve beş dakika soğutun.

Ortamı çıkarın ve iki dakika boyunca bir mililitre 16 santigrat derece HBS artı 150 Mikromolar iki Bo Rine ile değiştirin. Daha sonra, ortamı etiketli bir atık kabına çıkarın ve bir mililitre 16 santigrat derece HBS artı iki bo kerin artı alfa bungalov toksini ile değiştirin. Alexa 5 9 4, 16 santigrat derecede 15 dakika inkübe edilir.

İnkübasyonun ardından, ortamı etiketli bir atık kabına aktarın ve cam tabanlı 3,5 santimetrelik bir kültür kabı kullanarak reseptör endositozunu takiben canlı görüntüleme zaman serisi deneyleri için bulaşıkları iki mililitre 16 santigrat derece HBS ile üç kez yıkayın. Çanağı mikroskopta ısıtılmış bir aşamaya aktarın ve konfokal veya çim mikroskobu ile görüntülemeye başlayın. Sabit kapak fişleri için ayarlayın.

Transfer T, sıfır zaman noktası kapağına, diğer zaman noktaları için 20 dakika boyunca% 4 para formaldehit,% 4 sükroz olan bir tabağa kayar. HBS'yi şartlandırılmış dengelenmiş 37 santigrat derece ortamla değiştirin ve gereken zaman noktalarında 37 santigrat derecede endositoz için inkübatöre geri dönün. İnkübatörden bulaşıkları alın ve iki mililitre oda sıcaklığında, delcos fosfat, tamponlu tuzlu su veya DPBS ile iki kez hızlı bir şekilde yıkayın.

Daha sonra numuneyi 20 dakika boyunca% 4 paraform aldehit,% 4 sükroz içinde sabitleyin. 20 dakikalık bir fiksasyondan sonra,% 4 paraform aldehit,% 4 sükrozu atık kabına çıkarın ve bulaşıkları iki mililitre oda sıcaklığında DPBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, kapak fişlerini oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Nöronlara nüfuz etmek ve hücre içi reseptör havuzunun anti GFP immüno-boyamasını ve/veya ilgilenilen diğer proteinlerin etiketlenmesini sağlamak için %0.2 Triton X 100 içeren bir immünofloresan blok çözeltisi. Daha sonra geçirgen blok çözeltisini çıkarın ve kapak fişlerini Triton X 100 olmadan immünofloresan blok çözeltisi içinde 20 ila 30 dakika inkübe edin. Kapak kaymalarının birincil antikor inkübasyonlarını, inkübasyonu takiben oda sıcaklığında birkaç saat veya gece boyunca dört santigrat derecede blok halinde gerçekleştirin.

Kapak fişlerini DPBS'de beş dakika bekleterek toplam üç yıkama için yıkayın. Daha sonra, kapak fişlerini bir saat sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca blok çözelti içinde ikincil antikorlarla inkübe edin. Kapak fişlerini daha önce olduğu gibi DPBS ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, kapak mendilinin arkasındaki fazla sıvıyı laboratuvar mendiliyle birlikte çıkararak ve ardından kapak fişini bir cam slayt üzerindeki dört mikrolitre montaj ortamına ters çevirerek her bir kapak fişini monte edin. 60 x yağ sayısal açıklığı kullanarak deneysel duruma kör olarak konfokal mikroskopi ile görüntü elde edin. 1.49 daldırma hedefi.

Aynı görüntü elde etme ayarlarını kullanarak, nöronal hücre gövdesi ile tek Z kesiti görüntüleri elde edin ve odakta birkaç dendritik süreç, alfa bungalov toksini, Alexa floresan sinyalini ve NFP immün boyamasını nöron başına 20 mikron boyunca üç ila dört proksimal dendrit boyunca ölçer tüm endositoz verilerinin analizi için aynı eşiği kullanarak. Her zaman noktası için 10 ila 12 nörondan gelen verileri analiz edin. Deneyin birkaç bağımsız nöronal kültürle tekrarlanması.

GABAerjik aksonlar, piramidal nöron dendritleri üzerine inhibitör temaslar yapar. Pre-sinaptik inhibitör terminaller, GABA ve glisini sinaptik veziküllere yükleyen veziküler inhibitör amino asit taşıyıcısı tarafından tanımlanır. GABA a reseptörleri, post-sinaptik inhibitör iskele tarafından bağlanan nörotransmitter salım bölgelerine yakından karşıdır: Burada gösterilen protein gein, Alexa 5 9 4 bungalov toksini ile etiketlenmiş yüzey gabaa reseptörleri ile alfa iki phg F-P-B-B-S eksprese eden nöronlardır ve ardından yeşil ile gösterilen anti GFP antikoru ile toplam reseptör popülasyonu için immün boyama ve post-sinaptik inhibitör iskele protein gein veya veziküler inhibitör amino asit taşıyıcısı.

Burada, GABA A reseptörü ve hipokampal nöronları içeren alfa iki'nin 15 günlük in vitro endositozu, alfa bungalov toksini gösterilmiştir. Floresan Panellerde gösterildiği gibi bireysel dendritik süreçlerin ölçümleri, GFP antikorları aracılığıyla yapı ekspresyonu seviyesine normalize edilir. Boyama zaman noktalarının son karşılaştırması, T eşittir sıfır ölçümüne normalleştirme ile yapılır.

Zaman içindeki floresan sinyal değişikliklerinden 60 dakikalık bir süre boyunca reseptörlerin içselleştirilmesinin nicelleştirilmesi en iyi tek bir üstel ile tanımlanmıştır. Alternatif bir yaklaşım, canlı görüntüleme hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile tek bir nöronda reseptör endositozunu takip etmektir. P-H-G-F-P etiketli GABA A reseptörü ve yüzey alfa bungalov toksini etiketli reseptörlerin noktasal ve örtüşen floresansı, deneyin başlangıcında, GABA A reseptör sinyali azaldıkça alfa bungalov toksini etiketli GABA A reseptör sinyali azaldıkça görülebilir.

Yeni reseptör takılması nedeniyle P-H-G-F-P sinyali yüksek kalırken, P-H-G-F-P sinyalindeki minimal azalma, hücre yüzeyi reseptör dağılım değişikliklerine ve bu işlemi takiben foto ağartmaya bağlıdır. Bungalov toksin yerleştirme testleri gibi diğer yöntemler, farklı tedavilerle reseptör yerleştirme oranları gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, hücresel aktivitenin, spesifik protein alanlarının, agonistlerin ve diğer modülatörlerin canlı nöronlarda, diğer hücrelerde ve dokularda reseptör döngüsünü nasıl değiştirebileceğini değerlendirmeye izin verir.

Bu videoyu izledikten sonra, hipokampal nöronlarda yüzey reseptörü lokalizasyonunu ölçmek için alfa bungalov toksini birleştirilmiş Alexa boyalarının standart immünofloresan tekniklerle birlikte nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.