GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, hipokampal nöronlarda gabaa reseptörünün yüzey lokalizasyonunu ve endositozunu ölçmektir. Bu işlem, öncelikle etiketli gabaa reseptör alt birimine sahip hipokampal nöronların transfekte edilmesi ve kültürlenen nöronların inkübatörde gelişmeye bırakılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, yüzey gabaa reseptörlerinin, floresan Alexa boyası ile eşleştirilmiş alfa bungalow toin ile işaretlenmesidir.

Ardından, işaretli reseptörlerin endositoza uğramasına izin vermek için nöronlar çeşitli zaman noktalarında inkübe edilir. Son adım, uygun zaman noktalarında örneklerin fikse edilmesi ve toplam işaretli reseptör havuzunu gözlemlemek için anti GFP kullanılarak immün boyama yapılmasıdır. Nihayetinde, fikse edilmiş veya canlı görüntüleme yaklaşımları kullanılarak işaretli gabaa reseptörlerinin yüzey lokalizasyonundaki ve endositozundaki değişiklikleri göstermek için konfokal mikroskopi kullanılır.

Bu yöntem, ligand bağlanmasının reseptör endositoz ve yerleşme hızları üzerinde ne gibi etkileri olduğu ve farklı ligandlar ile modülatörlerin reseptör geri dönüşümü ve degradasyonunu etkileyip etkilemediği gibi, reseptör trafiği alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu yöntem, temel olarak sinir sistemi bağlamında ligande bağlı iyon kanallarını ve G-proteini kenetli reseptörleri incelemek için kullanılmış olsa da, hücre kültürlerinde ve çeşitli dokuların primer hücrelerinde diğer membran proteinlerinin dinamik lokalizasyonunu ve trafiğini incelemek için de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler iki nedenden dolayı zorluk yaşayacaklardır.

İlk olarak, fonksiyonel konstrüktler oluşturmak ve ikinci olarak, birkaç farklı zaman noktasını eş zamanlı olarak işlemek için gerekli olan pratik ve deneyimleri edinmek gerekir. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi, her bir 3,5 cm doku kültürü kabı içerisinde dört ila beş adet yuvarlak poli-D-lisin kaplı cam lamel hazırlayın. Ardından, kültürleme gününde, yeni ayrıştırılmış nöronları plaka başına 1 ila 4 µg maxiprep konstrükt DNA ile transfekte edin.

Transfekte edilen nöronlar, 3,5 santimetrelik kap başına yaklaşık 200.000 nöronluk bir nihai yoğunlukta, poli-D-lisin kaplı lamel üzerine ekilir. Nöronal kültürlerin hazırlanmasından 4 ila 24 saat sonra besiyeri değiştirilir. Ardından, nöronların inkübatörde 14 ila 17 gün in vitro süre boyunca veya endositoz analizini gerçekleştirmek için istenen aşamaya gelene kadar gelişmesine izin verilir.

Öncelikle, masaüstü soğutma ve ısıtma cihazını 16 °C'ye ayarlayın. Ekstrasellüler yığınları, tamponlu salini veya HBS'yi bir su banyosunda 16 °C'ye kadar soğutun. Nöron kaplarını 16 °C'deki alüminyum plakaya aktarın ve beş dakika boyunca soğutun.

Besiyerini uzaklaştırın ve yerine iki dakika boyunca 16 °C'de 150 µM two Bo Rine içeren 1 ml HBS ekleyin. Ardından, besiyerini etiketlenmiş bir atık kabına aktarın ve yerine 16 °C'de 15 minutes boyunca inkübe edilecek şekilde, alpha bungalow toxin Alexa 594 ve two bo kerine içeren 1 ml 16 °C HBS ekleyin.

İnkübasyonun ardından, besiyerini etiketlenmiş bir atık kabına aktarın ve cam tabanlı 3,5 centimeter kültür kabı kullanarak reseptör endositozunu takiben gerçekleştirilecek canlı görüntüleme zaman serisi deneyleri için kapları üç kez 2 mL 16 °C HBS ile yıkayın. Kabı mikroskobun ısıtmalı tablasına yerleştirin ve konfokal veya turf mikroskop ile görüntülemeye başlayın. Sabitlenmiş lameller için kurulumu yapın.

T sıfır zaman noktasına ait lamel camlarını, diğer zaman noktaları için 20 dakika boyunca oda sıcaklığındaki %4 paraformaldehit ve %4 sükroz içeren bir kaba aktarın. HBS'yi, 37 °C'de dengelenmiş kondisyonlu besiyeri ile değiştirin ve gerekli zaman noktalarında 37 °C'de endositoz için inkübatöre geri koyun. Kapları inkübatörden çıkarın ve 2 mL oda sıcaklığındaki fosfat tamponlu salin (DPBS) ile hızlıca iki kez yıkayın.

Ardından örneği %4 paraformaldehit ve %4 sükroz içerisinde 20 dakika boyunca sabitleyin. 20 dakikalık sabitleme işleminin ardından, %4 paraformaldehit ve %4 sükroz çözeltisini atık konteynerine boşaltın ve kapları oda sıcaklığındaki 2 mL DPBS ile iki kez yıkayın. Sonrasında, lamelleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.

Nöronları permeabilize etmek ve hücre içi reseptör havuzunun anti-GFP immün boyamasını ve/veya ilgilenilen diğer proteinlerin işaretlenmesini sağlamak için %0.2 Triton X 100 içeren bir immünofloresan bloklama çözeltisi kullanın. Ardından, permeabilize edici bloklama çözeltisini uzaklaştırın ve lamelleri Triton X 100 içermeyen immünofloresan bloklama çözeltisi içinde 20 ila 30 dakika inkübe edin. Lamellerin primer antikor inkübasyonlarını, bloklama çözeltisi içerisinde oda sıcaklığında birkaç saat veya inkübasyonu takiben 4 °C'de gece boyunca gerçekleştirin.

Lamelleri, toplam üç yıkama olacak şekilde beşer dakika boyunca DPBS içinde bekleterek yıkayın. Ardından lamelleri, blok çözeltisi içindeki sekonder antikorlarla bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Lamelleri daha önce yaptığınız gibi üç kez DPBS ile yıkayın.

Ardından, her bir lamelin arkasındaki fazla sıvıyı laboratuvar mendili ile temizleyerek ve lameli, bir cam lam üzerindeki dört microliters montaj ortamının üzerine ters çevirerek yerleştirip montajı gerçekleştirin. Görüntüleme işlemini, deneysel koşullardan bağımsız olarak, 60 x yağ immersiyonu, sayısal açıklığı 1.49 olan objektif kullanarak konfokal mikroskopi ile yapın.

Aynı görüntüleme ayarlarını kullanarak, nöronal hücre gövdesi ve birkaç dendritik uzantının odak noktasında olduğu tekil Z kesit görüntüleri elde edin; tüm endositoz verilerinin analizi için aynı eşik değerini kullanarak, nöron başına üç ila dört proksimal dendritin 20 mikron boyunca alfa bungalow toksin, Alexa floresan sinyali ve GFP immün boyamasını nicelleştirin. Her zaman noktası için 10 ila 12 nöronun verilerini analiz edin. Deneyi birkaç bağımsız nöronal kültürle tekrarlayın.

GABAerjik aksonlar, piramidal nöron dendritleri üzerinde inhibitör temaslar kurar. Presinaptik inhibitör terminaller, GABA ve glisini sinaptik veziküllere yükleyen veziküler inhibitör amino asit taşıyıcısı ile tanımlanır. GABA$_A$ reseptörleri, burada gösterilen postsinaptik inhibitör iskele proteini gein tarafından sabitlenmiş nörotransmitter salınım bölgelerinin hemen karşısında yer alır; burada, yüzey GABA$_A$ reseptörleri Alexa 594 işaretli bungarotoksin ile etiketlenmiş ve ardından toplam reseptör popülasyonu anti-GFP antikoru ile yeşil renkte immün boyama ile gösterilen alfa iki phg F-P-B-B-S eksprese eden nöronlar ile birlikte postsinaptik inhibitör iskele proteini gein veya veziküler inhibitör amino asit taşıyıcısı gösterilmektedir.

Burada, in vitro 15. gündeki hipokampal nöronlarda, alfa 2 içeren GABA A reseptörünün alfa bungarotoksin ile endositozu gösterilmektedir. Panellerde gösterilen bireysel dendritik uzantıların floresan ölçümleri, GFP antikorları aracılığıyla konstrükt ekspresyon seviyesine göre normalize edilmiştir. Zaman noktalarının nihai karşılaştırması, T eşittir sıfır ölçümüne normalizasyon yoluyla yapılmıştır.

Zaman içindeki floresan sinyal değişimlerinden yararlanarak reseptörlerin 60 dakikalık bir süre boyunca internalizasyonunun miktarlaştırılması, en iyi tek bir eksponansiyel ile tanımlanmıştır. Alternatif bir yaklaşım ise, tek bir nörondaki reseptör endositozunu canlı görüntüleme zaman ayarlı konfokal mikroskopi ile takip etmektir. P-H-G-F-P etiketli GABA A reseptörlerinin ve yüzey alpha bungalow toksini ile işaretlenmiş reseptörlerin noktasal ve örtüşen floresansı deneyin başında görünürdür; zaman seyri boyunca, reseptörler endositoz oldukça alpha bungalow toksini ile işaretlenmiş GABA A reseptör sinyali azalır.

Yeni reseptör eklenmesi nedeniyle P-H-G-F-P sinyali yüksek kalırken, P-H-G-F-P sinyalindeki minimal azalma, bu prosedürün ardından gerçekleşen hücre yüzey reseptör dağılım değişikliklerinden ve fotobeyazlamadan kaynaklanmaktadır. Farklı uygulamalarla reseptör eklenme hızları gibi ek soruları yanıtlamak için bungalow toksin ekleme analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik; hücresel aktivitenin, spesifik protein domenlerinin, agonistlerin ve diğer modülatörlerin canlı nöronlarda, diğer hücrelerde ve dokularda reseptör döngüsünü nasıl değiştirebileceğinin değerlendirilmesine olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, hipokampal nöronlardaki yüzey reseptörü lokalizasyonunu nicelleştirmek için Alexa boyalarıyla eşleştirilmiş alfa bungarotoksinin standart immünofloresan tekniklerle birlikte nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.