Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Bu prosedür, atomik kuvvet mikroskobu ve floresan foto aktif lokalizasyon mikroskobu gibi süper çözünürlüklü mikroskopide kullanılmak üzere virüslü cam kapak fişleri hazırlar. İlk olarak, cam alt tabakayı temizleyin, camı poli L lizine aşılanmış ince bir kısmen biyotinillenmiş polietilen glikol filmi ile kaplayın. Daha sonra, Biyotinillenmiş filmin bağlanma afinitesini artırmak için yüzeye avadon uygulayın.

Şimdi yüzeyi, ilgilenilen virüse özgü biyotinile antikorlarla tedavi edin. Daha sonra antikor tarafından hazırlanan yüzeyi ilgilenilen virüs ile tedavi edin. Spin kaplamadan farklı olarak, bu teknik, varyantları yüzey boyunca homojen bir şekilde dağıtma avantajına sahiptir.

Mikroskobu optimize etmek için, kapak fişlerini uygun boyutta bir Teflon kapak kayma rafına dikey olarak yerleştirin ve 30 dakika boyunca filtrelenmiş etil alkol sonikat ile doldurulmuş bir behere daldırın. Ardından kapak kızaklarını ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın. Daha sonra, kapak fişlerini ayrı bir temiz Teflon rafa yerleştirin ve 30 dakika boyunca bir molar sodyum hidroksit sonikat ile doldurulmuş behere yerleştirin ve ultra saf su ile yoğun bir şekilde durulayın.

Şimdi durulanmış kapak fişlerini bir nitrojen akışı altında kurutun ve temiz, kuru bir Teflon rafa aktarın. Her bir kapak kaymasının görünür film veya parçacıklardan temiz olduğunu doğrulayın. Nitrojen akışında yatay olarak kuruduktan hemen sonra, PBS'de uygun miktarda biyotinile Polilisin aşılı polietilen glikol pipetinin ortasındaki steril bir Petri kabına bir kapak fişi yerleştirin

Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir temiz kapak fişi yerleştirin. İki kapak fişinin aktif yüzleri arasındaki hacmin tamamen sıvı ile doldurulduğundan emin olun. Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 45 ila 60 dakika inkübe edin.

Ardından, fazla sıvıyı sıkıştırmadan sandviçi bir cımbızla alın. Şimdi başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak sandviçi hafifçe ve yatay olarak sıkıştırın. Kapak fişlerini zıt yönlerde kaydırın ve aktif yüzlere dokunmadan ayırın.

Her iki aktif yüzü de 25 mililitre ultra saf su ile durulayın. Şimdi kapak fişlerini bir nitrojen akışı ile kurutun ve hangi kapak astar yüzeylerinin steril bir Petri kabına aktif olduğunu not edin. Aktif yüzün ortasına uygun miktarda çözülmüş kanıt solüsyonu pipeti ile işlem görmüş bir kapak fişi yerleştirin.

Sıvıyı sandviçlemek için aktif yüzü aşağı bakacak şekilde başka bir örtü parçası yerleştirin, ardından oda sıcaklığında 25 ila 30 dakika inkübe edin. Ardından, iki kapak fişini daha önce gösterildiği gibi ayırın. Aktif yüzlere dokunmadığınızdan emin olun.

Şimdi her iki aktif yüzü de 25 mililitre ultra saf suyla durulayın ve ardından kapak fişlerini nitrojen akışıyla kurutun. Hangi kapak kayma yüzlerinin aktif olduğunu hatırlamak önemlidir. İleride başvurmak için, hemen steril bir Petri kabına hevesli ve işlenmiş bir örtü aktif yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin, aktif yüzün ortasına uygun miktarda çözülme biyotinile antikor pipetleyin.

Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine aktif yüzü aşağı bakacak şekilde başka bir kapak fişi yerleştirin. Daha sonra oda sıcaklığında 45 ila 60 dakika inkübe edin İki kapak fişini ayırdıktan sonra, her iki aktif yüzü 25 mililitre PBS ile durulayın. Daha sonra antikorla tedavi edilmiş bir kapak fişini aktif yüzü yukarı bakacak şekilde steril bir Petri kabına yerleştirin ve aktif yüzün ortasına uygun miktarda virüs pipetleyin.

Şimdi ikinci bir aktif kapakla sandviç yapın, kaydırın, örtün ve inkübe edin. Şimdi iki kapak fişini ayırın. Her iki aktif yüzü de 25 mililitre PBS ile durulayın ve bunları PBS ile doldurulmuş bir Teflon rafa ve behere aktarın.

Hazırlanan numuneleri hemen kullanın veya üç güne kadar dört santigrat derecede saklayın. Burada. Veziküler stomatit virüsünün vahşi tip varyasyonu cam yüzeye ankrajlandı ve atomik kuvvet mikroskobu ile analiz edildi. Virionun genişliği ve uzunluğu 80 nanometreye 180 nanometredir ve virionun orijinal boyutundan minimum bozulma gösterir.

Bu deneyde, tek virion floresan foto aktivasyon lokalizasyon mikroskobu ile görüntülendi. Alexis 6 47 etiketli VSVG antikorları kullanılarak. Mavi izoyüzey, FOM mikroskobu kullanılarak virionun geri kazanılmış yüzeyini gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, atomik kuvvet mikroskobu veya süper çözünürlüklü mikroskopi ile kullanılmak üzere virüslü cam lamel kapakların nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Kapak kaymasının hangi yüzünün üzerinde aktif kimya olduğunu her zaman hatırlamak önemlidir.