Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama
January 2nd, 2014
Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.
Bu prosedür, atomik kuvvet mikroskobu ve floresan foto aktif lokalizasyon mikroskobu gibi süper çözünürlüklü mikroskopide kullanılmak üzere virüslü cam kapak fişleri hazırlar. İlk olarak, cam alt tabakayı temizleyin, camı poli L lizine aşılanmış ince bir kısmen biyotinillenmiş polietilen glikol filmi ile kaplayın. Daha sonra, Biyotinillenmiş filmin bağlanma afinitesini artırmak için yüzeye avadon uygulayın.
Şimdi yüzeyi, ilgilenilen virüse özgü biyotinile antikorlarla tedavi edin. Daha sonra antikor tarafından hazırlanan yüzeyi ilgilenilen virüs ile tedavi edin. Spin kaplamadan farklı olarak, bu teknik, varyantları yüzey boyunca homojen bir şekilde dağıtma avantajına sahiptir.
Mikroskobu optimize etmek için, kapak fişlerini uygun boyutta bir Teflon kapak kayma rafına dikey olarak yerleştirin ve 30 dakika boyunca filtrelenmiş etil alkol sonikat ile doldurulmuş bir behere daldırın. Ardından kapak kızaklarını ultra saf suyla yoğun bir şekilde durulayın. Daha sonra, kapak fişlerini ayrı bir temiz Teflon rafa yerleştirin ve 30 dakika boyunca bir molar sodyum hidroksit sonikat ile doldurulmuş behere yerleştirin ve ultra saf su ile yoğun bir şekilde durulayın.
Şimdi durulanmış kapak fişlerini bir nitrojen akışı altında kurutun ve temiz, kuru bir Teflon rafa aktarın. Her bir kapak kaymasının görünür film veya parçacıklardan temiz olduğunu doğrulayın. Nitrojen akışında yatay olarak kuruduktan hemen sonra, PBS'de uygun miktarda biyotinile Polilisin aşılı polietilen glikol pipetinin ortasındaki steril bir Petri kabına bir kapak fişi yerleştirin
.Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine başka bir temiz kapak fişi yerleştirin. İki kapak fişinin aktif yüzleri arasındaki hacmin tamamen sıvı ile doldurulduğundan emin olun. Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 45 ila 60 dakika inkübe edin.
Ardından, fazla sıvıyı sıkıştırmadan sandviçi bir cımbızla alın. Şimdi başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanarak sandviçi hafifçe ve yatay olarak sıkıştırın. Kapak fişlerini zıt yönlerde kaydırın ve aktif yüzlere dokunmadan ayırın.
Her iki aktif yüzü de 25 mililitre ultra saf su ile durulayın. Şimdi kapak fişlerini bir nitrojen akışı ile kurutun ve hangi kapak astar yüzeylerinin steril bir Petri kabına aktif olduğunu not edin. Aktif yüzün ortasına uygun miktarda çözülmüş kanıt solüsyonu pipeti ile işlem görmüş bir kapak fişi yerleştirin.
Sıvıyı sandviçlemek için aktif yüzü aşağı bakacak şekilde başka bir örtü parçası yerleştirin, ardından oda sıcaklığında 25 ila 30 dakika inkübe edin. Ardından, iki kapak fişini daha önce gösterildiği gibi ayırın. Aktif yüzlere dokunmadığınızdan emin olun.
Şimdi her iki aktif yüzü de 25 mililitre ultra saf suyla durulayın ve ardından kapak fişlerini nitrojen akışıyla kurutun. Hangi kapak kayma yüzlerinin aktif olduğunu hatırlamak önemlidir. İleride başvurmak için, hemen steril bir Petri kabına hevesli ve işlenmiş bir örtü aktif yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin, aktif yüzün ortasına uygun miktarda çözülme biyotinile antikor pipetleyin.
Bir sandviç yönteminde sıvının üzerine aktif yüzü aşağı bakacak şekilde başka bir kapak fişi yerleştirin. Daha sonra oda sıcaklığında 45 ila 60 dakika inkübe edin İki kapak fişini ayırdıktan sonra, her iki aktif yüzü 25 mililitre PBS ile durulayın. Daha sonra antikorla tedavi edilmiş bir kapak fişini aktif yüzü yukarı bakacak şekilde steril bir Petri kabına yerleştirin ve aktif yüzün ortasına uygun miktarda virüs pipetleyin.
Şimdi ikinci bir aktif kapakla sandviç yapın, kaydırın, örtün ve inkübe edin. Şimdi iki kapak fişini ayırın. Her iki aktif yüzü de 25 mililitre PBS ile durulayın ve bunları PBS ile doldurulmuş bir Teflon rafa ve behere aktarın.
Hazırlanan numuneleri hemen kullanın veya üç güne kadar dört santigrat derecede saklayın. Burada. Veziküler stomatit virüsünün vahşi tip varyasyonu cam yüzeye ankrajlandı ve atomik kuvvet mikroskobu ile analiz edildi. Virionun genişliği ve uzunluğu 80 nanometreye 180 nanometredir ve virionun orijinal boyutundan minimum bozulma gösterir.
Bu deneyde, tek virion floresan foto aktivasyon lokalizasyon mikroskobu ile görüntülendi. Alexis 6 47 etiketli VSVG antikorları kullanılarak. Mavi izoyüzey, FOM mikroskobu kullanılarak virionun geri kazanılmış yüzeyini gösterir.
Bu videoyu izledikten sonra, atomik kuvvet mikroskobu veya süper çözünürlüklü mikroskopi ile kullanılmak üzere virüslü cam lamel kapakların nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Kapak kaymasının hangi yüzünün üzerinde aktif kimya olduğunu her zaman hatırlamak önemlidir.
Genel Bakış
Bu makale, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve süper çözünürlüklü floresan görüntüleme için virüslü cam kapakçıkların hazırlanması yöntemini sunmaktadır. Teknik, viryonların kontrollü yapışmasını sağlayarak viral yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülemesini kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofizik
- Mikroskop Teknikleri
Arka Plan
- Viryon yapışması, AFM ve süper çözünürlüklü mikroskopi gibi görüntüleme teknikleri için gereklidir.
- Kontrollü yapışma, görüntüleme sonuçlarının kalitesini artırır.
- Önceki yöntemler, viryonların tek tip dağılımını sağlamayabilir.
- Bu çalışma yeni bir numune hazırlama yöntemi sunar.
Çalışmanın Amacı
- Cam yüzeylere viryon yapışması için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- AFM ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile görüntüleme kalitesini artırmak.
- Vesikuler stomatit virüsü kullanarak yöntemin etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Cam kapakçıkların biyotinlenmiş polietilen glikol ile temizlenmesi ve kaplanması.
- Yüzeylerin avidin ve virüse özgü biyotinlenmiş antikorlarla işlenmesi.
- Tek tip sıvı dağılımını kolaylaştırmak için kapakçıkların sandviç yapılması.
- Temizlik sağlamak için sonikasyon ve durulama tekniklerinin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Viryonlar görüntüleme için cam yüzeylere başarıyla sabitlendi.
- Tek viryonlar, floresan mikroskopi kullanarak minimum bozulma ile görüntülendi.
- Yöntem, viryonların yüzey üzerinde etkin dağılımını gösterdi.
- Sonuçlar, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için hazırlama yönteminin uygunluğunu doğruladı.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, viryon yapışması için güvenilir bir yaklaşım sunar.
- Bu teknik, mikroskopi uygulamalarında görüntüleme kalitesini artırır.
- Gelecek çalışmaları bu yönteme dayanarak çeşitli viral görüntüleme uygulamaları için geliştirilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
