Selüloz Fabrikası Atık Akışlarında Mikrobiyal Büyümeyi Kolaylaştırma Yöntemleri ve Kültürlenmiş Mikropların Biyolojik Bozunma Potansiyelinin Karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir mikroorganizmanın veya mikroorganizma konsorsiyumunun, hamurlaştırma atığı Büyüme için Siyah Likörü, büyüme için kullanılan siyah likörün bileşenlerini ve bu hamurlaştırma atığının mikrobiyal metabolizması ile üretilen ürünleri kullanma yeteneğini belirlemektir. Bu, hamurlaştırma atığı Siyah likörün toplanması ve bir kültür ortamı bileşeni olarak kullanılmak üzere hazırlanmasıyla elde edilir. İkinci adım olarak, mikroorganizmaların karbon kaynağı gereksinimlerini belirlemek için kullanılan lignoselüloz bileşenleri ekstrakte edilir.

Sonraki ortamlar, mikroorganizmaların siyah likör ve bileşenleri üzerinde üreme kabiliyetini belirlemek için mikrobiyal büyüme için hazırlanır, aşılanır ve analiz edilir. Sonuçlar, minimal ortam agar plakalarında ve GCMS tarafından görselleştirilen büyümesine dayalı olarak mikrobiyal çevresel izolat tarafından metabolik ürünlerin büyümesi ve sentezi için tek karbon kaynağı olarak siyah likörün kullanıldığını göstermektedir. Bu yöntem için ilk olarak, mikropların kağıt hamuru atık ürünlerinde büyüyebilme olasılığını tartışırken ve bu mikropları doğrudan bir kağıt hamuru fabrikasından izole edebileceğimizi tartışırken aklımıza geldi.

Zignal cellose ekstraksiyon tekniğinin, sodyum hidroksit ağartma gibi günümüzdeki mevcut yönteme göre ana avantajı, sodyum klorür ağartmanın yüksek ve artan saflık sunmasıdır. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Theo selüloz ve GCMS numune hazırlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve bunun nedeni gereken adımların sayısı ve prosesin tamamlandığını doğrulamak için gereken görsel belirlemedir.

Bu yöntem sadece siyah likörün mikrobiyal bozunması hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda mahsul kalıntıları, orman kalıntıları ve belediye katı atıkları gibi Magno selüloz malzemeleri içeren endüstriyel atık akışlarına da uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, siyah likör örneğini zanaat çürütücüsüne bağlı çıkış valfinden ve steril bir cam şişeden toplayın ve bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Daha sonra, bir karıştırma çubuğu ile donatılmış 500 mililitrelik bir behere 100 mililitre siyah likör numunesi ekleyin ve numuneyi orta hızda karıştırın.

Siyah likörü viskoz hale gelene kadar damla damla fosforik asit ekleyerek nötralize edin. Bunu takiben, tüm siyah likör çözeltisini 50 mililitrelik konik tüplere koyun ve numuneleri 30 dakika boyunca 9.300 G'de santrifüjleyin. Karbonhidratları ayırmak için, 500 mililitrelik bir şişeye beş gram bir milimetre veya daha küçük öğütülmüş sustalı çim ve bir karıştırma çubuğu yerleştirin.

Daha sonra 200 mililitre damıtılmış su, 7.5 gram sodyum klorit ve 2.5 mililitre buzlu asetik asit ekleyin. Şişeyi, bir saat boyunca 80 santigrat derecede bir karıştırma plakasının üzerine yerleştirilmiş bir yağ banyosuna yerleştirin. Daha sonra şişeye 7,5 gram sodyum klorür ve 2,5 mililitre buzlu asetik asit ekleyin.

Önceki adımı iki kez tekrarladıktan sonra 80 derecede 30 dakika karıştırmaya devam edin. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Daha sonra katı malzemeyi izole etmek için vakum altında bir buchner hunisinden süzün.

Katı malzemeyi 100 mililitre damıtılmış su ile üç kez yıkayın. Ardından, katı malzemeden bir gram toplayın ve temiz bir filtre kağıdına yerleştirin. Katıyı gece boyunca kuruması için 50 santigrat dereceye koyun.

Numuneyi ertesi gün fırından çıkardıktan sonra, içi boş hücre etiketli bir saklama şişesine aktarın. Kalan katı malzemeyi 250 mililitre% 10 sodyum hidroksit içeren 500 mililitrelik bir şişeye ekleyin ve şişeyi tıpa ile kapatın. Çözeltiyi 250 RPM'de çalkalanarak bir saat boyunca 70 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.

Bunu takiben, çözeltinin oda sıcaklığına soğumasına izin verin 30 dakika sonra, katı malzemeyi bir buchner hunisi kullanarak vakum filtrasyonu yoluyla izole edin. Katı kalıntı gece boyunca 50 santigrat derecelik bir fırında kurutulduktan sonra, selüloz etiketli bir saklama kabına koyun. Süzüntüyü 500 mililitrelik bir şişeye aktarın ve 30 mililitre asetik asit ve 250 mililitre izopropil alkol kapağı ekleyin ve elde edilen çözeltiyi oda sıcaklığında en az sekiz saat tezgah üzerine yerleştirin.

Bittiğinde, çözeltinin tamamını 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve numuneyi 30 dakika boyunca 9.300 Gs'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, çözeltiyi konik tüplerden dikkatlice pipetleyin ve atın. Daha sonra, peletleri 30 mililitre damıtılmış su ile vorteksleme ve 30 dakika boyunca 9.300 G'de santrifüjleme ile yıkayın.

Peleti iyice yıkamak için bu adımı 15 kez tekrarlayın. Santrifüjlemeden sonra, dondurarak kurutma için peleti izole etmek için süpernatanı çıkarın. Numune dondurularak kurutulduktan sonra, hemi selüloz etiketli bir şişeye koyun.

Lignin ayrımı için, 500 mililitrelik nokta 25 molar sodyum hidroksit ve %30 etanol çözeltisine beş gram bir milimetre veya daha küçük öğütülmüş şalt çimi ekleyin. Bulamacı iki saat boyunca 250 RPM'de çalkalayarak 75 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Soğuk çözeltiyi süzdükten sonra, şişeye bir karıştırma çubuğu ekleyin ve orta hıza ayarlanmış bir karıştırma plakasının üzerine yerleştirin.

İki pH elde edilene kadar süzüntüye damla damla konsantre hidroklorik asit ekleyin. Çözeltinin gece boyunca oda sıcaklığında oturmasına izin verin. Çözelti 50 mililitrelik konik tüplere aktarıldıktan sonra, numuneleri 30 dakika boyunca 9.300 GS'de santrifüjleyin.

Bittiğinde, çözeltiyi konik tüpten dikkatlice pipetleyin ve atın. Peletleri 30 mililitre damıtılmış su ile girdaplama ve 9.300 G'de 30 dakika santrifüjleme ile yıkayın. Peleti iyice yıkamak için bu adımı 15 kez tekrarlayın.

Santrifüjlemeden sonra, dondurarak kurutma için peleti izole etmek için sırtüstü sıvıyı çıkarın. Dondurularak kurutulduktan sonra, numuneyi lignin etiketli bir şişeye yerleştirin. Steril 125 mililitrelik bir şişeye 50 mililitre steril M nine minimal ortam ekleyin.

Ardından, siyah likörün hacminin% 10'unu ortama ekleyin. Aşılama için, karışıma bir gece boyunca bakteri kültürünün hacimce% 0.1'ini ekleyin, kültürleri 37 santigrat derecede bir inkübatörde 200 RPM'de çalkalayarak inkübe edin. Orta log fazında, BM ile aşılanmış ve aşılanmış bakteri kültürlerinin santrifüjlenmesini takiben bakterileri bir şırınga kullanarak kapalı bir steril anaerobik serum şişesine aktarın.

450 saatlik büyümeden sonra, her bir süpernatanttan 10 mililitre ayrı cam Test tüplerine ekleyin. Her bir süpernatanı, pH'a bir ila iki damla damla eklenen konsantre hidroklorik asit ile asitleştirin. Her numune için, supra natanta 30 mililitre etil asetat ekleyin.

Test tüpünü kapattıktan sonra, tüpü dört ila altı kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırın. Ardından temiz bir cam test tüpüne bir ila iki gram susuz sodyum sülfat yerleştirin. Tek kullanımlık cam mera pipeti ile pipetleyerek üst organik tabakayı dikkatlice toplayın.

Organik tabakayı susuz sodyum sülfat içeren test tüpüne yerleştirin. Yavaş yavaş karıştırmak için test tüpüne hafifçe vurarak organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerinde susuzlaştırın. Az miktarda susuz sodyum sülfat ekleyin ve büyük topaklar kalmayana kadar karıştırın.

Bunu takiben, çözeltiyi vakum altında bir buchner hunisinden süzün, ardından çözeltiyi bir buharlaşma şişesine aktarın ve süzüntüyü bir döner buharlaştırıcı kullanarak buharlaştırın. Bittiğinde, üç miligram etil asetat ekstraksiyon kalıntısını iki mililitrelik kehribar kromatografi şişesine yerleştirin. Kalıntıyı 100 mikrolitre bir, dört dioksan ve 10 mikrolitre piridin ile çözün.

Daha sonra şişeye% 1 trimetil klor içeren 50 mikrolitre B-S-T-F-A çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi 15 dakika çalkalayarak 60 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Örneği GCMS ile analiz edin.

Zanaat hamurlaştırma işleminde üretilen siyah likörün toplanması ve modifikasyonu, bu hamurlaştırma atığını tek bir bakteri izolatının veya karışık kültürün biyolojik bozunma kapasitesini belirlemek için kullanacaktır. Burada gösterilen, LB ortamında kültürlenen bir çevresel suşun ve %10 nötralize edilmiş siyah likör ile desteklenmiş LB ortamının optik yoğunluğu ile ölçülen aerobik büyümedir. Bu sonuçlar, bu bakterinin siyah likör varlığında büyüdüğünü göstermektedir.

LB ortamındaki çevresel izolatın büyümesi, siyah likör varlığında büyütüldüğünden daha hızlıdır, ancak optik yoğunluk 62 saat sonra azalmaya başlar. Siyah likör varlığında mikrobiyal çevresel izolatın büyümesi, 230 saatlik büyümeden sonraya kadar optik yoğunlukta artmaya devam eder. Siyah likör varlığında mikrobiyal çevresel izolatın büyüme eğrisi aynı zamanda bifazik büyümeyi de gösterir, bu da siyah likörün mikrobiyal çevresel izolat tarafından kullanılabilecek birden fazla karbon kaynağı içerdiğini ve bakteri tarafından sergilenen besin kullanımı tercihi olduğunu gösterir.

Büyüme gereksinimleri için siyah likör kullanma yeteneğini belirlemek için daha fazla deney gereklidir. Ayrıca, bir bakterinin nötralize edilmemiş siyah likör üzerindeki büyümesi belirlenebilir veya artan siyah likör konsantrasyonlarının büyüme üzerindeki etkisi belirlenebilir. Siyah likörde büyüme gösterildikten sonra, minimum ortam büyüme deneyleri kullanılarak karbon kaynağı kullanımı belirlenebilir.

Lignoselülozun bileşenlerini oluşturan ticari substratlar, minimal ortamda karbon kaynakları olarak kullanılabilir. Burada sunulan LIGNOSELÜLOZ ekstraksiyon protokolü, resimde gösterilen bakterinin büyüme gereksinimlerini belirlemek için bir model sağlar: Burada, M dokuzunda çevresel mikrobiyal izolatın büyümesi görülmektedir. Lignoselüloz ekstraksiyonunun her bir bileşeni ile desteklenmiş minimal ortam agarı.

Minimal ortam agar plakaları üzerindeki kolonilerin varlığı, çevresel izolatın M dokuzunda bulunan holo selüloz, selüloz, hemi selüloz ve lignin kolonilerini parçalama yeteneğini gösterir. Minimal besiyeri, çevresel izolatın plakalar yerine agarı parçalama yeteneğini önerebilir. Sıvı kültürler için minimal ortam büyüme eğrileri, her bir lignoselüloz fraksiyonu üzerindeki spesifik büyüme oranını belirlemek için de kullanılabilir, böylece potansiyel bir karbon kaynağı olabilecek agarın eklenmesine gerek kalmaz.

Ekstrakte edilmiş ve türetilmiş gözlerin, bakteri kültürlerinin GCMS ile analizi, üretilen metabolik ürünleri ortaya koymaktadır. Burada, aşılanmamış numunede bulunan TMS türevlerinin GCMS spektrumu, anaerobik olarak büyütüldüğünde çevresel mikrobiyal izolat tarafından üretilen TMS türevlerinin spektrumu ve %10 nötralize edilmemiş siyah likör içeren M dokuz, minimal ortam burada gösterilmektedir. İki spektrumun karşılaştırılması, ortamda bulunan bileşenlerdeki farklılıkları ortaya çıkarır, bu da fermantasyon ürünlerinin varlığını ve siyah likör bileşenlerinin bozunmasını önerir.

Aşılanmış örnekte 39.34 dakikalık bir alıkonma süresine sahip bir tepe ortaya çıktı. Aşılanmış numunede 21 nokta 84 dakikalık bir alıkonma süresine sahip bir tepe noktası artmıştır. Aşılanmış numunede alıkonma süresi 25.79 olan bir tepe noktası azalmıştır.

Burada gösterilen spektrum, 25.79 dakikalık bir tutma süresi ile zirveyi tanımlamak için kullanılan guac standardının spektrumudur. Bu videoyu izledikten sonra, bir mikroorganizmanın veya bir mikroorganizma konsorsiyumunun siyah likörü bozup bozamayacağını nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, bu protokolü izleyerek, bir mikroorganizmanın veya mikroorganizmaların çeşitli konsantrasyonlarda siyah likör veya ligon selüloz özü bileşenleri üzerindeki büyüme hızı hakkında ek soruları yanıtlamak için büyüme eğrileri gibi diğer yöntemleri kullanabilirsiniz.