Name: Histokimyasal boyama Arabidopsis thaliana Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Öğrenin Arabidopsis thaliana köklerinde ikincil hücre duvarı elemanlarını görselleştirmek için histokimyasal boyama yöntemlerini. Bu teknik bitki biyolojisi araştırmalarında hücre duvarı bileşimini incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz düzenleme yardım için Sabin Russell müteşekkiriz. Bu çalışma (http://www.jbei.org) ABD Enerji Bölümü, Bilim, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi, Ofisi tarafından desteklenen DOE Ortak Biyoenerji Enstitüsü parçası oldu Lawrence Berkeley arasındaki sözleşme DE-AC02-05CH11231 yoluyla Ulusal Laboratuvarı ve ABD Enerji Bakanlığı.

1.. Gömmeyi Kök <ol><li> Su içinde bir% 7 agaroz çözeltisi (distile su, 100 ml dereceli agaroz elektroforezi 7 g) elde edin. 20 dakika için otoklav ile ya da düşük yoğunlukta (1250 watt bir mikrodalga, örneğin,% 10 yoğunluk) 20 dakika boyunca mikrodalga ile agaroz eritilir. </li><li> Plastik şişeleri kullanarak kaynaklanıyor gömmek için bir ev yapımı kalıp hazırlayın. <ol><li> Bir jilet kullanarak, bir 2 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüp (Bölüm A) konik alt kesti. , Bir şırınga iğnesi ile, gömülü olarak kök çapından biraz daha büyük boru kap içinde bir delik delinerek. Sonraki, bir 0.6 ml mikrosantrifüj tüp (Bölüm B) alt kısmına 0,5 cm kesti. </li><li> Önceden kesilmiş 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine 0.6 ml mikrosantrifüj tüpü cut-off 0.5 cm kısmını ekleyin. Parafilm (Şekil 1) kullanılarak, iki parça kapatın. NOT: Tüpün alt Agaroz katılaşmış sonra gömülü numunenin çıkarılmasını kolaylaştırmak için kesilir. To kap içinde bir delik kök agaroz gömüldüğünde kök sabit tutulmasına yardımcı olur. Kalıp agaroz tutun ve gömerken kök düz tutmak için hizmet edecektir. Agaroz ayarlanır ve kök gömülü kadar Parafilm, iki parça, A ve B yapacak. </li><li> Bir jilet kullanarak, ilgi alanı, (ilk kök boğum örneğin orta) bir kök bölümü kesti. NOT: İdeal olarak, kök sadece dehidratasyon yıkımı önlemek için gömmeden önce kesilmelidir. Seçenek olarak ise, sap geçici olarak su ile ıslatılmış filtre kağıdı içeren bir plaka saklanabilir. Bu plaka, doku su kaybını ve deformasyonunu önlemek için gömülü olması için hazır olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir. Yüksek nem olmadan 30 dakika daha uzun süreler için kök saklama kök kurumasına neden olur. </li></ol></li><li> Düşük yoğunlukta mikrodalgada agaroz eritin. DİKKAT: agaroz içeren şişe sıcak olabilir. Şişe almak için de eldiven kullanın. Erimiş agaroz diyelim(20 ° C ve 25 ° C arasında), oda sıcaklığında tand yaklaşık 50 ° C&#39;ye soğuyana kadar </li><li> Yavaş yavaş şişeyi doldurmak için önceden hazırlanmış plastik kalıp içine agaroz 5 ml pipetle. NOT: Emin kalıplar içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları agaroz kalıp boşlukları neden olur ve tamamen sonunda numune bölümlerinin düzensiz kesme yol açacaktır kök örneği, kapsamaz. <ol><li> Agaroz yarı katı olmak için 30 ila 60 saniye boyunca soğumaya bırakın. Nüfuz ve agaroz, yüzer ayağa olamaz, ama emin, küçük bir kürdan ile test edin. NOT: agaroz o hücre morfolojisi yok, kök aksatmanın tarafından örnek zarar verecektir hala sıcak olduğu zaman kök yerleştirilir ise. </li><li> Bu agaroz dolu şişe içinde kök yerleştirin. Gövdesi düz kalır emin olun. Kök ucu, kapak tarafından düzenlenen bir şekilde delikli kapağı yerleştirin. Vidalı kapağı açmayın. Bazen (tek bir tür) bir kök daha embe olabilirTek bir şişede dded; ama bu özel durumda, kap kullanmayın. NOT: vidalı kapak açıksa, kök bükümlü alacak. </li></ol></li><li> Sertleşene kadar, 10-30 dakika süre ile, oda sıcaklığında ya da 4 ° C &#39;de şişeyi bırakın. </li><li> Yavaşça tüpün dışına kaydırarak kalıp çıkarın. Parafilm açın. Bir cam mikroskop lamı üzerine Kısım A katılaşmış agaroz serbest bırakmak için parmak ile hafifçe kalıbın Kısım B alt itin. </li><li> 1.2 cm uzunluğunda üç eşit parçaya agaroz gömülü kök kesilir. Agaroz değildi ve atın kök kısmını kesip. <ol><li> Gömülü olan agaroz bu parçaları Mağaza hava geçirmez bölüme hazır olana kadar 4 ° C&#39;de bir siyah kutu içinde 2 ml mikrosantrifüj tüpleri kaynaklanıyor. Seçenek olarak ise, bir haftalık bir süre için 4 ° C&#39;de tüpler saklayın. NOT: Depolama mümkündür, ama deneyci gömülü kaynaklanıyor hala hayatta ve deney olarak farkında olması gerekir, Eserler potansiyel tanıtıldı olabilir. </li></ol></li></ol> 2.. Kesit alma Kök <ol><li> DİKKAT: dikkatle vibratome kılavuzunu okuyun ve tüm emniyet talimatlarını izleyin. </li><li> Numune disk (herhangi bir katı veya sıvı ücretsiz) temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun. Önceki deneylerden herhangi bir kalıntı tutkal ve suyla yıkamak için bir traş makinesi bıçak ile numune diski temizleyin. Sonra bir kağıt havlu ile kurulayın. Not: Bu yapıştırıcı iyi çalışır ve agaroz numune bağlanan sağlayacaktır. Bu adımı düzgün yapılmazsa ise, numune diske uygun olmayabilir ve daha sonra numune kesit sırasında diske devrilmesine neden olasıdır. <ol><li> Kullanın yumuşak kağıt örnekler içeren agaroz blok herhangi bir nemi çıkarmak için mendil. </li><li> Örnek disk üzerinde doku yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Çizgi yapışkan şişenin ucu kullanılarak plakanın ortasına bir alanı kapsayacak şekilde, yapışkan var. Çabuk yerAgaroz blok numuneler dik ya da sırasıyla, çapraz veya uzunlamasına kesitlerde, için plaka paralel olarak ya da olduğu kadar. Yapışkan 10-30 dakika için oda sıcaklığında ya da 4 ° C&#39;de numune diske örnek düzeltmek için izin verin. NOT: Bu bir zaman duyarlı bir adımdır. </li></ol></li><li> Tampon tepsiye veya çukur üzerinde yerinde numune diski düzeltmek. Bölümleri ile agaroz blok / s jilet paralel olmalıdır. Örnekler tamamen gömülü olduğu kadar oda sıcaklığında damıtılmış su ile tampon tepsi doldurun. </li><li> Yarısında jilet kesmek ve daha sonra bıçak tamamen düz kalır, böylece sağlam bir makasla uçlarını kesin. Bıçak tutucu üzerine önceden kesilmiş jilet yansım takın. <ol><li> 84 ° bıçak tutucuya açısını ayarlamak, 50 Hz (Vibratome pozisyon 5) 0.90 / sn mm (Vibratome pozisyon 8) ve frekans hızı. 100 um kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. Sürekli modunu kullanın. HAYIRTE: Bu kalınlık, doku boyama protokollerini kullanılan çeşitli asit ve baz tedavi dayanabilir emin olmak için seçildi. Kesit için pencere ayarlayın ve bölüm yaklaşık 1.2 cm&#39;lik bir agaroz blok için Vibratome için sürekli bir modda 15-20 dk bekleyin. </li></ol></li><li> Tampon tepsisine kesit boyunca bir tek kullanımlık plastik pipet kullanarak bölümleri toplayın. Alternatif olarak, kısımlar, bir cam kabın içine tampon tepsiden aktarılır ve daha sonra berrak bir Petri levhaya edilebilir. 2.0 ml mikrosantrifüj tüplerine birkaç bölümleri aktarın. Not: numuneler saydam bir zemin üzerine bölümlerine bakınız daha kolay olduğu için, bir Petri plakasından toplanan ve tampon, tepsi bir sonraki numune için hazır olarak kabul edilebilir. </li><li> Kesitler, 30-60 dakika boyunca 4 ° C de, 50 ml bir tüp içinde saklanan ya da toplandı ve 1,5-2 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde saklanabilir. NOT: Daha uzun süreler için bölümleri saklanması kötü görüntü kalitesine yol açacaktır. </li&gt; </ol> Görüntüleme için 3. Mikroskop ve Kamera Ayarı <ol><li> Mikroskop Koehler aydınlatma ayarlayın. Bir hedef seçin. İlk numune odaklanın. Bir buçuk veya daha düşük bir ışık yoğunluğunu getirin. Alanında diyafram (FD) ve diyafram (AP) kapatın veya belirli bir hedef üzerinde mümkün olan en düşük ayara getirin. <ol><li> Büyütme kadar yüksek olursa, o kadar büyük halkası olacaktır. Gibi keskin mümkün olduğunca alan iris odaklanmak için kondansatör odaklanarak düğmeyi kullanın. </li><li> Yavaşça kondansatör-merkezleme topuzlarını (Kondansörü çevreleyen iğne şeklindeki vida) kullanılarak merkeze alan iris (altıgen şekilli, küçük halka) resim getirecektir. Yavaşça alan iris kenarına ulaşır diyafram (FD) bu tür artış. Alan iris kenarını geçtikten hemen sonra FD artan durdurun. </li><li> Yavaşça kontrastını ayarlamak için açıklığı (AP) artar. Gerektiği gibi ışık yoğunluğunu ayarlayın. NOT: Koehler aydınlatma her o için ayarlanması gerekiyorbjective, her deney gün. Gün için düzeltme yapıldıktan sonra elde edilen numaralarını not edin. Bu rakamlar hedefler o gün için ileri ve geri açıldığında her defasında yeniden edilecektir. </li></ol></li><li> Diyafram, şiddeti, maruz kalma süresi, kazanç, ve Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi filtreleri ayarlayın. Bu bilgiler sadece bir rehber olarak kullanılmalıdır. </li><li> Floresan görüntü yakalamak için hiçbir mekanik obtüratör ile bir geniş format CCD çipi ile yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf makinesi kullanın; ve aydınlık alan görüntüler için yüksek çözünürlüklü, yüksek hızlı kamera. </li><li> Standart yazılımı kullanarak slaytlar işleyin. Yazılımı yükleyin. &quot;Al&#39;ı&quot; ve tıklayın &quot;Set kamera / ütü masası,&quot; daha sonra kullanılacak kamera seçin. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Ardından &quot;Al&quot; Click &quot;Renk sekmesinde.&quot; Altında &quot;Renk sekmesinde,&quot; seçim &quot;Bayer metodu&quot; ve ardından &quot;ortalama dört.&quot; Önerdi kazancı (kırmızı, yeşil, mavi) sağa sola eklem Tablo 1. &quot;Set kaydetmek&quot; sekmesini seçin ve görüntülerin saklanacağı dizinde tıklayın. Tablo 1&#39;de önerileri &quot;Pozlama süresi&quot; olarak ayarlayın. &quot;1&quot; &quot;binning&quot; olarak ayarlayın ve &quot;Canlı binning&quot; ilgi bölgeye &quot;1&quot;., Odak ve sonra tıklayın &quot;canlı kaydedin.&quot; </li><li> Kamera yazılımı çıkış görüntüleri &quot;TIF&quot; formatında bulunmaktadır. Hücre tipleri için histokimyasal görüntüleri analiz edin. Sunum ve yayın aşağı kullanımlar için standart bilgisayar yazılımı kullanın. </li></ol> 4.. Ultraviyole ve Parlak alan Görüntüleme <ol><li> Bölümler kolayca pipetle böylece pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça pipet bölümler ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine. Bir kapak kayma bölümleri kapsayacak. UV ışığı veya parlak ışık altında alan bölümleri gözlemlemek. </li></ol> 5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Boyama 12 <ol><li> % 3 phloroglucinol çözeltisi hazırlamak için, 10 ml mutlak etanol içinde 0.3 g floroglukinol çözülür. Etanol% 3 floroglukinol iki hacim için konsantre HCI (37 N), bir hacim karıştırın; Bu çözeltiye, phloroglucinol-HCl (Ph-HCI) veya Wiesner leke. NOT: Bu çözüm çözüm zamanla düşer ve boyama etkisiz hale gelecektir çünkü, boyamanın gününde taze yapılacak ve saklanabilir olamaz. DİKKAT: HCl oldukça yıpratıcıdır, Ph-HCl leke tutarken çok dikkatli kullanın. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe Ph-HCl çözeltisi 1 ml ilave edilir ve Ph-HCl leke olarak HCl oldukça aşındırıcı, çünkü hemen kap. Yavaşça tüm bölümleri boyanır sağlamak için tüp hareket ettirin. Bu aşama için bir alternatif, Ph-HCl çözeltisi yukarı ve aşağı pipetle böylece tercihen saniye bozmadan, açık boru kap tutmaktırTIONS. NOT: Bu, bu bölümleri zarar verebileceğinden, pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. <ol><li> Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Kapak kayma bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. NOT: Ph-HCl çözüm örneklerinin bir bozulmaya neden, 5-10 dakika içinde kurur. Bu nedenle, görüntüleme bu süre içinde tamamlanması gerekmektedir. </li></ol></li></ol> 6.. Maule Boyama 13,14 <ol><li> % 0.5 &#39;lik bir potasyum permanganat solüsyonu hazırlamak için, 40 ml damıtılmış su içerisinde potasyum permanganat, 0.2 g çözülür. 7 günlük bir süre boyunca oda sıcaklığında karanlık şişe içinde depolayın. <ol><li> 9 ml saf su (1:10) ile, 1 ml konsantre HCI (37 N) ilavesiyle, bir% 3.7 HCI solüsyonu hazırlayın. Taze bir% 3.7 HCl çözeltisi hazırlayınDeney günü. Kullanılan 37 N HCI stok çözümü çok eski olmadığından emin olun. Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi (14.8 M) azalan gelen doymuş çözeltisi molaritesini önlemek için 4 ° C&#39;de depolanmalıdır. </li></ol></li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 1 ml ilave edilir. <ol><li> Tercihen bölümleri bozmadan, yavaşça yukarı ve aşağı% 0.5 potasyum permanganat çözüm pipetle. 2 dakika boyunca inkübe edin ve pipetleme tekrarlayın. Tüm bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp bekletin. NOT: bölümleri zarar verebilir gibi pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bu çözüm karanlık olduğu gibi kök bölümlere bakın, bu yüzden tüp rafa bölümleri ile tüp tutmak ve onları 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir. </li><li> 1 ml pipet kullanarak,% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 700 ul çekmek.Potasyum permanganat solüsyonu çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Su çözeltisi berrak kalana kadar 3-4x tekrarlayın ya. </li><li> Su atın. Derin bir kahverengi renk bölümlerde taburcu kadar hızlı% 3 HCl 1 ml ekleyin. Bu, 3-5 dakika içinde ortaya çıkabilir veya 5 dakika her 2 yıkar gerektirebilir. Tüm% 3 HCl çözümü Pipet ve hemen bir sonraki adıma geçin. </li><li> Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi 1 ml ilave edilir. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde uç kesim ile 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Bir lamel ile bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. DİKKAT: amonyum hidroksit derece aşındırıcı olduğundan, mikroskop veya mercek aşamasına korozyona neden önlemek için ekstra bakım ve dikkat gerektirir. NOT: amonyum hidroksit dumanlar zor örneği gözlemlemek için yapım, lamel sis olabilir. Bu nedenle lamel eklemeden önce ekstra dikkatli olun. Çözelti 5-10 dakika içinde kurur, bu yüzden görüntüleme o süre içinde tamamlanması gerekmektedir. </li></ol></li></ol> 7. Kongo Kırmızı Boyama 11,15 <ol><li> % 0.5 &#39;lik Kongo kırmızı bir çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 100 ml kırmızı Kongo 0.5 g çözülür. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0.5 Kongo kırmızısı çözeltisi 1 ml ilave edilir. Yavaşça% 0.5 kongo kırmızı çözümü pipet ve aşağı bölümleri bozmadan. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. <ol><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında kuluçkalama bir diğer 3 dakika ile izleyin. </li><li> % 0.5 kongo kırmızı solüsyon 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Kongo kırmızı bir çözelti çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Yıkama çözeltisi kadar yıkama 3-4x Tekraraçıktır. </li><li> Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde kendi ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet, ve kapak örtün. 560/40 bir bant geçiren bir filtre kullanılarak mavi ışık uyarma altında mikroskop lamı üzerine örnekleri gözlemlemek. NOT: Su 10-30 dakika içinde kongo kırmızı yıkayın gibi, önce mikroskopik analiz için uzun süre suda bölümleri tutmayın. </li></ol></li></ol> 8. Kalkofluor Beyazı Boyama 9 <ol><li> % 0,2 &#39;lik bir stok çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 10 ml (beyaz Kalkofluor M2R&#39;den) fluoresan parlatıcı 28 0.02 g çözülür. % 0.2 &#39;lik çözelti, 4 ° C de karanlık bir şişe içinde, altı ay boyunca saklanabilir Damıtılmış su ile% 0.2 &#39;lik stok çözeltisi 10x seyreltilerek% 0.02&#39; lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. % 0.02 calcof en boru 1 ml ekleluor beyaz çözelti. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% calcofluor beyaz çözüm pipetle. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. <ol><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında bir diğer 3 dakika için bölümü inkübe edin. NOT: bölümleri daha kolay bölümlere zarar vermeden çözüm pipetle yapmak için tüpün dibine çökmesine izin verilmektedir. </li><li> % 0.02 calcofluor beyaz solüsyon 700 ul çekmek ve distile su 700 ul eklemek için 1 ml pipet kullanın; 5 dk calcofluor beyaz çözümü çalkalamak için bekleyin. Yıkandıkları 3-4x tekrarlayın. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle olabilir Bu şekilde olarak pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. </li><li> Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. UV ışık altında bölümleri gözlemlemek. </li></ol></li></ol> 9. Toluidine Blue O Boyama 16,17 <ol><li> A% 0.02 çözeltisi hazırlamak için 100 ml damıtılmış su içinde 0.02 g toluidin mavi O çözülür. NOT: toluidin mavi O çözelti, oda sıcaklığında karanlık şişe iki hafta içinde saklanabilir. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0,02 toluidin mavi O solüsyonun 1 ml ilave edilir. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% toluidin mavisi O çözüm pipetle. Daha sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve bir kez tekrar pipetleme. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp hala bekletin. Bu çözüm karanlık olduğu gibi, görmek, bu yüzden tüp rafa bölümleri içeren tüp tutmak ve onları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir. <ol><li> % 0.02 toluidin mavisi O çözeltisi 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Toluidin mavi O sol dışarı durulama için distile su 700 ul ekleyinution. 3-4x tekrarlayın veya yıkama solüsyonu kadar açıktır. Bölümler onlara zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. </li><li> Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li>
<li>Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis and structure.</a> Plant physiology. 153, 895-905 (2010).</li>
<li>Humphreys, J. M., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewriting+the+lignin+roadmap%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Rewriting the lignin roadmap.</a> Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).</li>
<li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+chemistry%E2%80%94past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Lignin chemistry—past, present and future.</a> Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).</li>
<li>Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+Staining+of+Plant+Cell+Walls+by+Toluidine+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue.</a> 59, 368-373 (1964).</li>
<li>Mori, B., Bellani, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+for+cellulosic+and+modified+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+histochemistry%3A+official+publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls.</a> Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).</li>
<li>Maeda, H., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+hexopyranosyl+polysaccharides+with+fluorescent+brightener%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener.</a> Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).</li>
<li>Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+in+the+interaction+of+direct+dyes+with+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).</li>
<li>Hughes, J., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+an+optical+brightener+in+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+technology%22%5BJournal%5D)">The use of an optical brightener in the study of plant structure.</a> Stain technology. 50, 319-329 (1975).</li>
<li>Verbelen, J. P., Kerstens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+confocal+microscopy+and+congo+red+fluorescence%3A+a+simple+and+rapid+method+to+determine+the+mean+cellulose+fibril+orientation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants.</a> Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cellulose+reorientation+during+cell+wall+expansion+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots.</a> Plant physiology. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Liljegren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloroglucinol+Stain+for+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Phloroglucinol Stain for Lignin.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).</li>
<li>Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakano%2C+J+%22The+Detection+of+Lignin+Methods+in+Lignin+Chemistry%22">The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).</li>
<li>Sibout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CINNAMYL+ALCOHOL+DEHYDROGENASE-C+and+-D+are+the+primary+genes+involved+in+lignin+biosynthesis+in+the+floral+stem+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis.</a> The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Yeung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+19th+Workshop%2FConference+of+the+Association+for+Biology+Laboratory+Education+%28ABLE%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to the study of plant structure.</a> Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).</li>
<li>Turner, S. R., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapsed+xylem+phenotype+of+Arabidopsis+identifies+mutants+deficient+in+cellulose+deposition+in+the+secondary+cell+wall%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall).</a> The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).</li>
<li>Iiyama, K., Pant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+M%C3%A4ule+colour+reaction.+Introduction+of+methylated+syringyl+nuclei+into+softwood+lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin.</a> Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+secondary+cell+wall+deposition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biotechnology+journal%22%5BJournal%5D)">Engineering secondary cell wall deposition in plants.</a> Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).</li>
<li>Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+deposition+of+lignin+in+the+pith+of+stems+of+two+Arabidopsis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants.</a> Plant physiology. 123, 59-70 (2000).</li>
<li>Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+general+phenylpropanoid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway.</a> The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).</li>
<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROCUSTE1+Encodes+a+Cellulose+Synthase+Required+for+Normal+Cell+Elongation+Specifically+in+Roots+and+Dark-Grown+Hypocotyls+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir mali çatışması yoktur.

A. thaliana sap bölümleri yaygın olarak sekonder hücre duvarındaki hücre organizasyonunu incelemek ve niteliksel olarak vahşi tip ve transjenik bitkiler arasındaki farklılıkları incelemek için kullanılır. Örneklerin kesit için yaygın olarak kullanılan teknikler doğrudan el kesme vardır; numuneleri agaroz veya sabitleyici gömülü olduğunda ya da kesit bir vibratome veya mikrotom ile yapılabilir. Helisli aksine, sadece son iki numune ve düzgün olmayan yüzeyler arasında kalınlık farklılıklarından kaynaklanan kötü b...

Bitki hücre duvarı çeşitli bileşenlerine içinde bilgi bir bolluk tutar: lignin, selüloz, hemiselülozlar (ksilan, glucuronoxylan, ksiloglukan, arabinoksilan, karışık bağlantı glukan veya glukomannanı), ve pektin. Histolojik teknikler örgütsel ve hücresel düzeyde ikincil hücre duvarları içinde farklılıklarını inceleyerek önemli görsel ipuçları sağlar. Çeşitli histolojik teknikler geliştirilmiş ve literatürde bulunabilir, ama basit görsel talimatları ile çok detaylı protokoller nadiren hiç varsa, çünkü bu teknikler zor ve zaman alıcı yeni başlayanlar için olabilir. Bu çalışmanın amacı, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek histolojik boyama teknikleri için basit kurallar sağlamaktır. Kök doku Kesit hücre duvarları ve hücre şekillerde görselleştirilmesi ilk adımdır. El-cut bölümler ucuz ve hazırlamak için daha az zaman alacak olsa da, bir vibratom kullanımı tutarlılığı sunar veyüksek kaliteli görüntü verir. Bir vibratome kullanarak keskin görüntüler üretmek için yardımcı olur ve önemli ölçüde sadece kötü bir örnek hazırlama neden olacağını numuneler arasındaki yanlış farklılıkları üretme riskini azaltır, aynı kalınlıkta, hatta bölümleri üreterek daha iyi veri kalitesini üreten sağlar. Taze örnekleri düzeltmek için reçineler kullanılarak yeni başlayanlar için zor olabilir ve bir şekilde analiz yapılması gerektiğinde hala bile uzmanlar için zaman alıcı olabilir. Buna ek olarak, bir reçine içine gömülü olduğu zaman numunenin herhangi bir biyolojik aktivitesini ölçmek mümkün olur. Agaroz ve ev yapımı bir kalıp kullanır Basit bir tekniktir kök dokuları gömmek için yararlı olduğunu ve aynı zamanda yumuşak dokuların diseksiyonu gerektiren uygulamalarda kullanılabilir. Reçine içinde gömme örnekleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, canlı dokuları tutmak ve örnek manipülasyon azaltma avantajına sahiptir. Bir vibratom yoluyla dokulara Kesit derece hassas ve homojen üretirÇalışmanın amacına bağlı olarak, daha sonra çeşitli boyama teknikleri ile kullanılabilir, lı bölümleri. Lignin ve diğer aromatik maddelerin görselleştirmek için en basit yöntem, ultraviyole (UV) ışık kullanır. UV ışığı ile aromat bazlı moleküllerin uyarma eski bir tekniktir, ancak yine de lignin görüntülenmesi için hızlı yaklaşımlardan biridir. UV ışık diğer aromatikleri heyecanlandıracak Ancak, UV görselleştirme aslında lignin tespiti için ideal değildir. 1-3: Lignin esas olarak üç yapı, monolinyollere (koniferil alkol, sinapil alkol ve p-kumaril alkol hydroxycinnamyl alkolleri) oluşur. Phloroglucinol leke ksilem, lif, ve trakea dokularda 4 mevcut sinamaldehitler&#39;in ölçüde ipuçları sağlayabilir. Phloroglucinol genel sinamaldehitler&#39;in iyi bir göstergesi olduğunu ve sinamaldehitler&#39;in ve diğer aromatik ayırt edebilirsiniz. Sinapil alkol monomerler algılanabilirve Maule leke kullanılmasıyla ayrılır. Toluidin mavisi O çok renkli bir boya ve bu nedenle farklı renklerde 5,6 hücre duvarının farklı unsurları leke yeteneğine sahiptir. Toluidin mavi O birincil kullanımı pektin ve lignin 5,6 tespit etmektir. Toluidin mavi O kullanmanın avantajı, hücre duvarının birçok unsuru tek bir aşamada görselleştirilebilir olmasıdır. Beyaz Kalkofluor ve Kongo Kırmızı hem de çalışmak için kolay ve selüloz görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz, ve diğer non-değiştirmiş veya zayıf ikame β-Glukan 6-9, kongo kırmızı lekeler, doğrudan özellikle 10,11-β (1 → 4)-Glukan ve selüloz oysa. Bu çalışmanın amacı A. yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yukarıda belirtilen boyama tekniklerinin kullanımı için basit kuralları sağlamaktır thaliana kaynaklanıyor.

<table><tbody><tr><td>Agaroz</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>CAS Numarası: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-trihidroksibenzen [CAS Numarası: 108-73-6]</td></tr> <tr><td>Hidroklorik asit</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>CAS Numarası: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>CAS Numarası: 1336-21-6</td></tr><tr><td>Toulidin Mavi O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>Bluten klorür, Tolonyum Klorür [CAS Numarası 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Potasyum permanganat</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>CAS Numarası 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol 190 geçirmez</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>CAS Numarası: 64-17-5</td></tr><tr><td>Kongo Kırmızı</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6277</td><td>Disodyum 3,3 '- [[1,1'-bifenil] -4,4'-diylbis (azo)] bis (4-aminonaftalin 1-sülfonat) [CAS Numarası 573-58-0]</td></tr> <tr><td>Floresan Parlatıcı 28 / Calcofluor Beyaz Leke</td><td>Sigma</td><td>F3543 & nbsp;</td><td>4,4'-Bis[[4-[bis(2-hidroksietil)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-il]amino]stilben-2,2'-disülfonik asit [CAS Numarası 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>Leica Titreşimli bıçak mikrotom VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Razor</td><td>Amerikan Güvenlik tıraş bıçağı şirketi</td><td>Ürün # 60-0139-0000&nbsp;</td><td>Paslanmaz Çelik Çift Kenarlı Bıçak (Personna Super)</td></tr><tr><td>Vidalı Kapaklı Mikrosantrifüj Tüpleri (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüpleri (0.6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Mitt</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; Sıcak El Koruyucu Eldiven</td></tr><tr><td>Doku yapıştırıcısı</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>4 & ° C'de saklayın; C veya 20 & derece; 3 ay veya daha uzun süre saklama için C</td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 Anında doku yapıştırıcısı&nbsp;</td></tr><tr><td>Mekanik deklanşörsüz CCD çipli kamera&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı renkli kamera&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Kamera yazılımı&nbsp;</td><td>&nbsp; Moleküler Cihazlar</td><td>MetaMorph sürüm 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Hayal analizi&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Kapaklı Gözlükler, Kare, No. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Kapak camları korozyona dayanıklıdır ve eşit kalınlıkta ve düzdür. 1 numaralı kalınlık 0,13 ila 0,17 mm'dir.</td></tr><tr><td>Buzlu Mikro Kızaklar, 1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan ambalaj</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 Filtre küpü</td><td>Leica</td><td>11513851/11513885</td><td>560/40 bant geçiren Kongo kırmızısı analizi için kullanılan filtre.</td></tr></tbody></table>

histokimyasal boyama<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; ortaöğretim hücre duvar elemanları

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana, bitkilerdeki çeşitli hücresel süreçleri anlamak ve manipüle etmek için yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır ve ikincil hücre duvarı oluşumu çalışmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. İkincil hücre duvarı birikimi, birincil hücre duvarı yerleştirildikten sonra meydana gelir, bu işlem yalnızca damar ve lif dokuları oluşturanlar gibi özel hücreler tarafından gerçekleştirilir. İkincil hücre duvarlarının çoğu selüloz (%40-50), hemiselüloz (%25-30) ve ligninden (%20-30) oluşur. İkincil hücre duvarı biyosentezini etkileyen birkaç mutasyon izole edilmiştir ve karşılık gelen mutantlar, bu mutasyonlar telafi edici yanıtlarla maskelenebileceğinden, belirgin biyokimyasal bileşim değişiklikleri veya görsel fenotipler gösterebilir veya göstermeyebilir. Boyama prosedürleri tarihsel olarak hücresel bazda farklılıklar göstermek için kullanılmıştır. Bu yöntemler yalnızca görsel analiz araçlarıdır; Bununla birlikte, hızlı ve eleştirel analizdeki rolleri büyük önem taşımaktadır. Kongo kırmızısı ve kalkoflor beyazı, polisakkaritleri tespit etmek için kullanılan lekelerdir, oysa Mäule ve phloroglucinol, lignin içindeki farklılıkları belirlemek için yaygın olarak kullanılır ve toluidin mavisi O, polisakkaritleri ve lignini diferansiyel olarak boyamak için kullanılır. Görünüşte basit kesit alma, boyama ve görüntüleme teknikleri yeni başlayanlar için zor olabilir. A. thaliana modelini kullanarak numune hazırlama ile başlayan bu çalışma, bitkilerin ikincil hücre duvarlarında hücre ve doku organizasyonunun gözlemlenmesi için kolayca uygulanabilecek çeşitli boyama metodolojilerinin protokollerini detaylandırmaktadır.

Gömme ve kesit Kök: Gömmek için ev yapımı plastik kalıp kullanımı agaroz hızlı ve kolay (Şekil 1) kanıtladı% 7 kaynaklanıyor. İki parça (A ve B; Şekil 1) gömülü flakon sistemin basit kolayca temiz sistemini tutmak, agaroz atıl olan şişe parçaları sopa değil gibi agaroz gömülü kök serbest bırakmak için yapmak. Vialler yıl için birden çok kez tekrar edilebilir. Gömülü kök depolamak kolaylık da sonraki adımları kolaylaştırır. , Bazen gömülü benzer kurtarmak için kaynaklanıyor kesit ...

Bitki hücre duvarı bileşimi doku tipleri arasında farklılık gösterir ve lignin, selüloz, hemiselülozlar ve pektin içerebilir. Hücre tipi düzeyindeki farklılıkları görselleştirmek için çeşitli boyama teknikleri geliştirilmiştir. Bu makale, yaygın olarak kullanılan hücre duvarı boyama tekniklerinin bir derlemesidir.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Bu prosedürün genel amacı, Arabidopsis ANA ikincil hücre duvarı elementlerinin histokimyasal boyamasını göstermektir. Bu işlem, öncelikle bitki gövdesinin aros içine gömülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, aros içine gömülmüş gövde kalıptan çıkarılır ve numune disklerine aktarılır; daha sonra vibrato kullanılarak gövde enine kesitleri alınır.Ardından, kesitler çeşitli histokimyasal boyama prosedürlerine tabi tutulur. Son olarak, histokimyasal boyama ile elde edilen sekonder hücre duvarı elementlerindeki farklı değişimleri göstermek için mikroskopi kullanılır. Bu yöntem, bitki gövdelerindeki maküler dokuların değişimleri gibi hücre duvarı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler zorluk yaşayabilirler; çünkü buradaki protokollerde belirtilen basit ancak kritik adımlar daha önce derinlemesine belgelenmemiş veya basit bir şekilde sunulmamıştır. Başlamak için, plastik tüpler kullanarak gövdeleri gömmek için ev yapımı bir kalıp hazırlayın. İlk olarak, iki mililitrelik vidalı kapaklı bir mikro santrifüj tüpünün konik tabanını kesmek için bir jilet kullanın.Şırınga iğnesiyle delinmiş, tüp kapağında gömülecek gövdenin çapından biraz daha büyük bir deliğe sahip olan bu bileşen A parçası olarak adlandırılır. Ardından, 0,6 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünün tabanından yarım santimetrelik bir parçayı kesin. Bu bileşen B Parçası olarak adlandırılacaktır. 0,6 mililitrelik mikro santrifüj tüpünden kesilen yarım santimetrelik kısmı, önceden kesilmiş olan iki mililitrelik mikro santrifüj tüpünün içine ekleyin.İki parçayı paraform kullanarak mühürleyin. Bir jilet yardımıyla, ilgi duyulan bölgeden bir gövde kesiti alın ve %7'lik aros çözeltisini mikrodalga fırında düşük yoğunlukta eritin. Eriyen aros yaklaşık 50 °C'ye soğuduğunda, flakonu doldurmak için önceden hazırlanmış plastik kalıba beş mL agros'u yavaşça pipetleyin.Aros 30 ila 60 saniye boyunca soğuyup yarı katı hale geldikten sonra, sapı aeros dolu şişeye yerleştirin. Ardından, sapın ucunun kapak tarafından tutulacağı şekilde delikli kapağı yerleştirin. Şişeyi, donana kadar 10 ila 30 dakika boyunca oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede bekletin.Kalıbı, tüpten nazikçe kaydırarak çıkarın. Parafilm'i açın ve katılaşmış aros'un A kısmından cam mikroskop lamı üzerine salınması için kalıbın B kısmının altına başparmağınızla hafifçe bastırın. Kesit alın.Aros içine yerleştirilmiş gövde, uzunluğu yaklaşık 1,2 santimetre olan üç eşit parçaya ayrıldı. Gövdenin aros dışında kalan kısmı kesilip atıldı. Örnek diskin temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun.Numuneleri içeren aros bloğundaki tüm nemi gidermek için yumuşak kağıt mendiller kullanın. Numune diskine küçük bir damla doku yapıştırıcısı damlatın. Aros bloğunu, numuneler transversal kesitler için plakaya dik veya plakaya paralel olacak şekilde hızla yerleştirin.Boyuna kesitler için, yapıştırıcının örneği numune diskine oda sıcaklığında veya 4 °C'de 10 ila 30 dakika boyunca sabitlemesine izin verin. Numune diskini, kesitlerin jiletle paralel olacak şekilde tampon tepsisine veya aros bloğuna sabitleyin. Tampon tepsisini, örnekler tamamen suya gömülene kadar oda sıcaklığındaki distile su ile doldurun.Bir jilet bıçağını ikiye bölün ve ardından bıçağın tamamen düz kalmasını sağlamak için uçlarını sağlam bir makasla düzeltin. Önceden kesilmiş jilet bıçağının bir yarısını bıçak tutucuya sabitleyin. Bıçak tutucudaki açıyı 84 dereceye, hızı 0.90 millimeters per second değerine ve frekansı 50 hertz değerine ayarlayın.Kesitleri sürekli mod kullanarak 100 mikron kalınlığında kesin. Kesit alma işlemi sırasında, tampon çözelti tepsisindeki kesitleri tek kullanımlık plastik bir pipet yardımıyla toplayın. Florol boyama için birkaç kesiti iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın.Gövde kesitlerini bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe bir mililitre fluorol çözeltisi ekleyin ve tüpü hemen kapatın. Fluoro gluc anol boyasındaki hidroklorik asit oldukça korozif olduğundan, tüm kesitlerin boyandığından emin olmak için tüpü nazikçe hareket ettirin.Kesitleri nazikçe bir pipet ucuyla mikroskop lamı üzerine aktarın. Kesitlerin üzerini bir lameliyle kapatın. Kesitleri parlak alan aydınlatması altında gözlemleyin.Çözelti beş ila 10 dakika içinde kuruyarak örneklerin bozulmasına neden olur. Bu nedenle, görüntüleme bu süre zarfında tamamlanmalıdır. Kötü boyama durumunda, gövde kesitlerini bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Kesitleri içeren tüpe 1 mL %0,5 potasyum permanganat çözeltisi ekleyin. %0,5 potasyum permanganat çözeltisini, tercihen kesitleri rahatsız etmeden, pipetle nazikçe yukarı ve aşağı çekin. İki dakikalık inkübasyon ve tekrarlanan pipetleme işleminin ardından, tüm kesitler çökelene kadar mikro santrifüj tüpünü bekletin.Bir mililitrelik pipet kullanarak, 0.5% potasyum permanganat çözeltisinden 700 mikrolitre çekin, potasyum permanganatı durulamak için 700 mikrolitre distile su ekleyin. Bu işlemi üç dört kez veya su çözeltisi berrak kalana kadar tekrarlayın. Suyu döktükten sonra, kesitlerdeki koyu kahverengi renk gidene kadar hızlıca bir mililitre 3% hidroklorik asit ekleyin.Bu işlem üç ila beş dakika içinde gerçekleşebilir veya beşer dakikalık iki yıkama gerektirebilir. %3 hidroklorik asit çözeltisinin tamamını pipetle çekip boşaltın ve hemen bir mililitre konsantre amonyum hidroksit çözeltisi ekleyin. Congo red boyaması için brightfield aydınlatma altında görüntüleme yapmadan önce, gövde kesitlerini bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve bir mililitre %0,5 Congo red çözeltisi ekleyin.Kesitleri yerinden oynatmadan %0,5 Congo red çözeltisini nazikçe pipetle yukarı ve aşağı çekin. Kesitleri metin protokolünde açıklandığı şekilde inkübe edip yıkamadan önce, örnekleri nazikçe kesik bir pipet ucuyla alıp bir mikroskop lamı üzerine aktarın. Ardından üzerlerini bir lamel ile kapatın.Numuneleri mikroskop altında inceleyin. Calcior white boyaması için 560 nanometre emisyon filtresi kullanarak mavi ışık eksitasyonu altında inceleme yapın. Gövde kesitlerini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1 mL %0,02'lik calcior white çözeltisi ekleyin.Çözeltiyi pipetle nazikçe aşağı yukarı çekin. Kesitleri UV ışığı altında gözlemlemeden önce, metin protokolünde ayrıntıları verildiği şekilde inkübasyon ve yıkama işlemlerini gerçekleştirin. Toluidine blue O boyaması için gövde kesitlerini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Ardından tüpe 1 mL %0,02'lik toluidine blue O çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi pipetle nazikçe yukarı aşağı çekerek karıştırın. Daha sonra, kesitleri parlak alan aydınlatması altında gözlemlemeden önce metin protokolünde açıklandığı şekilde inkübe edin ve yıkayın. Görüntüleme için mikroskop ve kamera ayarlarının yanı sıra ultraviyole ve parlak alan görüntüleme prosedürü hakkında detaylar için metin protokolüne bakınız.Hücrelerdeki lignin de dahil olmak üzere aromatik bileşikler, UV ışığı altında otofloresansları aracılığıyla görselleştirilebilir. Ksilem ve interf fiberleri UV aydınlatması altında otofloresans gösterirken; lignin ve aromatik polimer sekonder hücre biyosentezi sırasında biriktiği için iliği, korteksi veya epidermiste bu durum görülmez; öte yandan fluorol boyası, UV aydınlatması altında gözlemlendiği üzere, pembe veya fuşya bir renk vermek için ligninin aldehit uç gruplarıyla reaksiyona girer. Ksilem ve interf fiberlerinde fuşya bir renklenme gözlemlenirken, iliği, korteksi veya epidermiste bu renklenme görülmez.Genellikle rengin yoğunluğu, kalitatif bir şekilde lignifikasyon seviyesiyle ilişkilidir. MALS boyaması, ksilem ve interf liflerindeki ingal lignin birimlerini tespit etmede spesifiktir. Kırmızı renklenme, lignin elementlerinde ingal lignin birimlerinin varlığını gösterir.Buna karşın, liflerde ksilem dokularıyla karşılaştırıldığında daha parlak bir kırmızı renklenme gözlemlenmiş olup, bu durum liflerin daha yüksek düzeyde ingal lignin içerdiğini, ksilemin ise gua lignin birimleri açısından daha zengin olduğunu göstermektedir. Calcior white ile boyanan gövde kesitleri UV ışığı altında incelendiğinde; epidermis, korteks ve iliğin boyandığı görülmüştür, çünkü tüm bu dokuların hücre duvarlarında ana polisakkarit polimeri olarak selüloz bulunmaktadır. Congo red ile boyanan kesitler mavi ışık eksitasyonu altında incelenmiş ve yine epidermis, korteks ile iliğin boyandığı saptanmıştır.Kalsiyum beyazına karşın, Kongo kırmızısı ile boyanan polisakkaritler ksilemde ve ara liflerde daha iyi görünmüş ve lignin varlığından daha az etkilenmiş gibi görünmüştür. Toluidine mavi O, çok renkli bir örnekle sonuçlandığı için polikromatik bir boya olarak sınıflandırılır. Toluidine mavi O, negatif yüklü gruplara bağlanan ve farklı renkler oluşturan katyonik bir boyadır.Boya hücredeki farklı iyonik gruplara bağlandığında, gövde enine kesitlerinin stain blue O ile boyanması, yeşilimsi mavi veya mavi renk göstermeleri nedeniyle ksilem ve demetler arası liflerin lignifiye olduğunu ortaya koymuş olup bu sonuç UV ve floroglusinol ile uyumludur. Tüm boyama gözlemlerinin aksine, pith (öz), korteks ve epidermis dokuları, lignifiye olmamalarına rağmen hücre duvarlarında bazı pektin polimerleri içerdikleri için yeşilimsi mavi veya mavi renk göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bitki gövdelerinin nasıl kesileceği ve bitki hücre duvarındaki çeşitli dokuların farklı histokimyasal boyalarla nasıl ayırt edici şekilde boyanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, özel bitki hücrelerinde bulunan lignini boyamak için Wiesner boyama tekniğini açıklıyoruz. Bu boyama tekniği, Arabidopsis thaliana saplarındaki odunlaşmış hücre duvarlarını görselleştirmeye yardımcı olur ve farklı hücre tiplerinin hücre duvarlarındaki odunlaşmanın miktarını belirlemeye yardımcı olur.

Lignini Görselleştirmek için Wiesner Boyama: Arabidopsis thaliana'nın Gövdelerinde Bulunan Lignin Birikintilerini Boyama Tekniği

Bu videoda, özel bitki hücrelerinde bulunan siringil ligninin boyanması için Maule boyama tekniğini açıklıyoruz. Bu boyama tekniği, ksilem ve interfasiküler liflerdeki lignin dağılımını karakterize etmeye yardımcı olur.

Lignin için Maule Boyama: Arabidopsis Thaliana Kök Bölümlerinde Lignin Dağılımını Karakterize Etmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, Arabidopsis thaliana gövde bölümlerindeki selüloz birikintilerini görselleştirmek için Kongo kırmızısı boyama yöntemini gösteriyoruz.

Kongo kırmızısı boyama: bitki gövdesi bölümlerindeki selüloz birikintilerini görselleştirmek için bir teknik

Bu videoda, bir dikot bitkisi olan Arabidopsis thaliana'nın hücre duvarlarında selüloz birikimini görselleştirmek için, UV ışığı altında floresan sergileyen ve β bağlı glukanlara özel olarak bağlanan kalkoflor beyazı kullanarak bir boyama prosedürünü açıklıyoruz.

Calcofluor Beyaz Boyama: Dikot Bitki Gövdesi Bölümlerinin Hücre Duvarlarındaki Selüloz Birikintilerinin UV Kaynaklı Floresan Görselleştirmesi için Basit Bir Yöntem

Bu video, bitki dokularındaki arabinogalaktan proteinlerini (AGP'ler) ve pektinleri lokalize etmek için bir immün boyama tekniğini göstermektedir. Sabit ve reçineye gömülü bitki doku kesitleri, hücre duvarındaki dokuya özgü kolokalizasyonlarını ortaya çıkarmak için AGP ve pektin spesifik birincil ve floresan ikincil antikorlar ve selüloz bağlayıcı bir floresan boya ile boyanır.

Bitki dokusunda Arabinogalaktan proteinlerinin ve pektinlerin immünolokalizasyonu

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Bu iletişim kuralı, biz teknikleri için uygun diseksiyon Arabidopsis çiçek ve siliques, bazı temel Temizleme teknikleri tarif ve yordamlar yapılar gözlemleri bütün-mount için boyama seçili.

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Bu protokol amacı nasıl Arabidopsisalt kısımlarında farklı sitelere CFDA yüklemek için göstermek için. Daha sonra çekim içinde CF ortaya çıkan dağıtım deseni sunuyoruz.

Arabidopsis 'In alt lavabo dokularında yüklü CFDA Tracer Shootward hareketi

Bu protokol, Arabinogalactan proteinlerinin ve pektinlerinin immünolokalizasyonu için bitki materyalinin hidrofilik akrilik reçineye gömülü, bölümlenmiş ve cam slaytlara monte edilmiş nasıl sabitlendiğini ayrıntılı olarak açıklar. Hücre duvarı ile ilgili epitopların spesifik antikorlarla tespit edileceğini gösteriyoruz.

Bitki Dokularının Hücre Duvarındaki Arabinogalactan Protein ve Pektinlerin Floresan İmmünolokalizasyonu

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Bu protokol, Arabidopsis thaliana tohumlarında endosperm hücre tabakasının sağlam örneklerinin hazırlanmasını açıklar. Yöntem, yalnızca enjeksiyon iğnesi ve hassas forseps gibi yaygın laboratuvar ekipmanı gerektirir ve hem gelişmekte olan hem de olgun tohumlardaki endosperm hücrelerinin yüksek çözünürlüklü floresan canlı hücre görüntülemesini sağlar.

Gelişmekte Olan ve Olgun Arabidopsis Tohumlarında Endosperm Hücre Tabakasının Mikroskobik Analizi için Sağlam Dokunun Hazırlanması

Öğrenin Arabidopsis thaliana köklerinde ikincil hücre duvarı elemanlarını görselleştirmek için histokimyasal boyama yöntemlerini. Bu teknik bitki biyolojisi araştırmalarında hücre duvarı bileşimini incelemeye yardımcı olur.

Histokimyasal boyama

Daha fazla video keşfet