Name: Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Keşfedin 3DISCO doku temizleme yöntemiyle bütün beyin ve omurilikte nöronal bağlantıları görüntülemeyi. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde sinir sistemi bütünlüğünü incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Lektin boya kuyruk damar enjeksiyonu ile gelişmiş damar görüntüleme deneyim paylaşımı için komut rivayetlerde, N. Bien-Ly katılım için, yazının eleştirel okuma B. Bingöl (Genentech) C. Höjer teşekkür, ve M Solloway (Genentech ) pankreas görüntülemede kullanılan fareler için. GFP-M hattı R. Littman (NYU) tarafından J. Sanes (St Louis Washington Üniversitesi) ve CX3CR1-GFP fareler tarafından oluşturuldu. Bu çalışma Genentech, Inc tarafından desteklenen

Tüm hayvan deneyleri ~ 3-5 aylık fareler üzerinde IACUC (Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi) yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. Yazar, hiçbir rakip mali çıkarlarını bildirir. 1.. Hayvan Perfüzyon ve Doku Hazırlanması Zamanlama: fare + post-fiksasyon başına 30-60 dk (bir kaç saat için gece). <ol><li> Hayvan tartılır ve ketamin (80-200 mg / kg) ve ksilazin (7-20 mg / kg) ya da% 2.5 avertin (0.5 ml/25 g vücut ağırlığı IP) kullanılarak anestetize. </li><li> Tam etkiyi almak için anestezi için birkaç dakika bekleyin. </li><li> Hayvan tam anestezi olduğundan emin olmak için hayvanın ayak ve kuyruk çimdik. </li><li> Kan tamamen doku çıkarılır kadar 0.1 M fosfat tampon maddesi (PB) ya da 5-10 dakika boyunca 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile oda sıcaklığında ilk önce hayvan serpmek. </li><li> Sabitleştirici çözeltiye perfüzyona geçiş: 0.1 M PB (veya 0.1 M PBS) içinde% 4 PFA ve perfüzyon devam/ dakika 3 ml &#39;lık bir hızda 30-40 dakika boyunca% 4 PFA ile. </li><li> Delme ve disseke ediliyor doku sıkma önlemek, zarar, örneğin olmadan dikkatlice ilgi organ / s teşrih. </li><li> PBS ile doldurulmuş bir petri kabına organları (bağ dokusu, beyin zarları ve dura madde) çevreleyen ilave doku çıkarın. </li><li> Birkaç saat veya gece boyunca 4 º C&#39;de için% 4 PFA organları Post-fix PFA sinyali gidermek veya özellikle GFP kanal için autofluorecense mesai 10 (kırmızı ve uzak kırmızı kanallarında daha az sorun olduğu) artabilir, çünkü sonrası uzun tespit kaçının. </li><li> Sadece takas işlemi başlamadan önce oda sıcaklığında PBS ile Organlar 2-3x yıkayın. </li></ol> 2.. Doku Takas Zamanlama: Büyük organların küçük organlarına ve 1-4 gün 2-3 saat. Notlar: Transgen ekspresyonu ile dokuların floresan etiketleme, viral transfeksiyon, boya izleme veya antivücut etiketleme temizlemeden önce tamamlanması gerekmektedir. Bütün doku temizleme adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Takas çözümler THF, DBE, BABB (1 kısım benzil alkol ve 2 bölüm benzil benzoat) ve diklorometan (davranış düzgün havalandırılmış davlumbaz deneyler) ve deri ile doğrudan temas (kullanımlık nitril eldiven) kaçınılmalıdır zehirli ve inhalasyon. <ol><li> % 50 (hacim / hacim),% 70, ve aşağıdaki gibi ayrı bir cam şişe içinde, damıtılmış su içinde% 80 THF seyreltileri hazırlamak:% 50 THF için, örneğin, hacimli bir cam şişe içinde 25 ml THF ve damıtılmış su, 25 ml karıştırın 50 ml &#39;den daha büyüktür. </li><li> Nazikçe 1-2 dakika boyunca şişeyi sallayarak çözümler karıştırın. </li><li> Açıkça cam şişe etiketleyin. </li><li> Güvenli bir şişe kapatın ve karanlık bir kabine çalışan çözümler tutun. En iyi sonuç için, aynı çalışma çözümleri artık 1-2 hafta daha kullanmayın. Bu nedenle, mümkün kullanımı taze stok reaktifler olmak için mevcut en küçük birim olarak takas çözümler sipariş. </li><li>İlk temizleme çözeltisi,% 50 THF ile cam şişeler (örneğin, 2-3 mL) doldurun ve temizleme başlatmak için cam şişelere PBS arasındaki organları aktarın. </li><li> Güvenli bir şekilde kapaklı cam şişeleri kapatın ve karıştırma için bir rotator (örneğin, bir tekerlek karıştırıcı) kullanın. </li><li> Karanlıkta cam şişe kapağı ve korumak için alüminyum folyo kullanarak. Sabit bir hızda (~ 30 rpm) de belirtilen süre (Tablo 1) için cam şişelere örnekleri karışmaya rotator başlatın. </li><li> Temizleme çözeltisini çıkarın ve Tablo 1 &#39;de zaman tamamlandığında protokolde bir sonraki ekleyin. </li><li> Bir başlık tutulur cam atık konteynerlerinin içine takas toplayın. Sonuna kadar protokolde her takas çözüm için önceki adımı tekrarlayın. Yeni temizleme çözeltisi (DBE THF değişen, örneğin) ilave edilir, yeni bir pastör pipet kullanın. </li><li> Babb veya DBE ile son temizleme adımında, inkübasyon süresi uzatılabilir veya sh edilebilirnumuneleri (o beyin gibi çok büyük bir doku ise şeffaf / veya sarımsı) tamamen görünür ışıkta şeffaf hale gelene kadar ortened. </li><li> Görüntüleme adımları da dahil olmak üzere her zaman en son temizleme çözeltisi içindeki temizlenmiş organları tutun. </li></ol> 3. Görüntüleme Temizlendi Organları hazırlanıyor Zamanlama: 5-15 dk. Not: Görüntü temizledi organlar kısa sürede tam bir takas elde edilir gibi. Bu amaçla, ışık mikroskobu tabaka (örneğin, ultramicroscopy) veya konfokal / çoklu foton mikroskopi görüntüleme için örnekleri hazırlamak için aşağıdaki adımları uygulayın. Not: Temizlendi organlar zamanla floresan gücünü kaybedecektir (özellikle floresan proteinleri örneğin, GFP, antikor etiketleme daha dirençli olduğu ve hatta uzun inkubasyon ile daha iyi sonuçlar verebilir). Görüntüleme için, çeşitli floresan mikroskopi teknikleri Clea organların doğru kullanımı sürece kullanılabilirhalka çözüm elde edilir. <ol><li> Işık sayfalık mikroskop için <ol><li> Yerleştirin veya uygun numuneyi monte edin. </li><li> El ile numune tutucu 4 vidasını çevirerek temizlenir organı düzeltildi. </li><li> Son temizleme adımında kullanıldı hangisi BABB veya DBE, ile doldurulur TheLight-tabaka mikroskobu (tercihen cam) görüntüleme odasına örnek batırın. </li></ol></li><li> Çoklu foton / konfokal mikroskopi için <ol><li> Tipik olarak yağ veya su batırma kullanım amacı, çok fotonun veya konfokal mikroskopi, görüntü ile edebilmek için son görüntüleme çözeltisi ile bir görüntüleme slayt (ya da bir görüntüleme odası) hakkında örnek monte edin. </li><li> Doku etrafında bir sınır yapmak için diş çimento kullanın. </li><li> Diş çimento tamamen rijit alır hemen önce Babb veya DBE ile havuz doldurun. Not: Diş çimento hızla katılaşır; gerçek örnekleri denemeden önce aşina almak için birkaç kez uygulama. </li><li> Hemen yerhavuz ortasında ve bir kapak camı ile örtün temizlenir örneği. </li><li> Tamamen dental çimento ile kapatılmış ve konfokal / çoklu foton mikroskobu ile maksimum derinliği görüntüleme ulaşmasını sağlayacak temizlenir organ yüzeyine temas kadar cam kapak basın. Notlar: Bu hiçbir takas çözüm görüntüleme sırasında dökülen olmasını sağlar. Bu BABB / DBE dirençli veya koruyucu kapağı olmadığı sürece lens zarar, hangi temizleme solüsyonu doğrudan görüntüleme lens daldırma kaçının. </li></ol></li></ol> 4. Görüntüleme Temizlendi Organları Zamanlama: 15-45 dk. <ol><li> Mikroskop sunabilirsiniz iyi çözünürlükte (kullanılan lens izin verirse) tüm temizledi dokuyu kapsayan bir z-tarama toplayın. </li><li> Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler toplamak için ilgi bölgelerinde yakınlaştırmak. </li></ol> Yazılım Amira ile 5 veri. Incelenmesi <ol><li> Görüntü serie yükleyinResolveRT modül, yazılım Amira s. </li><li> &quot;Resim Oku Parametre&quot; penceresi ve ok tuşuna basınız doğru voksel boyutlarını girin. </li><li> &quot;Multi Planer Görünüm&quot; alt uygulamasını seçin. Sonra 2D ve 3D değerlerini ayarlayarak, gri değerleri için optimum eşik seçmek için &quot;Kalınlık&quot; kaydırma çubuğunu kullanın. </li><li> Farklı 2D yönlerde dilimleri tarama ve 3D görünümünde mahsul-köşe modülü kullanarak örnek gözünüzde canlandırın. Not: protokolünün detaylı sorun giderme kılavuzu Ertürk ve ark 4 bulunabilir. </li></ol>

<ol><li>Tuchin, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTuchin%2C+V+%22Tissue+optics%3A+light+scattering+methods+and+instruments+for+medical+diagnosis%22">Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis</a>. , SPIE Press. (2007).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nat Med. 18, 166-171 (2012).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Erturk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+%283DISCO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li>
<li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li>
<li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ome+sweet+ome%3A+what+can+the+genome+tell+us+about+the+connectome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).</li>
<li>Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+peripheral+corneal+clarity+after+surgical+trauma+in+patients+with+Avellino+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy.</a> Cornea. 25, 497-498 (2006).</li>
<li>Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bond+strength+and+debonding+characteristics+of+a+new+ceramic+bracket%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+orthodontics+and+dentofacial+orthopedics+%3A+official+publication+of+the+American+Association+of+Orthodontists%2C+its+constituent+societies%2C+and+the+American+Board+of+Orthodontics%22%5BJournal%5D)">Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket.</a> American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).</li>
<li>Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in neurodegenerative disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).</li>
<li>Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Disease%3A+astrocytes+in+neurodegenerative+disease.+Nature+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice.</a> Neurology. 2, 679-689 (2006).</li>
<li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22%C3%9Cber+das+Durchsichtigmachen+von+menschlichen+und+tierischen+Pr%C3%A4paraten%22">Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten</a>. , S. Hirzel. (1903).</li>
<li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroinflammatory+response+in+humans+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+applied+neurobiology%22%5BJournal%5D)">The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).</li>
<li>Zotova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+alterations+in+human+Alzheimer%27s+disease+following+Abeta42+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+applied+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).</li>
<li>Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+cochlear+implantation+in+Friedreich%27s+ataxia%3A+A+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cochlear+implants+international%22%5BJournal%5D)">Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study.</a> Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).</li>
<li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cognitive+sciences%22%5BJournal%5D)">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).</li>
<li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li>
<li>Soderblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+fibroblasts+form+the+fibrotic+scar+after+contusive+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury.</a> J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
</ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Doku temizleme yöntemleri temizlenir organlarda çeşitli doku katmanlarının kırılma indisleri ile görüntüleme ışık saçılımını azaltmaktır. Sonuç olarak, görüntü ışık derin dokulara nüfuz ve etiketlenmiş hücre / molekülleri uyarabilir. 17 takas doku Bu eski bir kavram Dodt ve arkadaşları 2 bozulmamış fare beyinleri üzerinde tekniğin ilk sofistike uygulamadan sonra artan ilgi görmüştür. O zamandan beri, 3DISCO, SCA / e, ClearT2, berraklık ve SeeDB 3,4,7,18-20 dahil olmak üzere yeni takas yöntemleri hızla büyüyen bir liste var. Özünde, hepsi floresan etiketi koruyarak derin doku görüntüleme için şeffaf organlarını vermeyi hedefliyoruz. Bunlar arasında, 3DISCO en basit ve tekrarlanabilir yöntemlerden biri olarak öne çıkıyor. Nispeten hızlı bir diğer takas yukarıda bahsedilen yöntemlerle (1-5 gün vs yetişkin beyinlerinde için 2-3 hafta, sırasıyla) 21 karşılaştırılır. Zaten başarı olmuşturtam olarak, beyin, omurilik, lenf düğümleri, dalak, akciğer, katı tümörler, pankreas, meme bezleri ve 3,4,9 farklı organlara tatbik. Buna ek olarak, bağımsız araştırma grupları tarafından çeşitli yayınlar zaten görüntüleme 22,23 sonuçları elde etmek için bu yöntem kullanılır. Bununla birlikte, farklı doku temizleme işlemleri farklı koşullar için avantajlı olabilir. Sca / e ve SeeDB embriyonik dokular 6,7 en iyi uygulanabilir iken Örneğin, onlar görüntüleme sırasında işlemek için daha kolay olabilir, su bazlı temizleme yöntemleri vardır. Buna karşılık, BERRAKLIK karmaşık ve pahalı bir takas yöntemidir. Ama özellikle beyin 8 gibi büyük dokularda, antikor etiketleme bağlamında avantajlı olabilir. 3DISCO en iyi görüntüleme sonuçları elde etmek için en kritik adım, doku temizleme önce gerçekleştirilir doku etiketleme vardır. Bu mümkün olan en güçlü flüoresan sinyali ile başlamak için gereklidir. Bu be sentetik boyalar, transfeksiyon ya da viral antikor etiketleme izlemeyi, floresan proteinleri transgenik ekspresyonu dahil olmak üzere, çeşitli yollarla elde etti. Herhangi bir temizleme prosedürü dokuların floresan sinyalini azaltacaktır akılda tutulmalıdır. Flüoresan sinyal başında yeterince güçlü değilse Dolayısıyla, - bu temizlenir dokuların takas görüntüleme önce kolayca saptanabilir değildir, yani kötü sonuçlar verecektir. Iyileştirmeler için bekleyen yöntemleri temizleyerek bazı sınırlamalar vardır. Kritik bir sınırlama temizleyerek reaktifler temizlenir organların yapısını değiştirmesi nedeniyle, onlar canlı dokuya kullanılamaz olmasıdır. Bu nedenle, bu gibi foto-aktifleştirilebilen mEos2 24 gibi deneyler sabitleme ve temizleme önce yapılmalıdır. Açıklıkta üzerine, parlak ve ışığa proteinlerden floresan sinyal süper çözünürlüklü görüntüleme mümkün olur. İlave olarak, temizleme protokol azalırfloresan protein yoğunluğu, temizlenmiş organlar uzun süre depolanamaz. Bazı organların Silinecek zor olduğunu not etmek önemlidir. Kesilen organlarda kan hücrelerinin (örneğin, dalak, karaciğer) yüksek miktarda elde ederse, özellikle, bu açık ve görüntü nispeten zordur. Bu tür yetişkin kemirgen beyin gibi büyük dokular için tam bir temizleme elde etmek için de nispeten daha zordur. Bu dokular, diğer taraftan, floresan sinyali azaltmak olabilecek, uzun inkübasyon süreleri gerekebilir. Buna ek olarak, mikroskobi yöntemlerinin geliştirilmesi görüntü büyük şeffaf organlar kerede yüksek çözünürlükte ele alınması gereken bir bekleyen ihtiyaç olabilir. Tekniğin diğer önemli kısıtlılığı doku etiketleme. Genetik ya da virüs ifade ile, güçlü bir flüoresan sinyal doğru olmakla birlikte, her bir hücre veya molekül genetik veya viral yönden etiketli olabilir. Diğer taraftan, kalın dokuların antikor etiketleme basit bir işlem değildir ya da po değilçoğu durumda ssible. Bu 3 (birkaç hafta birkaç gün) özel permeabilizasyon protokolleri ve uzun inkübasyon süreleri gerekebilir. Bu dokular nedeniyle dehidratasyon ve delipidasyon esas temizledikten sonra (omurilik dokusu için ölçülen) her boyutta ~% 20 küçültmek akılda tutmak için de önemlidir. Bu çekme ratiometrically meydana gelir ve miktar adımda düzeltilmelidir. Sunulan sonuçlarında görüldüğü gibi, floresan etiketli yapılar temizlenmiş dokularda protein bütünlüğünün göstergesi olan, sağlam kalır. Örneğin, Focusclear-ki berraklık veya% 80 gliserol içinde kullanıldığı için, nihai temizlenir doku hidrofobik doğası, ayrıca antikor ile boyandı edilemez ya da su ihtiva eden çözeltiler içinde gömülü. Son olarak, görüntüleme verileri ezici boyutlarını analiz etmek için bir meydan okumadır. Bütün bir kemirgen beyin hücresel çözünürlükte taranır Örneğin, istenilen str izlemek ve ölçmek çok zor olurduuctures (örneğin, nöronal veya glia şebekeleri) ve otomatik bir şekilde farklı örnekleri üzerinde karşılaştırın. Araştırmacılar, yeni takas yöntemleri bulmak amacı ise özetle, (çeşitli dokuları temizleyerek zorluk, daha geniş alanlara yüksek çözünürlükte görüntüleme ve karmaşık veri analizi) Yukarıda çeşitli zorluklar paralel olarak geliştirilmelidir. Sonuç olarak, 3DISCO dahil son zamanlarda geliştirilen doku temizleme teknikleri, zarif sağlam organların yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme artık mümkün olduğunu göstermektedir. Bu yöntemler kullanarak, bilim adamları, sağlam organın hücre ve moleküllerin anatomik bilgi edinebilirsiniz. Şeffaf organlar üzerinde bu öncü 3D görüntüleme çalışmaları karmaşık anatomik ve sağlığı ve hastalığı dokuların / organların moleküler örgütlerini deşifre araştırmacılar giderek artan sayıda ilham.

Biyolojik dokuların histolojik inceleme doğal bağlamda moleküller / hücrelerinin doğasını anlamada temel bir yaklaşımdır. İdeal olarak, tüm organ, yüksek çözünürlüklü görüntüleme en bilgilendirici ve arzu edilir. Işık saçılması 1 nedeniyle sınırlı bir nüfuz etme derinliği, sahip olduğu için, sabit organ yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme gerçekleştirmek için kesitli olması gerekir. Bu nedenle, histoloji çalışmaların çoğu organın sadece küçük bir bölümünü temsil eden birkaç doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bazı çalışmalarda, örneğin, beyin veya omurilik nöron bağlantıları dışarı iz amaçlayan bu, hedef organlar tüm doku bölümleri toplanır ve 3D rekonstrüksiyon için görüntülenmiş. Ancak, doku kesit ve bireysel bölümlerin sonraki görüntüleme çeşitli sınırlamalar vardır. Bunlar olması nedeniyle mekanik bozulmalara zaman alıcı ve doku eksik 3D rekonstrüksiyon yol ve zor bulunurelde edilen görüntülerin hizada ler. Son zamanlarda, takas ve görüntüleme sağlam şeffaf organlar bu eksiklik 2,3 önemli bir çözüm olarak geliştirilmiştir. Açıklığın üzerine, tüm organı işlenir şeffaf görüntüleme hafif seyahat için izin uçtan uca böyle bir çoklu foton veya hafif sayfalık mikroskop gibi bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak unsectioned organın yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için (Şekil 1) ( Şekil 2). Çeşitli araştırma grupları farklı amaçlar için kendi ilgi doku görüntü edebilmek için yeni doku takas protokolleri geliştirmiştir. Bu organik çözücünün 2-5, 8 temizleme protokolleri su bazlı 6,7 ve elektroforez içerir. Bunlar arasında, bir çözücü 3-boyutlu görüntüleme organları temizlenmiş ya da 3DISCO merkezi sinir sistemi (CNS) organlar, immün organlar ve katı tümörler dahil olmak üzere biyolojik numune bir çeşitliliği üzerinde kolayca uygulanabilir bir protokoldür. Addit içindeiyon, bu tür ışık tabaka floresan mikroskobu (LSFM), çoklu foton ve konfokal lazer tarama mikroskobu gibi farklı mikroskopi teknikleri ile birleştirilebilir. 3DISCO örneğin 4, tetrahidrofuran (THF) ve dibenzil eter (DBE) olarak kolaylıkla temin edilebilen ve pahalı reaktifler ile takas dayanmaktadır. Tüm protokol 3-4 saat gibi kısa sürebilir. Böylece, 3DISCO 9 tamamlamak için ay hafta sürebilir geleneksel histolojik yöntemlere göre sağlam ve hızlı bir tekniktir.

<table><tbody><tr><td>Thy-1 GFP (GFP-M) fare</td><td></td><td></td><td>Jackson'dan temin edilebilir.</td></tr><tr><td>CX3CR1 GFP fare</td><td></td><td></td>, <td>NYU'daki Littman laboratuvarından elde edilebilir.</td></tr><tr><td>TgN(hGFAP-ECFP) fare</td><td></td><td></td><td>Jackson'dan elde edilebilir.</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917-16</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2 Tribromoetanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Metil-2-bütanol</td><td>Sigma</td><td>152463</td><td>Kullanılmış Avertin solüsyonu hazırlamak için.</td></tr><tr><td>Tuzlu</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofuran</td><td>Sigma</td><td>186562-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Sigma</td><td>270997-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzil eter</td><td>Sigma</td><td>Sigma, 108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Benzil alkol</td><td>Sigma</td><td>305197-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Benzil benzoat</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Lektin FITC</td><td>Sigma</td><td>L0401-1MG</td><td></td></tr><tr><td>anti-CC10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9772</td><td>0.388888888</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP ilaçları</td><td>504001</td><td>Perfüzyonda kullanılır.</td></tr><tr><td>Cam şişeler</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Mini Döndürücü</td><td>VWR</td><td>100498-878</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Folyo</td><td>Fisherbrand</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Medya Saklama Şişeleri</td><td>Kimax Medya Şişeleri</td><td>EW-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>MF4* orta akışlı pompa kafalı</td> <td>Minipuls evrim perfüzyon pompasıGilson, Inc</td><td>F110701 ve F117606</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu slaytı</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>FastWell</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>FW20</td><td></td></tr><tr><td>Kapak kayması</td>, <td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>Cam petri kabı</td>, <td>Corning Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr>, <tr><td>Diş çimentosu</td>, <td>Lang Dent</td>, <td>1223PNK,</td><td></td></tr><tr><td>Quantofix Peroksit Testi Şeritler</td><td>Sigma</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Amira ile RT çözme mikroskopi modülü</td><td>Visage Imaging</td><td>görüntü analiz yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane görüntüleme</td><td>görüntü analiz yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>ücretsiz yazılım</td><td></td></tr></tbody></table>

görüntüleme 3disco ile hücresel düzeyde sağlam biyolojik sistemleri temizlendi

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Saydam organların doku temizleme ve ardından görüntülenmesi, sağlam organlarda floresan etiketli hücreleri ve molekülleri 3 boyutlu olarak analiz etmek için güçlü bir yöntemdir. İlgilenilen dokunun floresan görüntüleme için bölümlere ayrıldığı geleneksel histolojik yöntemlerin aksine, temizlenmiş dokunun 3D görüntülemesi, tüm numunedeki etiketli hücrelerin ve moleküllerin incelenmesine izin verir. Bu amaçla, optik olarak opak dokular, doku boyunca refrakter indeksler eşleştirilerek şeffaf hale getirilmelidir. Daha sonra, numunenin tam bir yüksek çözünürlüklü 3D görüntüsünü elde etmek için doku lazer tarama mikroskopları kullanılarak bir kerede görüntülenebilir. 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 ve SeeDB dahil olmak üzere büyüyen bir doku temizleme protokolleri listesi, araştırmacıların ilgilendikleri dokuyu bir bütün olarak görüntülemeleri için yeni yollar sağlar. Bunlar arasında 3DISCO, farklı doku türlerini temizleyebilen ve çeşitli mikroskopi teknikleriyle kullanılabilen, oldukça tekrarlanabilir ve basit bir yöntemdir. Bu protokol, bu basit prosedürü açıklar ve çeşitli uygulamalarını sunar. Ayrıca sınırlamaları ve olası zorlukları ve bunların üstesinden nasıl gelineceğini tartışır.

Nöronlar derece derece uzun morfolojisi ile hücreler polarize edilir. Bunların işlevi birbirlerini arasında ve diğer dokular ile meydana bağlantıları bağlıdır. Bu nedenle, nöronların yapısal organizasyon haritalama, sağlık ve hastalıkta nasıl işlediğini anlamak için son derece önemlidir. Ancak, tüm sinir sistemi-son zamanlarda adında connectomics 11 boyunca böyle muazzam nöronal bağlantıları izleme - hala nörobilim alanında en zor sorunlardan biri olmaya devam etmektedir. Bu amaçla, AB 12 ve ABD 13 hem de insan beynini haritasına büyük projeler başlatmış bulunuyoruz. 3DISCO çeşitli organlar üzerinde istihdam edilebilir olsa da, omurilik ve beyindeki nöronal uzun bağlantılarını izlemek için özellikle yararlı olmuştur. Örneğin, büyük temizlenir omurilik bölümlerinin ultramicroscopy taramalar kullanılarak, aksonal bağlantıları kemirgen omurilik (santimetre üzerinde takip edilebilirŞekil 2). Benzer bir şekilde, tüm temizlenir fare beyni (Şekil 3a) ve hipokamp (Şekil 3b), beyindeki nöronal bağlantıları takip görüntülenebilir. Konfokal mikroskopi ya da çoklu foton temizlenir organlar üzerinde kullanıldığı zaman, görüntüleme çözünürlüğü önemli ölçüde, özellikle z-boyutunda, geliştirilebilir. Örneğin, GFP-M hattı fareler (Şekil 4a) temizlenir omurilik çoklu foton görüntüleme omurilik bütün derinliği (~ 1.5-2 mm) boyunca kesintisiz bir görüntü elde eder. Temizlenir omurilik konfokal mikroskopisine benzer bir şekilde (Şekil 4b ve c) gelişmiş çözünürlük sunuyor. Temizlenir beyinleri çok foton mikroskobu görüntüleme dendritik dikenler (Şekil 5) içeren sinirsel yapıların ince ayrıntıları görselleştirmek için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler sunar. 3DISCO için örnekler vir transgen ekspresyonu dahil olmak üzere, çeşitli yollarla etiketlenebiliral transfeksiyon, boya izleme ve antikor etiketleme. Örneğin, kan-beyin-bariyerini incelemek için kullanılabilir lektin konjüge floresan izleyiciler 4 ile beyin (Şekil 6a ve b) ve omurilik (Şekil 6c ve d), (BBB tüm damar etiket mümkündür ) sağlık ve hastalık. Mikroglia ve astrositler Hem yüksek Alzheimer hastalıkları ve travmatik yaralanmalar 14,15 nörodejenerasyon dahil olmak üzere patolojisinde de işaret edilir. 3DISCO kullanarak, bunların yoğunluğu ve omurilikte dağılımı (Şekil 7) veya beyin incelenebilir. Olmayan nöronal dokular da görüntülenebilir. Örneğin, tüm kemirgen akciğerlerde Clara hücre antikorları ile imüno edilebilir ve tek hücre düzeyinde (Şekil 8) en kesit olmadan görüntülenmiş. Benzer şekilde, temizlemek mümkündür ve görüntü hücreleri örneğinunsectioned pankreas dokusu (Şekil 9) alfa hücreleri. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1.. 3DISCO doku temizleme derin doku görüntüleme için şeffaf unsectioned dokuları oluşturur. Görünür ışığın görüldüğü gibi (a) Temizlenmemiş ve temizlenmiş (b) omurilik dokuları. Açıklıkta üzerine, derin doku lazer tarayıcı mikroskop mümkün olur. (C) Temizlenmemiş ve temizlenir omurilik dokuları 2-foton mikroskobu ile görüntülenmiştir. A, b = 0.5 mm ve 100 um c = Ölçek çubukları. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2.. Aksonal uzantıları takip omurilik 3DISCO görüntüleme. Thy-1 GFP transgenik fare hattı (GFP-M) gelen disseke omurilik ~ (küçük parçalara ayrılır4 mm). Küçük dokularda (Tablo 1) için temizleme protokolü takip sonra, saydam omurilik ultramicroscopy kullanılarak görselleştirilmiştir. Yatay bir ~ 4 mm omurilik segmentinin 3D rekonstrüksiyon (a), koronal (b) ve sagital görünümü (c). (D) Temsilcisi aksonlarını (kırmızı) takip gri tonlama şeffaf görünümde gösterilir. (D) &#39;de gösterilen bölge (e) yüksek büyütme görünüşüdür. A, b, c, d = 0.5 mm ve = 20 um e Ölçek çubukları. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> Temizlenir beynin hipokampus ve Şekil 3. 3DISCO görüntüleme. Temizlenir beyinleri ve GFP-M farelerin Hipokampuslardan örnekleri bir ultramicroscope ile görüntülendi. Nöronal netwo gösteren bütün beyin (a) ve hipokampus (b) 3D görselgörüntülenmiş saydam dokularda rks. A = 2 mm ve b Ölçek bar = 20 mikron. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4,. Doku temizleme çoklu foton ve konfokal mikroskobu ile elde çözünürlüğü geliştirir. Çoklu foton (a) ya da eş odaklı mikroskopi ile görüntülenmiştir GFP-M farelerden Şeffaf omurilik kesimleri (b, c). Esasen takas akson ve dendritler ince yapısını ortaya çözünürlük ve görüntüleme derinliğini artırır unutmayın. A = 100 um ve b Ölçek çubukları, c = 20 um. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5. Dendritik dikenler 3DISCO görüntüleme. Çoklu foton tarafından görüntülendi GFP-M farelerin Şeffaf beyin dokusu. Ver sunulan taranmış korteks bölgesi 3D görselleştirme(a) tical ve yatay perspektifler (b). (C) &#39;de belirtilen ~ seviyelerinden 50 mikron çıkıntı (a, b). (C) dendritik dikenler (ok başları) de dahil olmak üzere nöronal yapıların ince detayları göstermek de belirtilen bölgenin (d) yüksek büyütme. B a = 50 mikron Ölçek çubukları, c = 25 mikron, d = 5 um. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> 16, anlatıldığı gibi Şekil 6,. Damar 3DISCO. Tüm organlarda kan damarları etiketlemek için, lektin-FITC boya (Açıklığın öncesi) perfüzyon sırasında kullanıldı. Biz izleyici kuyruk ven enjeksiyon izleyicinin kardiyak perfüzyon üzerinde daha iyi sinyal verir bulduğunu söz dikkat çekicidir. Sabit beyin ve omurilik toplandıktan sonra temizlenir ve i edildiultramicroscopy tarafından maged. İlgi haritası, tüm fare beyin damar 3 boyutlu görüntüleme (a) ve gri-ölçeği (a). Bir fare omurilik İlgi haritası segmenti (c) ve gri-ölçekli (d) &#39;nin damar (b) 3D görselleştirme. HeatMap lektin boyama yoğunluğuna göre oluşturulan; mavi: düşük yoğunluklu (arka plan) ve kırmızı: yüksek yoğunluklu (damarsal). A = 2 mm, b = 1 mm, ve c, d = 250 mikron Ölçek çubukları. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> Temizlenir CNS doku glia hücreleri Şekil 7.. 3DISCO. Mikroglia Tg (CX3CR1-EGFP) veya astrosit TGN (hGFAP-eCFP) GFP ifade eden transjenik farelerin omurilik temizlenir ve çok foton mikroskopi ile görüntülenmiştir. Mikrogliya 3D render yüzey hacim görselleştirme (a) ve şeffaf görünümde (olarak gösterilen <strong&gt; b). (C) Optik çıkıntı (~ 50 um), omurilikte mikroglia ayrıntıları göstermek için sunulmuştur. Astrositlerde 3D ​​render yüzey hacim görselleştirme (a) ve şeffaf görüntüsü (b) olarak gösterilmiştir. (F) Optik çıkıntı (~ 50 um), omurilikte astrositlerin ayrıntıları göstermek için sunulmuştur. = 50 um f a, b, d, e = 100 um ve c Ölçek çubukları. <img alt="Şekil 8," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> Amacıyla clara hücrelerin antikor boyama ile bir bütün montaj lobun Şekil 8.. 3DISCO. Akciğer lobu tüm montaj antikor boyama için, 10 haftalık BABL / C dişi fareler PBS ile sağ ventrikül ile perfüze edildi akciğerlerden kan kaldırmak. Akciğerler, daha sonra, en az üç kez th hacminin% 4 PFA ile şişirilmiş ve sabitleyici olarak oda sıcaklığında O / N sabitlendie doku. Bir sonraki gün, akciğerler kısaca PBS içinde durulandı ve sağ lob 48 saat boyunca nüfuziyet veya doku batan kadar PBS içinde% 1 Triton X-100, 5 ml konulmuştur. Tüm boyamalar,% 5 FBS ve% 2 BSA içeren PBS içinde% 0.2 Triton X-100 içinde yapılır ve durulama PBS içinde% 0.2 Triton X-100 içinde idi. Anti-CC10 ile boyama, yaklaşık olarak 6 saat için geniş yıkama, ardından 4 ° C&#39;de 72 saat idi. Birincil antikor floresan etiketleme gece boyunca 4 ° C&#39;de 6 saat için gece boyunca yaygın yıkamalar ve ardından anti-keçi-Alexa Fluor 594-ikincil antikor ile elde edilmiştir. Ertesi gün, lekeli loblar 30 dakika boyunca% 50,% 70 ve% 80 THF ile silinmesinden DBE olarak 30 dakika süre ile, DCM, ardından 20 dakika% 100 THF içinde üç yıkama 30 dakika, ardından her biri. A ve b = 1 mm ve c = 100 mikron Ölçek bar. <img alt="Şekil 9," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> Rakam<html> 9. Pankreas 3DISCO. Protokol, yukarıda tarif edildiği gibi farelerde perfüzyon sonra, pankreas kesitlere ayrılmıştır ve kısa bir protokol ile temizlenir. Floresan glukagon ATG eklenen CreERT2 ile endojen fare glukagon lokusu kapsayan bir 200 kb BAC transgeni taşıyan farelerin tamoksifen tarafından uyarılan ROSA26 LSL tdTomato rekombinasyon türetilmiştir. Ok uçları adacığmdaki floresan-etiketli a hücrelerin bazı işaretleyin. A, b ve c = 1 mm ve d = 500 mikron Ölçek çubukları. <img alt="Tablo 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> Tablo 1. Çeşitli dokularda için Doku takas protokolleri. Farklı dokular için doku takas protokol örnekleri. Her adım için takas süresi kısaltılabilir veya takas performansını artırmak için gerektiğinde uzatılabilir unutmayın. Küçük dokuların yaklaşık ağırlığı 20-100 mg ve beyin ~ 300-500 mg dır ~ olduğunu.ttps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu tablonun daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Büyük dokular içindeki floresan etiketli hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için, ideal olarak, biyolojik numuneler kesitlere ayrılmadan görüntülenmelidir. 3DISCO, organik çözücülerle sıralı inkübasyona dayanan basit bir doku temizleme prosedürüdür. Temizlendikten sonra, organlar şeffaf hale gelir ve numunenin uçtan uca lazer taramasına izin verir.

Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, histolojik kesit alma işlemi yapmadan floresan işaretli bütün biyolojik örneklerin görüntülenmesidir. Bu, fikse edilmiş dokuların tam bir şeffaflık elde edilene kadar organik çözücülerde ardışık olarak inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak.Şeffaf dokular, bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak 3B olarak görüntülenir. Ardından, görüntüleme sonuçları analiz edilir ve kesilmemiş omurilik ile beyindeki nöronal yapılar, toplanan üç boyutlu görüntülerden 3B olarak yeniden oluşturulabilir. Bu yöntem, tüm beyin ve omurilikteki nöronal ve GAL bağlantılarının nasıl haritalanacağına dair nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin etkileri, artık tüm sinir sistemi boyunca nöral bütünlüğü görselleştirebildiğimiz için nörodejenerasyon tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem sinir sisteminin organizasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, akciğer veya tümör dokusu gibi diğer organlara da uygulanabilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik spinal kord veya akciğer gibi küçük organlar için sadece birkaç saat, beyin için ise yaklaşık bir veya iki gün sürer. Prosedüre, hasat edilen doku başına bir cam şişeye iki ila üç mililitre taze hazırlanmış %50 THF ekleyerek başlayın.Ardından, fikse edilen organları şeffaflaştırma çözeltisine aktarın ve tüplerin kapaklarını sıkıca kapatın. Tüpleri bir rotatöre yerleştirin ve alüminyum folyo ile kaplayarak örnekleri 30 RPM sabit hızda uygun süre boyunca karıştırın. Daha sonra şeffaflaştırma çözeltisini uzaklaştırın ve dokuyu bir sonraki çözeltiye askıya almak için yeni bir PE veya pipet kullanın.Son şeffaflaştırma adımı sırasında tabloda belirtildiği üzere, çok fotonlu veya konfokal mikroskopi için örnekler tamamen şeffaf hale gelene kadar çözelti içinde tutun. Tam bir şeffaflaşma sağlandığı anda, bu amaçla örneği bir görüntüleme lamı üzerine monte edin. Dokunun etrafına bir sınır oluşturmak için diş hekimi simanı kullanın.Diş çimentosu tamamen sertleşmeden hemen önce havuzu son berraklaştırma solüsyonu ile doldurun ve ardından berraklaştırılmış örneği derhal havuzun ortasına yerleştirip üzerini bir kapatma lamı ile örtün. Tam berraklaştırma sağlandığında, ışık sayfası mikroskobisi montajı için kapatma lamını, diş çimentosuyla tamamen mühürlenene ve berraklaştırılmış organun yüzeyine değene kadar bastırın ve ardından örneği sabitlemek için örnek tutucunun vidasını manuel olarak çevirin. Son olarak, örneği, görüntülenen dokuya uygun son berraklaştırma solüsyonu ile doldurulmuş ışık sayfası mikroskobunun görüntüleme haznesine daldırın.Ardından, mikroskobun sağlayabileceği en iyi çözünürlükte, temizlenmiş dokuların tamamını kapsayacak şekilde Z taramaları yapın ve daha yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için ilgi duyulan bölgelere yakınlaşın. Görüntüleri topladıktan sonra, görüntü serisini resolve RT modülü ile Amira yazılımına yükleyin. Seri yüklendiğinde, görüntü okuma parametre penceresine doğru voksel boyutlarını girin ve tamam'a tıklayın.Ardından, çok düzlemli görünüm alt uygulamasını seçin. Daha sonra, optimum projeksiyon kalınlığını ve gri değerler için eşiği belirlemek amacıyla birincil ve kalınlık sürgülerini kullanın. Son olarak, farklı 3D yönelimlerdeki kesitleri incelemek için kırpma köşesi modülünü kullanın.Numuneleri görselleştirmek için, nöronların yapısal organizasyonunun haritalandırılması, sağlıklı durumlarda ve hastalıklarda nasıl işlediklerini anlamak açısından son derece önemlidir. Üç boyutlu görüntüleme çeşitli organlarda uygulanabilse de, özellikle omurilik ve beyindeki uzun nöronal bağlantıların izlenmesinde oldukça kullanışlıdır. Örneğin, büyük temizlenmiş omurilik segmentlerinin ultra mikroskopi taramaları kullanılarak, bu görüntülerde örneklendiği gibi kemirgen omuriliğindeki aksonal bağlantılar santimetrelerce boyunca takip edilebilir.Benzer şekilde, beyindeki nöronal bağlantıları takip etmek için şeffaflaştırılmış fare beyninin ve hipokampüsün tamamı görüntülenebilir. Konfokal veya çok fotonlu mikroskopi kullanıldığında, görüntüleme çözünürlüğü, özellikle Z boyutunda önemli ölçüde artırılabilir. Örneğin, GFPM hattı farelerinden alınan şeffaflaştırılmış omuriliklerin çok fotonlu görüntülemesi, omuriliğin 1.5 ile iki milimetrelik toplam derinliği boyunca kesintisiz bir görüntü sağlar.Şeffaflaştırılmış omurilik üzerinde uygulanan konfokal mikroskopi, benzer bir şekilde geliştirilmiş çözünürlük sağlar. Şeffaflaştırılmış beyinlerin çok fotonlu mikroskopi görüntülemesi, dendritik dikenler dahil olmak üzere nöronal yapıların ince detaylarını görselleştirmek için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler sunar. Three disco örnekleri çeşitli yollarla işaretlenebilir.Örneğin, sağlıklı durumlarda ve hastalıklarda kan-beyin bariyerini incelemek için kullanılabilen lektin konjuge floresan izleyiciler yardımıyla beyin ve omuriliğin tüm vaskülatürünü etiketlemek mümkündür. Üç boyutlu görüntüleme yöntemleri kullanılarak büyük dokulardaki daha küçük hücreler de görüntülenebilir. Örneğin, hem mikroglia hem de astrositler; Alzheimer hastalığı ve travmatik yaralanmalar dahil olmak üzere nörodejenerasyon patolojisinde yüksek düzeyde rol oynamaktadır.Üç disk kullanılarak, bunların omurilikteki yoğunluğu ve dağılımı incelenebilir. Nöronal olmayan dokular da görüntülenebilir. Örneğin, kemirgen akciğerlerinin tamamındaki Clara hücreleri antikorlarla immün olarak işaretlenebilir ve kesit alınmadan tek hücre düzeyinde görüntülenebilir.Benzer şekilde, parçalanmamış pankreas dokusunda hücrelerin şeffaflaştırılması ve görüntülenmesi mümkündür. Örneğin, bu pankreas görüntülerinde, şeffaflaştırma işleminin ardından floresan işaretli alfa hücreleri görüntülenmiştir. Şeffaflaştırma ve görüntüleme adımları basit olsa da veri analizi karmaşık olabildiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir.Bu prosedür uygulanırken, floresan sinyali şeffaflaştırma solüsyonu içinde zamanla azalacağı için, tam şeffaflık elde edilir edilmez temizlenmiş dokuların görüntülenmesi önemlidir. Bu tekniğin geliştirilmesi, beyindeki nöronal ağların haritalanması gibi, araştırmacıların detayları ve bütün halindeki organları incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, tüm organlardaki hücresel ve hücre altı yapıların nasıl şeffaflaştırılacağı ve görüntüleneceği, ardından bunların nasıl görselleştirilip analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

imaging-cleared-intact-biological-systems-at-cellular-level

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Optik temizleme teknikleri, dokuların görselleştirilme biçiminde devrim yaratıyor. Bu raporda, daha tutarlı ve daha ucuz sonuçlar veren orijinal Clear Lipid değişimli Akrilamid hibritleştirilmiş Rijit Görüntüleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY) protokolünün modifikasyonlarını açıklıyoruz.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Yüksek lipid içeriği nedeniyle yağ dokusu geleneksel histolojik yöntemlerle görselleştirmek için zor oldu. Adipo-temiz sağlam etiketleme ve yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel floresan görüntüleme sağlayan tekniği temizleyerek bir dokudur. Burada, numune hazırlama, ön, boyama, takas ve montaj için görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Yeni, immünostasyon uyumlu doku Temizleme teknikleri gibi solvent temizlenmiş organların nihai 3D görüntüleme kuduz virüsü beyin enfeksiyonu ve karmaşık hücresel çevre 3D görselleştirme sağlar. Kalın, antikor etiketli beyin dokusu dilimleri, görüntüleme derinliğini artırmak ve konfetik lazer tarama mikroskobu ile 3D analizini sağlamak için optik olarak şeffaf hale gelmiştir.

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

Nöronal dendritik morfoloji genellikle fonksiyon alttan. Gerçekten de, nöronların gelişimini etkileyen birçok hastalık süreci morfolojik bir fenotip ile kendini gösterir. Bu protokol, bozulmamış dendritik çardakları ve ilişkili dikenlerini analiz etmek için basit ve güçlü bir yöntemi açıklar.

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Bu protokol, iDISCO + kullanarak bozulmamış fare beyinlerinin manyetik rezonans görüntüleme, temizleme ve immünoetiketleme yöntemlerini açıklar, ardından ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülemenin ayrıntılı bir açıklaması ve NuMorph kullanılarak aşağı akış analizleri yapılır.

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Burada, murin aortunu üç boyutlu (3D) olarak görüntülemek için optimize edilmiş doku temizleme protokolleri sunuyoruz. Aterosklerozda adventiti ve aterosklerozda periferik sinir sisteminin aterosklerotik plaklarla anatomik yakınlığını tanımlamak amacıyla immün boyama, optik temizleme ve görüntüleme için son teknoloji prosedürleri betimliyoruz.

Aterosklerozda Aort Dokularının Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Bu protokol, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanılarak kantitatif tam montajlı üç boyutlu vasküler görüntüleme için hızlı bir yöntem sunar. Yöntemin etkinliği, civciv embriyo modelinin faringeal ark arter sistemi kullanılarak, hesaplamalı akışkanlar dinamiği yoluyla ölçülen hemodinamik kuvvetler ile gösterilmiştir.

Kantitatif Çalışmalar için Küçük Hayvan Damar Sisteminin Hızlı Tam Montajlı Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Emici molekül çözeltileri gibi optik temizleme teknikleri, biyolojik görüntülemeyi geliştirmek için ışık saçılımını geçici olarak azaltır ve derine gömülü organlar için biyouyumlu, geri dönüşümlü in vivo görüntüleme stratejileri sunar. Bu protokol, canlı hayvanlarda gerçek zamanlı dinamikler için yüksek kaliteli, dinamik görüntüleme elde etmek için ayrıntılı deneysel prosedürlerin yanı sıra gelişmiş görüntü işleme sunar.

Ex Vivo ve In Vivo Görüntüleme için Emici Moleküller Kullanarak Geçici Optik Temizleme

Bu makalede, motif phosphenic sunumlar indüklenen TMS görsel olarak ilgili devlet bağımlılık etkisini incelemek.

TMS Devlet Bağımlılık Etkileri: Motive Phosphene Davranış Bir Bakış

Bir fare göz diseksiyon resmi bir gösteri, retinal pigment epitel bir bütün montaj.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

Keşfedin 3DISCO doku temizleme yöntemiyle bütün beyin ve omurilikte nöronal bağlantıları görüntülemeyi. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde sinir sistemi bütünlüğünü incelemeye olanak tanır.

Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Daha fazla video keşfet