Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, floresan olarak etiketlenmiş bozulmamış biyolojik örnekleri histolojik kesit almadan görüntülemektir. Bu, tam bir şeffaflık elde edilene kadar sabit dokuların organik çözücüler içinde sıralı inkübasyonu ile elde edilir. İkinci adım olarak.

Saydam dokular lazer tarama mikroskobu kullanılarak 3 boyutlu olarak görüntülenir. Daha sonra, görüntüleme sonuçları analiz edilir ve kesitsiz omurilik ve beyindeki nöronal yapılar, toplanan üç disko görüntüsünden 3D olarak yeniden yapılandırılabilir. Bu yöntem, tüm beyin ve omurilikteki nöronal ve GAL bağlantılarının nasıl haritalandırılacağı ile ilgili sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin etkileri, artık tüm sinir sistemi boyunca nöral bütünlüğü görselleştirebildiğimiz için nörodejenerasyon tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem sinir sisteminin organizasyonu hakkında fikir verebilse de, akciğer veya tümör dokusu gibi diğer organlara da uygulanabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik omurilik veya akciğer gibi küçük organlar için sadece birkaç saat sürer ve beyin için yaklaşık bir veya iki gün sürer Hasat edilen doku başına bir cam şişeye iki ila üç mililitre taze hazırlanmış% 50 THF ekleyerek işleme başlayın.

Daha sonra sabit organları temizleme çözeltisine aktarın ve şişeleri güvenli bir şekilde kapatın. Şişeleri bir döndürücü üzerine yerleştirin ve üzerlerini alüminyum folyo ile kaplayın, numuneleri uygun süre boyunca 30 RPM sabit hızda karıştırın. Daha sonra temizleme solüsyonunu çıkarın ve dokuyu bir sonraki solüsyonda askıya almak için yeni bir PE veya pipet kullanın.

Son temizleme adımı sırasında tabloda belirtildiği gibi, numuneleri çoklu foton veya konfokal mikroskopi için tamamen şeffaf hale gelene kadar çözelti içinde tutun. Tam bir temizleme elde edilir edilmez, numuneyi bu amaçla bir görüntüleme slaytına monte edin. Dokunun etrafında bir sınır oluşturmak için diş çimentosu kullanın.

Diş çimentosu tamamen sertleşmeden hemen önce havuzu son temizleme solüsyonu ile doldurun ve ardından temizlenen numuneyi hemen havuzun ortasına yerleştirin ve üzerini bir kapak camı ile örtün. Kapak camını, diş çimentosu ile tamamen kapatılana ve tam bir temizleme elde edilir edilmez hafif tabaka mikroskobu için temizlenmiş organın yüzeyine dokunana kadar bastırın ve ardından numuneyi sabitlemek için numune tutucunun vidasını manuel olarak çevirin. Daha sonra, numuneyi, görüntülenen doku için uygun olan son temizleme solüsyonu ile doldurulmuş ışık tabakası mikroskobunun görüntüleme odasına daldırın.

Ardından, mikroskobun sağlayabileceği en iyi çözünürlükte tüm temizlenmiş dokuları kapsayan Z taramalarını toplayın ve daha yüksek çözünürlüklü görüntüler toplamak için ilgilenilen bölgeleri yakınlaştırın. Görüntüleri topladıktan sonra, görüntü serisini resolve RT modülü ile Amira yazılımına yükleyin. Seri yüklendiğinde, görüntü okuma parametresi penceresine doğru voksel boyutlarını girin ve Tamam'a tıklayın.

Ardından, çok düzlemli görünüm alt uygulamasını seçin. Ardından, gri değerler için en uygun projeksiyon kalınlığını ve eşiğini seçmek için birincil ve kalınlık kaydırıcılarını kullanın. Son olarak, farklı 3B yönlerde dilimlere göz atmak için kırpma köşesi modülünü kullanın.

Örnekleri görselleştirmek için, Nöronların yapısal organizasyonunu haritalamak, sağlık ve hastalıkta nasıl işlev gördüklerini anlamak için son derece önemlidir. Çeşitli organlarda üç disko kullanılabilirken, omurilik ve beyindeki uzun nöronal bağlantıların izlenmesi için özellikle yararlıdır. Örneğin, büyük temizlenmiş omurilik segmentlerinin ultra mikroskopi taramaları kullanılarak, aksonal bağlantılar, bu görüntülerde gösterildiği gibi kemirgen omuriliğinde santimetreler üzerinden takip edilebilir.

Benzer şekilde, temizlenmiş fare beyninin tamamı ve hipokampus, beyindeki nöronal bağlantıları takip etmek için görüntülenebilir. Konfokal veya çoklu foton mikroskobu kullanıldığında, görüntüleme çözünürlüğü özellikle Z boyutunda önemli ölçüde iyileştirilebilir. Örneğin, GFPM çizgi farelerinden temizlenmiş omuriliklerin çoklu foton görüntülemesi, omuriliğin tüm 1,5 ila iki milimetre derinliği boyunca kesintisiz bir görüntü elde eder.

Temizlenmiş omurilik üzerindeki konfokal mikroskopi, benzer şekilde gelişmiş çözünürlük sağlar. Temizlenmiş beyinlerin çoklu foton mikroskobu görüntülemesi, dendritik dikenler de dahil olmak üzere nöronal yapıların ince ayrıntılarını görselleştirmek için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler sunar. Üç disko için örnekler çeşitli şekillerde etiketlenebilir.

Örneğin, sağlık ve hastalıkta kan beyin bariyerini incelemek için kullanılabilen lektin konjuge floresan izleyiciler kullanarak beynin ve omuriliğin tüm damar sistemini etiketlemek mümkündür. Üç disko kullanılarak büyük dokulardaki daha küçük hücreler de görüntülenebilir. Örneğin, hem mikroglia hem de astrositler, Alzheimer hastalığı ve travmatik yaralanmalar dahil olmak üzere nörodejenerasyon patolojisinde yüksek oranda rol oynar.

Üç disko kullanılarak, omurilikteki yoğunlukları ve dağılımları incelenebilir. Nöronal olmayan dokular da görüntülenebilir. Örneğin, tüm kemirgen akciğerlerindeki Clara hücreleri, antikorlarla immüno-etiketlenebilir ve tek hücre düzeyinde bölünme olmadan görüntülenebilir.

Benzer şekilde, onaylanmamış pankreas dokusundaki hücreleri temizlemek ve görüntülemek mümkündür. Örneğin, floresan olarak işaretlenmiş alfa hücreleri, bu pankreas görüntülerinde temizlendikten sonra görüntülenir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü temizleme ve görüntüleme adımları basit olsa da veri analizi karmaşık olabilir.

Bu prosedürü uygularken, tam şeffaflık elde edilir edilmez şeffaf dokuları görüntülemek önemlidir, çünkü floresan sinyali temizleme solüsyonunda zamanla bozulacaktır. Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların beyindeki nöronal ağların haritalanması gibi ayrıntıları ve sağlam organları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, tüm organlardaki hücresel ve hücre altı yapıların nasıl temizleneceğini ve görüntüleneceğini ve ardından bunları nasıl görselleştireceğinizi ve analiz edeceğinizi iyi anlamalısınız.