Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, histolojik kesit alma işlemi yapmadan floresan işaretli bütün biyolojik örneklerin görüntülenmesidir. Bu, fikse edilmiş dokuların tam bir şeffaflık elde edilene kadar organik çözücülerde ardışık olarak inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak.

Şeffaf dokular, bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak 3B olarak görüntülenir. Ardından, görüntüleme sonuçları analiz edilir ve kesilmemiş omurilik ile beyindeki nöronal yapılar, toplanan üç boyutlu görüntülerden 3B olarak yeniden oluşturulabilir. Bu yöntem, tüm beyin ve omurilikteki nöronal ve GAL bağlantılarının nasıl haritalanacağına dair nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin etkileri, artık tüm sinir sistemi boyunca nöral bütünlüğü görselleştirebildiğimiz için nörodejenerasyon tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem sinir sisteminin organizasyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, akciğer veya tümör dokusu gibi diğer organlara da uygulanabilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik spinal kord veya akciğer gibi küçük organlar için sadece birkaç saat, beyin için ise yaklaşık bir veya iki gün sürer. Prosedüre, hasat edilen doku başına bir cam şişeye iki ila üç mililitre taze hazırlanmış %50 THF ekleyerek başlayın.

Ardından, fikse edilen organları şeffaflaştırma çözeltisine aktarın ve tüplerin kapaklarını sıkıca kapatın. Tüpleri bir rotatöre yerleştirin ve alüminyum folyo ile kaplayarak örnekleri 30 RPM sabit hızda uygun süre boyunca karıştırın. Daha sonra şeffaflaştırma çözeltisini uzaklaştırın ve dokuyu bir sonraki çözeltiye askıya almak için yeni bir PE veya pipet kullanın.

Son şeffaflaştırma adımı sırasında tabloda belirtildiği üzere, çok fotonlu veya konfokal mikroskopi için örnekler tamamen şeffaf hale gelene kadar çözelti içinde tutun. Tam bir şeffaflaşma sağlandığı anda, bu amaçla örneği bir görüntüleme lamı üzerine monte edin. Dokunun etrafına bir sınır oluşturmak için diş hekimi simanı kullanın.

Diş çimentosu tamamen sertleşmeden hemen önce havuzu son berraklaştırma solüsyonu ile doldurun ve ardından berraklaştırılmış örneği derhal havuzun ortasına yerleştirip üzerini bir kapatma lamı ile örtün. Tam berraklaştırma sağlandığında, ışık sayfası mikroskobisi montajı için kapatma lamını, diş çimentosuyla tamamen mühürlenene ve berraklaştırılmış organun yüzeyine değene kadar bastırın ve ardından örneği sabitlemek için örnek tutucunun vidasını manuel olarak çevirin. Son olarak, örneği, görüntülenen dokuya uygun son berraklaştırma solüsyonu ile doldurulmuş ışık sayfası mikroskobunun görüntüleme haznesine daldırın.

Ardından, mikroskobun sağlayabileceği en iyi çözünürlükte, temizlenmiş dokuların tamamını kapsayacak şekilde Z taramaları yapın ve daha yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için ilgi duyulan bölgelere yakınlaşın. Görüntüleri topladıktan sonra, görüntü serisini resolve RT modülü ile Amira yazılımına yükleyin. Seri yüklendiğinde, görüntü okuma parametre penceresine doğru voksel boyutlarını girin ve tamam'a tıklayın.

Ardından, çok düzlemli görünüm alt uygulamasını seçin. Daha sonra, optimum projeksiyon kalınlığını ve gri değerler için eşiği belirlemek amacıyla birincil ve kalınlık sürgülerini kullanın. Son olarak, farklı 3D yönelimlerdeki kesitleri incelemek için kırpma köşesi modülünü kullanın.

Numuneleri görselleştirmek için, nöronların yapısal organizasyonunun haritalandırılması, sağlıklı durumlarda ve hastalıklarda nasıl işlediklerini anlamak açısından son derece önemlidir. Üç boyutlu görüntüleme çeşitli organlarda uygulanabilse de, özellikle omurilik ve beyindeki uzun nöronal bağlantıların izlenmesinde oldukça kullanışlıdır. Örneğin, büyük temizlenmiş omurilik segmentlerinin ultra mikroskopi taramaları kullanılarak, bu görüntülerde örneklendiği gibi kemirgen omuriliğindeki aksonal bağlantılar santimetrelerce boyunca takip edilebilir.

Benzer şekilde, beyindeki nöronal bağlantıları takip etmek için şeffaflaştırılmış fare beyninin ve hipokampüsün tamamı görüntülenebilir. Konfokal veya çok fotonlu mikroskopi kullanıldığında, görüntüleme çözünürlüğü, özellikle Z boyutunda önemli ölçüde artırılabilir. Örneğin, GFPM hattı farelerinden alınan şeffaflaştırılmış omuriliklerin çok fotonlu görüntülemesi, omuriliğin 1.5 ile iki milimetrelik toplam derinliği boyunca kesintisiz bir görüntü sağlar.

Şeffaflaştırılmış omurilik üzerinde uygulanan konfokal mikroskopi, benzer bir şekilde geliştirilmiş çözünürlük sağlar. Şeffaflaştırılmış beyinlerin çok fotonlu mikroskopi görüntülemesi, dendritik dikenler dahil olmak üzere nöronal yapıların ince detaylarını görselleştirmek için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler sunar. Three disco örnekleri çeşitli yollarla işaretlenebilir.

Örneğin, sağlıklı durumlarda ve hastalıklarda kan-beyin bariyerini incelemek için kullanılabilen lektin konjuge floresan izleyiciler yardımıyla beyin ve omuriliğin tüm vaskülatürünü etiketlemek mümkündür. Üç boyutlu görüntüleme yöntemleri kullanılarak büyük dokulardaki daha küçük hücreler de görüntülenebilir. Örneğin, hem mikroglia hem de astrositler; Alzheimer hastalığı ve travmatik yaralanmalar dahil olmak üzere nörodejenerasyon patolojisinde yüksek düzeyde rol oynamaktadır.

Üç disk kullanılarak, bunların omurilikteki yoğunluğu ve dağılımı incelenebilir. Nöronal olmayan dokular da görüntülenebilir. Örneğin, kemirgen akciğerlerinin tamamındaki Clara hücreleri antikorlarla immün olarak işaretlenebilir ve kesit alınmadan tek hücre düzeyinde görüntülenebilir.

Benzer şekilde, parçalanmamış pankreas dokusunda hücrelerin şeffaflaştırılması ve görüntülenmesi mümkündür. Örneğin, bu pankreas görüntülerinde, şeffaflaştırma işleminin ardından floresan işaretli alfa hücreleri görüntülenmiştir. Şeffaflaştırma ve görüntüleme adımları basit olsa da veri analizi karmaşık olabildiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir.

Bu prosedür uygulanırken, floresan sinyali şeffaflaştırma solüsyonu içinde zamanla azalacağı için, tam şeffaflık elde edilir edilmez temizlenmiş dokuların görüntülenmesi önemlidir. Bu tekniğin geliştirilmesi, beyindeki nöronal ağların haritalanması gibi, araştırmacıların detayları ve bütün halindeki organları incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, tüm organlardaki hücresel ve hücre altı yapıların nasıl şeffaflaştırılacağı ve görüntüleneceği, ardından bunların nasıl görselleştirilip analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.