Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

Aşağıdaki deneyin genel amacı; biyokatman interferometrisi (BLI) kullanarak protein kinetiğini, protein etkileşimlerini ve küçük ligandların bu etkileşimler üzerindeki allosterik etkilerini ölçmektir. Bu işlem, proteinlerden birinin spesifik biotin ile hazırlanması ve paralel olarak streptavidin kaplı biyosensörlerin yüzeyine immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci adım olarak, sensöre bağlı protein, bağlanma partnerini içeren bir tampona maruz bırakılır ve bağlanma, sensör yüzeyindeki optik girişim üzerindeki etkisi aracılığıyla gerçek zamanlı olarak ölçülür. Ardından, proteinin gerçek zamanlı disosiyasyonunu ölçmek için her sensör, bağlanma partnerini içermeyen bir tampona aktarılır. Protein kompleksleri.

Elde edilen sonuçlar, etkileşime giren proteinlerin bağlanma ve ayrılma kinetik hız sabitlerinin ve dolayısıyla bağlanma afinitelerinin belirlenmesine olanak tanır. Diğer sonuçlar ise, BLI'nın küçük ligandların protein-protein kompleksinin ayrılma hızı üzerindeki etkilerini saptayabildiğini göstermektedir. Bu tekniğin yüzey plazmon rezonansı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, BLI'nın kırılma indisi değişikliklerine karşı aşırı hassas olmamasıdır.

Böylece bağlanma ve ilişkilendirme basamakları, küçük ligandlardaki değişiklikleri içererek bunların protein-protein etkileşimleri üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak test etmeyi sağlayabilir. Bunun yanı sıra, bu yöntem protein-protein etkileşiminin kinetiği hakkında bilgiler sunabilir. Ayrıca, proteinin immobilize DNA veya RNA'ya bağlanması veya liposomun immobilize bir proteine bağlanması gibi farklı kombinasyonlar için de uygulanabilir. Bu deneye, BLI cihazını metin protokolünde açıklandığı şekilde kurarak başlayın.

Ardından, veri toplama yazılımında deneysel tasarımı kurun. Deney sihirbazı sekmesinde yeni kinetik deneyini seçin. Bu işlem, birinci sekmede tanımlanması gereken tüm adımları içeren sekmeli bir menü sunar.

Kullanılacak sütunları belirleyin. 96 kuyucuklu örnek plakası üzerinde; tampon çözelti, immobilize edilecek protein veya bağlanma ortağı için sütunlar atayın.

Her bir etkileşim için, kullanılacak bağlanma partnerinin konsantrasyonunu girin. İkinci sekmede, analiz için gereken tüm adımları tanımlayın. Bunlar; baz çizgisi yüklemesi, bağlanma partnerinin asosiyasyonu ve disosiyasyonunu içerir.

Analiz adımı seçilip ardından ilgili sütuna çift tıklanarak, münferit analiz adımları örnek plakasındaki kuyucuk sütunlarıyla ilişkilendirilir. Bu işlem, sensörlerin bir kuyucuk sütunundan bir sonrakine taşınmasını programlar. Analiz sırasında, 96 kuyucuklu plakada başlangıç BLI sinyallerini oluşturmak için analiz tamponu ile ilk kuyucuk sütununa bağlı kısa bir bazal adım ile başlayın.

Ardından, yükleme adımını biotinillenmiş proteini içerecek kuyucuklara bağlayın. Önceden belirlenmiş bir bağlanma düzeyine ulaşmak için eşik fonksiyonunu kullanın. Tüm sensörlerin bir sonraki kuyucuk sütununa taşınması için eşik seçeneğini ayarlayın.

Sensörlerden herhangi biri eşik değere ulaştığında, sensörlerde immobilize olmamış biyotinli proteinleri uzaklaştırmak için tampon içerisinde başka bir bazal adım ekleyin ve genel bağlanma ile ayrışma hız sabitlerini belirlemeye yönelik temel analizler için yeni kararlı bazal sinyaller oluşturun; birliktelik aşamasından önce, sensörlerin yeni bir tampon kuyucuk sütununda bulunduğu ek bir bazal adım ekleyin. Bir sonraki adımda, birliktelik adımını, bağlanma partnerinin farklı konsantrasyonlarını içeren kuyucuk sütununa bağlayın.

Adım süresini, bağlanan partnerin en az doyurucu bir konsantrasyonunun denge bağlanma sinyaline ulaşacağı şekilde ayarlayın. Disosiyasyon adımı için, sensörleri asosiya öncesi ekstra bazal çizgi için kullanılan aynı tampon kuyucukları olan dördüncü kolona dönecek şekilde belirleyin. Asosiya ve disosiyasyon adımlarının süreleri, hızların beklenenden daha yavaş veya daha hızlı olması durumunda deney sırasında ayarlanabilir.

Üçüncü sekmede, analiz için önceden ıslatılmış sensörlerin bulunacağı sensör tepsisi konumlarını belirtin. Dördüncü sekme, programın grafiksel olarak gözden geçirilmesine olanak tanır. Beşinci sekmede, veri dosyalarının konumu ve istenen sıcaklık dahil olmak üzere gerekli ayrıntıları girin.

Deney için streptavidin kaplı sensörleri en az 10 dakika ön ıslatın. Koruyucu sükroz kaplamayı uzaklaştırmak için, sensörleri içeren rafı sensör tepsisinden çıkarın ve 96 kuyucuklu plakayı, bir köşesini tepsideki yönlendirme çentiğine kaydırarak tepsinin altına yerleştirin.

Kullanılacak sensör sütunu için her kuyucuğa 200 µL assay tamponu ekleyin. 96 kuyucuklu plakanın söz konusu sütununda, sensör rafını programlama sırasında belirlenen doğru yönelimde tepsiye yerleştirin; numune plakasının kuyucuklarını assay tamponu veya uygun protein dilüsyonları ile doldurun. Optik sinyalde gürültüye neden olabileceği için hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

Biyotinline proteinin veya bağlanma partnerinin eksik olduğu bir veya daha fazla referans kuyucuğu ekleyin. Cihazın kapağını açın ve sensör kolundan gelen ışık çıkışını not edin. Sensör tepsisini, tepsi sekmeleri sahnenin yuvalarına oturacak şekilde sahneye yerleştirin.

Numune plağını plaka tutucuya yerleştirin. Plağın, plaka tutucuda belirtildiği şekilde düzgünce oturduğundan ve doğru yönde olduğundan emin olun. Kapıyı kapatın ve veri toplama programı üzerinden analizi başlatın.

Sensörlerin hala ön ıslatma gerektirmesi durumunda, deneyin başlatılmasını geciktirme seçeneğini belirleyin. Son olarak, tüm numune hazırlama işlemleri tamamlandığında ve hem numune plakası hem de sensör tepsisi cihaza yerleştirildiğinde, analizi çalıştırmak için "go" düğmesine tıklayın. Analiz tamamlandıktan sonra veri analiz yazılımını açın ve verileri içeren klasörü yükleyin.

Adım adım işlem menüsünü ve veri seçimi altında her bir sensöre farklı bir rengin atandığı ham kinetik verileri görmek için işlem sekmesine tıklayın. Örnek plaka haritasındaki sensör seçim düğmesine tıklayın. İşlem menüsünden bir veya iki kontrol sensörü için kuyucukları referans kuyucuklar olarak belirleyin.

Çıkarma kutusunu işaretleyin ve referans sinyalini diğer tüm sensörlerin sinyalinden çıkarmak için referans kuyucuklarını seçin. Y eksenini hizala adımını kullanarak tüm izleri Y eşittir sıfıra hizalayın. Ardından, zaman aralığı için hizalama adımı olarak temel çizgiyi seçin.

Bu bazal çizginin son 10 saniyesini girin. Bazal çizgi adımına tıklamak hizalamayı gösterecektir. Ardından, birliktelik ve ayrılma adımları arasındaki sinyal kaymalarını en aza indirmek için adımlar arası düzeltme kutusunu işaretleyin.

Baz hattı veya disosiyasyon için bir çizgi seçin. Çoğu durumda KY gole filtreleme işlevini seçin ve devam etmek için veri işle (process data) düğmesine tıklayarak nihai işlenmiş verileri sağ alt panelde görsel olarak inceleyin. Verileri analiz etmek için, analiz edilecek adımı veri analizi kısmındaki analiz sekmesinden tıklayın, asosiyasyon ve disosiyasyonu seçin.

Model için, uyumlandırma amacıyla "one to one" seçeneğini belirleyin ve "global" seçeneğini seçin. "Group by" için "color" seçeneğini seçin; partnerin immobilize edilmiş proteine doygun bağlanması durumundaki maksimum sinyal yanıtının bağımsız olarak uyumlandırılmasına izin vermek için "r max unlinked by sensor" seçeneğini belirleyin. Son olarak, doğrusal olmayan regresyon analizini başlatmak için "fit curves" düğmesine tıklayın.

Regresyon eğrilerinin sensör veri izleri üzerine bindirilmesini, uyum artıklarının grafiklerini ve belirlenen parametre değerleri ile istatistikleri içeren tabloyu kapsayan uyum sonuçlarını inceleyin. Burada gerçek zamanlı bağlanma ve ayrılma BLI kinetikleri gösterilmektedir. Sensörler daha önce kısaca ıslatıldığı için bu deney 10 dakikalık bir baz hattı adımıyla başlatılmış, ardından sensörlere biotinillenmiş epsilon yüklenmiştir.

Bağlanma partneri eklenmeyen referans eğrisinden görüldüğü üzere, geri kalan tüm adımlar boyunca epsilon'da tespit edilebilir bir disosiyasyon meydana gelmemiştir. İkinci bir referans sensör mobilize edilmiş bir proteinden yoksundu ve bağlanma partnerinin düşük düzeyde spesifik olmayan bağlanmasını göstermiştir. Sonuçları küresel olarak uydurmak ve birliktelik hız sabiti ile denge disosiyasyon sabiti KD için en iyi değerleri elde etmek amacıyla, A'dan F'ye kadar olan sensörlerin birliktelik adımında çeşitli konsantrasyonlarda epsilon eksiltilmiş F1 kullanılmıştır; sonuçlar işlenmiş ve mavi veri izleri elde edilmiştir.

Bu çalışmada, bağlanma partnerinin spesifik olmayan bağlanmasını ve sistem sinyal kaymasını düzeltmek için referans sensör izi örnek izlerinden çıkarılmıştır. Veri analiz aşamasında, tüm eğriler bire bir (one-to-one) model ile global olarak fit edilmiştir. Global fit, bağlanma partnerinin tamamen ayrıştığını varsayar.

Burada, enzimin 1 mM ATP$\gamma$S varlığında sensöre immobilize edilmiş epsilon'a bağlandığı farklı bir deney gösterilmektedir. Bu durum, çoğu F1 epsilon kompleksinin, kolayca ayrışan inhibe edici olmayan konformasyonu almasını sağlar; ardından sensörler, farklı ligandlar içeren analiz tamponu bulunan ayrışma kuyucuklarına taşınmıştır. Bu durum, farklı ligandların epsilon konformasyonu üzerindeki etkilerini göstermektedir.

Örneğin, magnezyum A GP ve fosfata maruz kalma, net disosiyasyonu önemli ölçüde yavaşlatarak epsilon'un konformasyonunu sıkıca bağlı inhibitör duruma kaydırdığını göstermiştir. BLI deneyleri ilk kez kurulurken, proteinlerin sensörlere spesifik olmayan bağlanmasını ve spesifik olmayan bağlanmanın kullanılacak protein konsantrasyonlarına göre önemli ölçüde değişip değişmediğini test etmek için kontrollerin eklenmesi önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, protein-protein etkileşimlerinin kinetiğini ölçmek için BLI deneylerinin nasıl tasarlanacağı, programlanacağı ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalı ve bunun önemini kavramalısınız.

BLI, küçük ligandların protein-protein etkileşimleri üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine olanak tanır.