Name: Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 57 s
Description: Öğrenin, protein-protein etkileşimlerinin kinetiğini ve allosterik ligand etkilerini Bio-layer Interferometry ile nasıl ölçeceğinizi. F-tipi ATP sentaz ve ε alt birimi kullanılarak gerçek zamanlı bağlanma ve ayrışma analizi yapılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu, Şekil 1 &#39;de kullanılan grafik sağlamak için FortéBio ederiz. Bu çalışma TMD NIH hibe GM083088 tarafından desteklenen

<html> 1.. BLI Testi için Enstrüman Programlama Lamba ısınmak için izin önceden enstrümanın en az bir saat açın, bu gürültü en aza indirmek ve deney sırasında optik sinyal kayması gereklidir. Numune plaka tutucu prewarm için enstrüman sekmesi aracılığıyla İstediğiniz sıcaklığı ayarlayın. Sonra Veri Toplama yazılımı deney tasarımı kurmak. Deney Sihirbazı sekmesinde &quot;Yeni Kinetik Experiment&quot; seçeneğini seçin. Bu tanımlanmış olması gereken tüm adımları ile bir sekmeli menü sunuyor. 1.1. Plaka Tanımlama 96 oyuklu numune plakası üzerinde kullanılmak üzere sütunları tanımlar. Tampon hareketsizleştirilmiş protein ya da bağlanma partneri dahil etmek için sütun atama. Her oyuğa federasyonu için kullanılacak ortak bağlanma konsantrasyonunu girin. Not: Şekil 2&#39;de gösterilen plaka tanımı farklı deneyleri için seçenekler vardır. 1.2. Tahlil Tanımı ontent &quot;&gt; tahlili için gerekli tüm adımları tanımlamak için kullanılır. bunlar (i) Temeli (birkaç), (ii) yükleme, (iii) Association ve bağlanma partneri (iv) ayırma yer alır. Daha sonra, aşağıda tarif edildiği gibi, bireysel adımları deney bağlantı ilgili sütunda deney aşamasını ve daha sonra çift tıklayarak seçerek numune levha üzerindeki kuyu sütunlar. bu programlar, sensörler, tahlil sırasında sonraki kuyu bir sütundan taşınacak. <ol><li> Baseline 96 oyuklu bir plaka içerisinde, ilk BLI sinyalleri oluşturmak için, deney tamponu içerisinde sensör (Şekil 2, sütun 1) ile, bir kısa temel aşama (≥ 60 saniye) ile başlayın. </li><li> (Sensörler biyotinilatlı proteini hareketsizleştirir) Loading Biyotinile protein (Şekil 2, sütun 2) içerir çukurlara sensörleri atama. Bir bağlanma önceden belirlenmiş bir düzeye (bkz) elde etmek için eşik işlevini kullanın. Tüm sensörler hareket olacak şekilde eşik seçeneğini ayarlayınsensörlerden herhangi biri eşiğine ulaştığında kuyuların sonraki sütuna d. </li><li> Baseline Sensörlerin uzak sabitlenmemiş biyotinile edilmiş proteinler yıkama ve yeni, dengeli başlangıç ​​sinyalleri oluşturmak için tampon maddesi içinde bir başlangıç ​​adımı (tipik olarak&gt; 5 dakika Şekil 2, sütun 3) içerir. Sadece (Şekil 3&#39;te olduğu gibi) temel bağlanma / ayrılma tahlilleri için, Association aşamasından önce tampon yeni kuyu sensörlerle fazladan bir başlangıç ​​aşamasını (60 sn) (Şekil 2, sütun 4) içerir. </li><li> (Hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​bağlanma partnerinin) Association (Şekil 3&#39;te olduğu gibi) temel bir bağlayıcı / ayrılma deneyi için, farklı sensörler / kuyu için kullanılacak bağlanma partnerinin konsantrasyonları bir dizi (Şekil 2, sütun 5) seçin. Bağlanma partnerinin en az bir doyma konsantrasyonu, sinyal bağlama denge yaklaşım gerekir, böylece adım zaman ayarlayın. Bir için(Şekil 5 &#39;de olduğu gibi) protein-protein kompleksinin ayrışma küçük ligandlann allosterik etkilerini test etmek için deney, her bir ilişki kuyularda kullanım için (10-kat tahmini K D yukarıda ~) bağlanma partnerinin, tek bir yüksek konsantrasyonu seçin. </li><li> (Bağlanma partnerinin) Ayrışma Sadece (Şekil 3&#39;te olduğu gibi) temel bir bağlama / ayırma deneyi için, sütun 4 (Şekil 2), esas önce ilave taban için kullanılan ile aynı tampon oyuklara dönmek için algılayıcıları. Küçük ligandların allosterik etkilerini test etmek için bir deney için, bunun yerine, 6. sütun her bir oyuğa tamponu artı farklı allosterik ligandları ihtiva edebilir (Şekil 2), geçmek için algılayıcıları. </li></ol> 1.3. Sensör Atama Deney için önceden silinmiş sensörleri içerir sensör tepsisine yerleri gösterir. Deneme FAI beri herhangi bir boş pozisyonları tespitBen hiçbir sensörler aldı eğer. 1.4. İnceleme Deneme Hataları denetlemek ve bunları düzeltmek için geri gitmek için planlanan tüm adımları gözünüzde canlandırın. 1.5. Denemeyi çalıştırın Veri dosyalarının konumu da dahil olmak üzere gerekli ayrıntıları girin. Deney için istenilen sıcaklığa girin. Sensörleri hala Önnemlendirme gerektiriyorsa, deney başlamadan geciktirmek için seçeneği seçin. Son olarak, bir kez tüm numune hazırlama (adım 2) tamamlandı ve numune plaka ve sensör tepsi hem enstrüman yüklenir, tahlil çalıştırmak için Git düğmesini tıklatın. 2. Numune Hazırlama <ol><li> Uygun bir deney tamponu hazırlayın. (8.0 &#39;a pH değerinin ayarlanması için ilave edildi) - ((N-morfolino) propansülfonik asit 3), Tris (Tris (hidroksimetil) amino-metan), 50 mM KCI, 20 mM MOPS: Tampon, Şekil 3 ve 5&#39;te gösterilen deneyler için kullanılır. BSA (sığır serum albumin, yağlı asitsiz, 0.5 DahilTüm deney adımlar için ve biyotinile protein veya sensörlere proteinlerin spesifik olmayan bağlanma en aza indirmek için bağlanma partnerinin tüm seyreltileri için tampon maddesi içinde) son mg / ml. </li><li> (Bkz) uygun bir konsantrasyona kadar deney tamponu içerisinde biyotinile protein (ε) seyreltin. </li><li> Deney tamponu içinde bağlanma partner (F 1 (ε-)) (kullanmak için konsantrasyonlarının aralığı için tartışma bakınız) seyreltim dizileri hazırla. </li><li> Koruyucu kaplama sükroz çıkarmak için en az 10 dakika boyunca streptavidin kaplı sensörleri ön ıslatılmış. Sensör tepsiden sensör içeren raf çıkarın ve tepsinin üzerindeki yönlendirme çentiğe plakanın bir köşesini kayar, tepsinin dibinde bir 96-plaka takın. Sensörlerin kolon kullanılması için, 96 oyuklu plakanın bu sütunda oyuk başına deney tamponu içinde 200 ul ekleyin. (Yuvaları ile sekmeleri) doğru yönde tepsiye sensörlerin raf dönün. </li><li> Adım 1 programlama sırasında atanan, o kuyuları doldurmakŞekil 2&#39;de olduğu gibi, deney tamponu ya da uygun protein seyreltileri f numune plakası. Onlar optik sinyal gürültü neden olabilir, kabarcıkları tanıtan kaçının. (I) biyotinile protein ya da (ii) bağlanma partneri ya da ihmal bir veya daha fazla kuyu bir referans içerir. </li><li> Enstrümanın kapağını açın ve sahnenin yuvalarına takılı tepsinin sekmeleri ile, sahnede (sol) üzerine sensör tepsisini yerleştirin. Plaka tutucu (sağda) örnek plaka yerleştirin; plaka sahibi belirtildiği gibi plaka, düz ve doğru yönde oturduğundan emin olun. Kapıyı kapatın ve Veri Toplama programı (adım 1.5) den deneyi başlar. </li></ol> 3. Veri İşleme <ol><li> Tahlil çalıştırmak sonra, Veri Analizi yazılımı açın ve verileri içeren klasörü yükleyebilirsiniz. Her bir sensör ile, (solda) bir adım bilge İşleme menüsünü ve ham kinetik verileri görmek için &quot;İşleme&quot; sekmesine tıklayın (AH), farklı bir renk atanır (bkz.Şekil 3). </li><li> &quot;Veri Seçimi&quot; altında, &quot;Sensör Seçimi&quot; düğmesine tıklayın. &quot;Örnek Plate&quot; Harita üzerinde, referans kuyu gibi 1 ya da 2 kontrol sensör (G, Şekil 3&#39;ün deneyde H) için kuyu işaret etmektedir. İşleme menüsünde, &quot;Çıkarma&quot; kutusunu işaretleyin ve diğer her sensörün sinyal referans sinyalini (tek ya da ortalama) çıkarma &quot;Referans Wells&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Hizala Y Ekseni&quot; adımı kullanarak = 0 Y tüm izlerini hizalayın. Hizalama adım (bu Association adımdan önce son temel varlık) olarak &quot;Temeli&quot; seçeneğini seçin. &quot;Zaman Aralığı&quot; için, bu başlangıca (Şekil 3 gibi bir 60-saniye başlangıç ​​için, yani 50-60 sn) ve son 10 sn girin. </li><li> Derneği ve ayrışma adımlar arasında sinyal vardiya en aza indirmek için &quot;Inter-adım Düzeltme&quot; kutucuğunu işaretleyin. Baseline veya Ayrışma align seçin. </li><li> Çoğu durumda Savitzky-Golay filtreleme işlevini seçiniz ve tıklayınız &quot;Süreç Veri!&quot; devam etmek. Gözle kontrolson işlenen veriler (alt sağ panel). Sinyal izleri Derneği ve ayrışma adımlar arasında önemli bir değişim gösteriyorsa, (Şekil 4 gibi) global veri analizi için tasarlanan deneyleri ile, &quot;Inter-adım Düzeltme&quot; için Ayrışma veya Baseline seçimini değiştirmek ve Veri geçmeden önce veri işleyemeyiz Analiz. </li></ol> 4. Veri Analizi Başlamak için Veri Analizi &quot;Analiz&quot; sekmesini tıklayın. Not: Örnek birden fazla bağlayıcı / ayrılma eğrileri genel analizi için (Şekil 3 &#39;de olduğu gibi) aşağıda adımları tekrarlayın. <ol><li> &quot;Analiz Adım&quot; için, birleşme ve ayrılma seçin. &quot;Model&quot; için, 1:01 seçin. Not: diğer sınırlı seçenekleri mevcuttur. </li><li> &quot;Montaj&quot; için, (Full) Küresel seçin. &quot;By Group&quot; için (grafiğin yanı) Renk seçin. (R max bağımsız takılmasını sağlamak için &quot;Sensör tarafından Unlinked R max&quot; seçiniz par bağlayıcı doyurarak üzerine maksimum sinyal tepkisi) hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​tner. Not: sensörler hareketsiz protein miktarı biraz farklı olarak biz (Şekil 3, Yükleniyor bakınız), en deneyleri için bunu yapmak. </li><li> Gösterilen masanın üzerinde, analiz edilecek tüm sensör izleri aynı renk var, bu yüzden küresel olarak analiz edilecektir emin olun. Gerekirse, bir veya birden fazla sensör küresel uymasından atlarsanız izleri seçin: &quot;Dahil&quot; sütununda, istenen sensör pozisyonunda sağ tıklayın ve &quot;Wells dışla&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Fit Curves!&quot; Tıklayın doğrusal olmayan regresyon analizi başlatın. (Şekil 4 gibi) sensör veri izleri ile regresyon eğrileri (i) bindirme, montaj artıklar (ii) araziler ve kararlı bir parametre değerleri (oran sabitleri, R max ile (iii) bir tablo eklemek uydurma sonuçlarını incelemek, K D) ve istatistik parametreler için (standart hatalar, Ki-kare, R 2). </li><li> &quot;Veri Aktarma&quot; başlığı altında, &quot;İhracat Tablo için. Csv File&quot; tıklayarak uydurma sonuçları kaydedin. Grap içinhing veya diğer yazılımı ile veri / donatılmış eğriler daha fazla analiz, bir metin dosyasındaki her sensörün verilerini ve donatılmış eğrisi kaydetmek için &quot;İhracat Montaj Sonuçlar&quot; butonuna tıklayınız. </li></ol>

<ol><li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li>
<li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li>
<li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li>
<li>Duncan, T. M. The Enzymes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuncan%2C+TM+%22Energy+Coupling+and+Molecular+Motors+Vol%22">Energy Coupling and Molecular Motors Vol</a>. Hackney, D. D., Tamanoi, F. XXIII, Elsevier Academic Press. 203-275 (2004).</li>
<li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+subunit+%CE%B5+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li>
<li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+%28F1%29+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li>
<li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+40+years%2C+new+medicine+for+combating+TB%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mycobacteriol%22%5BJournal%5D)">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li>
<li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F1-ATPase+of+Escherichia+coli%3A+The+%CF%B5-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis%2C+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state%2C+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li>
<li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -x, Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor%3A+glycosylation%2C+trafficking%2C+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li>
<li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li>
<li>Tsao, K. -L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific%2C+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li>
<li>Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDayne%2C+D+%22Fort%C3%A9Bio+newsletter+In+Interactions%22">FortéBio newsletter In Interactions</a>. 5, 8-9 (2012).</li>
<li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Aided+Mol.+Des%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, Çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

BLI için şu anda mevcut araçlar biyomoleküler etkileşimler için deneylerinde önemli verim ve esnekliğe izin verir. Çeşitli çözelti örnekleri siyah mikrotitre levhasının küvetleri içerisinde dağıtılır ve paralel BLI sensörler bir dizi tabağın kuyu sütunlar arasında ileri ve geri hareket ettirmek için programlanmıştır. Numuneler tahlil boyunca orbital çalkalama ile karıştırılır. Burada kullanılan sistem 8 sensörleri ve 96 oyuklu bir plaka örnek kullanır, ancak başka bir sistem 16, bir sensör ve 384-kuyucuklu plaka örneği ...

Protein-protein etkileşimleri, birçok biyolojik sürecin önemli olan ve yüzey plazmon rezonansı (SPR) gibi etiket içermeyen optik yöntemler 1 bağlanması ve ayrışma kinetikleri incelemek için in vitro olarak kullanılmıştır. Çoğu etiket içermeyen yöntemleri, sensor yüzeyi üzerine hareketsiz bir biyomolekülün ve hareketsizleştirilmiş biyomolekülün 1 ile ilişkilendiren olarak çözeltiden bir bağlanma partneri tespit etmek için bir optik sinyal kullanır. SPR, son derece hassas bir yöntem olmasına rağmen, bunun nedeni sensörün 2 üzerinde akan solüsyonun kırılma endeksi değişikliklere girişime maruz kalır. SPR, Bio-katmanlı interferometrisi (BLI) gibi duyarlı değil az numune bileşiminde 1,3 değişikliklerden etkilenir rağmen. BLI ucunda özel bir biyouyumlu kaplamaya sahip fiber optik biyohissedicilerin kullanır. (Sekizli-RED96) Burada kullanılan sistemi sekiz spektrofotmetrelere içerir. Beyaz ışık bir robot kol hareket prob bir satıra taşınıyor. Fiber optik sensörler are problar tarafından yakalandı ve numuneleri ihtiva eden 96 oyuklu bir plakaya taşınır. Hedef moleküllerin bir biyoalgılayıcı yüzey üzerinde immobilize edilir. Daha sonra sensör çözelti içinde bağlanma ortağı ihtiva eden oyuklara taşınır. BLI hareketsizleştirilmiş molekül ile bağlanma partnerinin ilişki izler ve daha sonra bağlanma partneri olmadan çözeltisine hareket sensörleri sonra ayrışma izler. Biyosensör yüzeyine moleküllerin bağlayıcı bir iç yüzeyinden ve sensör ve çözüm arasındaki dış arayüzünden geri Spektrofotometrelerin yansımadı ışık dalgaları arasındaki optik girişime değişikliklere yol açar. Girişim bu değişiklikler, miktarı ve Şekil 1 &#39;deki animasyon özetlendiği gibi, bağlayıcı ve ayrışma kinetik oranlarını belirlemek için kullanılabilir. Biz katalitik bakteriyel ATP sentaz kompleksi ve enzim oto-inhibe olabilir onun ε alt birimi arasındaki etkileşimleri ölçmek için BLI uyguladık. ATP synthase sentezi ve ATP 4 hidrolizini katalize eden bir zara gömülü döner nanomotor olduğunu. Katalitik kompleksi (F 1), bir ATPaz olarak çalışan bir çözünür bir biçimde izole edilebilir. Alt-birim ε iki etki var N-terminal alanı (NTD) doğru montaj ve enzimin işlevsel bağlanması için gerekli olan ancak katalitik alt birimleri ile doğrudan etkileşim değildir, C-terminal sahası (CTD) ile etkileşerek enzimi inhibe Birden fazla alt birimler katalitik 5,6. Bu, ε-aracılı düzenleme bakteri ATP sentaz özgüdür ve mitokondriyal homologunun gözlenmemektedir. Ilaca dirençli tüberküloz 7 tedavisinde bedaquiline son zamanlarda FDA onayı ile gösterildiği gibi, ATP sintaz, antibakteriyel ilaçlar için bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. Böylece, ilaç keşfi için ε inhibitör rolünü hedef mitokondriyal ATP sentezini inhibe yok antibakteriellerle verim verebilecek. İzole edilmiş katalitik kompleksi (F 1), ile, εçözünmeyen bir alt birim olur. Bununla birlikte, F 1 bağlanmıştır ε ile εCTD kısmen enzimin orta boşluk içine sokulması ve doğrudan doğruya 6,8 ayırmak mümkün olan önleyici durumunu oluşturan, dramatik bir konformasyonel değişikliği tabi olabilir. Biz katalitik site ε en konformasyonuna ligandları allosterik etkilerini incelemek için, dolaylı olarak F 1 / ε bağlanma ve ayrışma kinetiği ölçmek ve BLI kullanın. Sistemimizde, ε (SPR) gibi BLI sinyal yana algılayıcı yüzeyi üzerinde hareketsiz hale getirmek için seçildi yüzeyinde bağlayıcı moleküllerin kütlesinin duyarlıdır. Ε alt birim ana F 1 kompleksi (~ 347 kDa), küçük (~ 15 kDa) görecelidir. Bu nedenle, daha büyük bir BLI sinyal hareketsizleştirilmiş ε, F 1 bağlanmasını ortaya çıkar. Çok yavaş olabilir F 1 ayrışma, izleme amacıyla, ε güçlü hareketsiz olması gerekir. Böylece biotinylate seçtiVe streptavidin kaplı biyosensör üzerinde hareketsiz. Proteinler yüzey lisin 9 (i) rastgele modifikasyon, bir biotin-maleimid maddesi 10 ya da (iii) genetik olarak enzimatik sırasında biyotinile belirli bir biotin-peptidi alıcı ekleme ile eşsiz bir yerel veya tasarlanmış sistein (ii) reaksiyonu ile biyotinile edilebilir etiketli proteinin 11 in vivo ifadesi. Sistemimizde, ε yöntem (iii) 8 kullanılarak biyotinile edilir. Biotin-etiketli streptavidin ε sensör üzerinde immobilize olduğu zaman, BLI bağlanması ve alt-birimi ε (F 1 (ε-)) içinde tükendiği F 1 ayrışımı ölçebilen. Burada tarif edilen deneyler için, ön deneyler sensörleri hareketsiz hale getirmek için biotinlenmiş proteinin uygun miktarlarının tespiti için yapılmıştı. Bu, proteinin molekül ağırlığı ve bağlanma partneri üzerinde bağlı olarak değişebilir, ancak hedef hareketsiz protein t az miktarda tespit etmektirhat içerir (i) olarak uygun bir sinyal-gürültü a (K D aşağıda) bağlanma partnerinin düşük konsantrasyonu ve bağlanma partnerinin yakın doyurulması konsantrasyonu ile kinetik bağlanmasının (ii) en az bozulmayla kinetik bağlanma için. Ayrıca, biyotinilasyon stokiyometrisi tutarlı BLI sinyali streptavidin kaplı üzerinde hareketsizleştirilmesi sırasında elde edilebileceğini teyit etmek için değişebilir (ancak&gt; 1 biyotin mol / mol protein önlemek), bu deney, bir ilk biyotinile edilmiş proteinin her yeni yeri için gerekli olabilir sensörler.

<table><tbody><tr><td>Sekizli-RED96</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td>Yağ Asidi İçermeyen</td></tr><tr><td>Biyosensör/Streptavidin</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>18-5019</td><td>96 sensörlü tepsi</td></tr><tr><td>Mikrotitre plakası</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td>Siyah,</td></tr><tr><td>Polipropilen Veri Toplama yazılımı</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Sürüm 6.4</td><td>Daha yeni sürümler mevcut</td></tr><tr><td>Veri Analiz yazılımı</td><td>Pall/Fort&eacute; Bio</td><td>Sürüm 6.4</td><td>Daha yeni sürümler mevcut</td></tr></tbody></table>

protein-protein etkileşimleri ve allosterik ligand etkileri kinetiği Ölçüm bio-katman interferometri

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Biz, Escherichia coli ATP sintaz katalitik alt birim kompleksi ile ε önleyici etkileşimleri incelemek için Bio-interferometrisi tabaka kullanılmasını tarif eder. Bakteriyel F-tipi ATP sentaz ilaca dirençli tüberküloz mücadele için yeni bir FDA onaylı antibiyotik hedefidir. Alt birim ε C-terminal alanı ile ATP sintaz anlama bakteri spesifik oto-inhibisyon antibakteriyel ilaçların keşfi için enzim hedef için yeni bir yöntem sağlayabilir. Ε ait C-terminal alanı, aktif ve aktif olmayan durumlar ve katalitik site ligandlar arasındaki geçişler enzim baskın olduğu ε en konformasyonlarının hangi etkileyebilir dramatik bir konformasyonel değişime uğrar. Ε dolaylı olarak bir bağlayıcı / katalitik kompleksi ile ayrışma ve mea ait deney, kinetiksureler görünüşte nondissociable inhibitör konformasyon ve enzim bağlı ε kayması. Bio-tabaka Interferometri sinyal çözelti bileşiminde aşırı duyarlı değildir, bu yüzden de ε en şekilsel değişikliklere katalitik-sitesi ligandların allosterik etkilerini izlemek için kullanılabilir.

Gerçek zaman bağlanma ve ayrılma BLI kinetiği Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Bu deney Birleşme ve ayrışmaya olarak deney tamponu ile yapıldı. Sensörler sadece kısaca ön ıslatılmış olmuştu çünkü bu deney, 10 dakika temel adımla başladı. Daha sonra, biyotinile edilmiş ε sensör üzerine yüklenmiştir. Ε farkedilir bir ayrışma bağlayıcı bir ortak ilave vardı referans eğrisinin (G) görüldüğü gibi, geriye kalan tüm adımlar boyunca oluştu. Bir ikinci referans sensor (H) hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​yoks...

Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı; biyokatman interferometrisi (BLI) kullanarak protein kinetiğini, protein etkileşimlerini ve küçük ligandların bu etkileşimler üzerindeki allosterik etkilerini ölçmektir. Bu işlem, proteinlerden birinin spesifik biotin ile hazırlanması ve paralel olarak streptavidin kaplı biyosensörlerin yüzeyine immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir.İkinci adım olarak, sensöre bağlı protein, bağlanma partnerini içeren bir tampona maruz bırakılır ve bağlanma, sensör yüzeyindeki optik girişim üzerindeki etkisi aracılığıyla gerçek zamanlı olarak ölçülür. Ardından, proteinin gerçek zamanlı disosiyasyonunu ölçmek için her sensör, bağlanma partnerini içermeyen bir tampona aktarılır. Protein kompleksleri.Elde edilen sonuçlar, etkileşime giren proteinlerin bağlanma ve ayrılma kinetik hız sabitlerinin ve dolayısıyla bağlanma afinitelerinin belirlenmesine olanak tanır. Diğer sonuçlar ise, BLI'nın küçük ligandların protein-protein kompleksinin ayrılma hızı üzerindeki etkilerini saptayabildiğini göstermektedir. Bu tekniğin yüzey plazmon rezonansı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, BLI'nın kırılma indisi değişikliklerine karşı aşırı hassas olmamasıdır.Böylece bağlanma v

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Biz geçerlidir etiket kinetik karakterizasyonu ile papain birkaç sistatin B mutantlar bağlayıcı yapı-işlev analizi için ücretsiz Biacore X100 kullanarak protein etkileşim analizi. Kalibrasyon konsantrasyon analizi (CFCA) standart eğri gerek kalmadan muhafaza bağlayıcı aktivite ile protein konsantrasyonu ölçer. Biz CFCA kinetik analiz güvenilirliğini artırır ve bu kinetik sabitler güvenilir bir rekombinant proteinin aktivitesi azalır bile tespit edilebilir kullanarak bu onay konsantrasyonlarının...

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

Bu videoda, ligandlar ve hedef analitler arasındaki moleküller arası etkileşimleri gerçek zamanlı olarak tespit etmek için biyokatman interferometrisi (BLI) teknolojisini gösteriyoruz. BLI, çözelti içindeki analitlerle etkileşime girerken bir biyosensör yüzeyi üzerindeki hareketsizleştirilmiş ligandlardan oluşan bir tabakadan yansıyan beyaz ışığın girişim modelindeki değişiklikleri ölçer.

Ligand ve Analit Arasındaki Etkileşimleri Tespit Etmek için Biyokatman İnterferometri Teknolojisi

İletişim kuralı küçük molekül lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) ile arıtılmış hEAG1 iyon kanal protein etkileşimleri açıklar. Ölçüm BLI roman küçük molekül iyon kanal ligand tarama için potansiyel bir yöntem olabilir gösterir.

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

RNA polimeraz ile transkripsiyon faktörlerinin (TFs) etkileşimleri genellikle PULLDOWN asder kullanılarak incelenmiştir. GrgA 'nın klamidiyal RNA polimeraz ile etkileşimini karakterize etmek için bir Biolayer Interferometri (BLı) teknolojisi uygulıyoruz. PULLDOWN analizlerine kıyasla, BLı gerçek zamanlı dernek ve dissociation algılar, daha yüksek hassasiyet sunar ve oldukça nicelidir.

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

Bu makale, streptavidin bazlı bir biyokatman interferometrisi (BLI) sistemi kullanarak DNA-protein etkileşimlerini incelemek için bir protokolü açıklamaktadır. Etkileşimin denge bağlanma afinitesini(KD) belirlemek için temel veya ileri bağlanma kinetiğini kullanmak için temel adımları ve hususları ana hatlarıyla belirtir.

DNA-Protein Etkileşimlerinin Streptavidin Tabanlı Biyotabaka İnterferometrisi ile İncelenmesi

Bir Nile Red boyama prosedürü kullanılarak alg hücrelerinin nötral lipid içeriğini belirlemek için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu zaman tasarrufu tekniği geleneksel gravimetrik esaslı lipid miktar protokoller için bir alternatif sunuyor. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama için tasarlanmıştır.

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Kolloidal prob nanoskobu, kolloidal sistemlerin fiziksel stabilitesi ve pıhtılaşma kinetiği hakkında bilgi edinmek ve biyolojik sistemleri kullanarak ilaç keşfi ve formülasyon bilimlerine yardımcı olmak için çeşitli alanlarda kullanılabilir. İçinde açıklanan yöntem, bu tür sistemleri incelemek için nicel ve nitel bir araç sağlar.

Kolloidal Probe Nanoscopy kullanarak parçacık-parçacık Etkileşimleri Nicel ve Nitel Sınav

Sunulan protokoller, ligand-reseptör etkileşimlerinin hızlı araştırılması için iki enzim bağlı immünosorban testi (ELISA) tabanlı tekniği tanımlar: İlk test, ligand ve reseptör arasındaki ayrışma sabiti tayinini sağlar. İkinci test, ligand-reseptör etkileşimleri için blokaj peptidlerinin hızlı bir şekilde taranmasını sağlar.

Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

Burada, benzersiz bir kükürt kopolimerine dayalı ligand içermeyen kadmiyum sülfür (CdS) nanopartiküllerini sentezlemek için bir yöntem sunuyoruz. Kükürt kopolimeri, nanopartikül sentezi sırasında yüksek sıcaklıkta bir çözücü ve bir kükürt kaynağı olarak çalışır ve reaksiyondan sonra nanopartikülleri stabilize eder.

Bir Kükürt Kopolimer Matrix içinde ligand-serbest CdS Nanopartiküller Sentezi

Öğrenin, protein-protein etkileşimlerinin kinetiğini ve allosterik ligand etkilerini Bio-layer Interferometry ile nasıl ölçeceğinizi. F-tipi ATP sentaz ve ε alt birimi kullanılarak gerçek zamanlı bağlanma ve ayrışma analizi yapılır.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

Daha fazla video keşfet