Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri
February 18th, 2014
Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, proteinin kinetiğini, protein etkileşimlerini ve küçük ligandların bu etkileşimler üzerindeki allosterik etkilerini biyotabaka interferometrisi, BLI kullanarak ölçmektir. Bu, proteinlerden birinin spesifik biyotin ile hazırlanması ve streptokok yüzeyinde hareketsiz hale getirilmesiyle elde edilir. Aden paralel olarak biyosensörler kapladı.
İkinci adım olarak, sensöre bağlı protein, bağlanma ortağını içeren tampona maruz bırakılır ve bağlanma, sensör yüzeyindeki optik girişim üzerindeki etkisi ile gerçek zamanlı olarak ölçülür. Daha sonra, proteinin gerçek zamanlı ayrışmasını ölçmek için her bir sensör, bağlanma ortağı olmadan tampona aktarılır. Protein kompleksleri.
Elde edilen sonuçlar, etkileşen proteinlerin bağlanması ve ayrışması için kinetik hız sabitlerinin ve dolayısıyla bağlanma afinitelerinin belirlenmesine izin verir. Diğer sonuçlar, BLI'nin küçük ligandların protein protein kompleksinin ayrışma hızı üzerindeki etkilerini tespit edebildiğini göstermektedir. Bu tekniğin yüzey plazma rezonansı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, BLI'nın kırılma indisi değişikliklerine karşı aşırı hassas olmamasıdır.
Bu nedenle, bağlanma ve ilişkilendirme adımları, protein-protein etkileşimleri üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak test etmek için küçük ligandlardaki değişiklikleri içerebilir, ancak bu yöntem, protein-protein etkileşiminin kinetiği hakkında bilgi sağlayabilir. İmmobilize DNA veya RNA'ya protein bağlanması veya immobilize edilmiş bir proteine lipozom bağlanması gibi farklı kombinasyonlara da uygulanabilir. Bu deneye, metin protokolünde açıklandığı gibi BLI cihazını kurarak başlayın.
Daha sonra veri toplama yazılımında deney tasarımını kurun. Deney sihirbazı sekmesinde yeni kinetik deneyi seçin. Bu, birinci sekmede tanımlanması gereken tüm adımları içeren sekmeli bir menü sunar.
Kullanılacak sütunları tanımlayın. 96 kuyulu numune plakasında. Tamponu, hareketsiz hale getirilecek proteini veya bağlayıcı ortağı içerecek sütunları atayın.
Her ilişkilendirme için, kullanılacak bağlayıcı ortağın konsantrasyonunu iyi girin. İkinci sekmede, tahlil için gereken tüm adımları tanımlayın. Bunlar, temel yükleme ilişkilendirmesini ve bağlayıcı ortağın ayrışmasını içerir.
Bireysel tahlil adımları, tahlil adımını seçerek ve ardından ilgili sütuna çift tıklayarak numune plakası üzerindeki kuyucuk sütunları ile bağlanır. Bu, sensörleri bir kuyu sütunundan diğerine taşınacak şekilde programlar. Tahlil sırasında, 96 kuyucuk plakasında ilk BLI sinyallerini oluşturmak için tahlil tamponu ile kuyucukların ilk sütununa bağlı kısa bir temel adımla başlayın.
Ardından yükleme adımını biyotinile proteini içerecek kuyucuklara bağlayın. Önceden belirlenmiş bir bağlama düzeyi elde etmek için eşik işlevini kullanın. Eşik seçeneğini, tüm sensörler bir sonraki kuyu sütununa taşınacak şekilde ayarlayın.
Sensörlerden herhangi biri eşiğe ulaştığında, sensörlerden hareketsizleştirilmemiş biyotinile proteinleri yıkamak için tampona başka bir temel adım ekleyin ve küresel bağlanma ve ayrışma hızı sabitlerini belirlemek için temel tahliller için yeni kararlı temel sinyaller oluşturun, ilişkilendirmeden önce yeni bir tampon kuyusu sütununda sensörlerle ekstra bir temel adım içerir. Sonraki adımda, ilişkilendirmeyi bağlayın. Bağlayıcı ortağın değişen konsantrasyonlarını içeren kuyucuk sütununa adım atın.
Adım süresini, bağlanma ortağının en azından doymuş bir konsantrasyonu denge bağlama sinyaline ulaşacak şekilde ayarlayın. Ayrıştırma adımı için, sensörleri, ilişkilendirmeden önce ekstra taban çizgisi için kullanılanla aynı tampon kuyuları olan dördüncü sütuna dönecek şekilde belirleyin. İlişkilendirme ve ayrışma adımlarının süreleri, oranların beklenenden daha yavaş veya daha hızlı olması durumunda deney sırasında ayarlanabilir.
Üçüncü sekmede, test için önceden ıslatılmış sensörleri içerecek olan sensör tepsisindeki konumları belirtin. Dördüncü sekme, programın grafiksel olarak gözden geçirilmesine izin verir. Beşinci sekmede, veri dosyalarının konumu ve istenen sıcaklık dahil olmak üzere gerekli ayrıntıları girin.
Deney için. Streptavidin kaplı sensörleri en az 10 dakika önceden ıslatın. Koruyucu sükroz kaplamalarını çıkarmak için, sensör içeren rafı sensör tepsisinden çıkarın ve plakanın bir köşesini tepsi üzerindeki yönlendirme çentiğine kaydırarak tepsinin altına 96 oyuklu bir plaka yerleştirin.
Kullanılacak sensör sütunu için, oyuk başına 200 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. 96 oyuklu plakanın bu sütununda, sensör rafını tepsiye atandığı gibi doğru yönde geri getirin Programlama sırasında, numune plakasının kuyularını tahlil tamponu veya uygun protein seyreltmeleri ile doldurun. Optik sinyalde parazite neden olabileceğinden baloncuk sokmaktan kaçının.
Biyotinile proteini veya bağlayıcı ortağı atlayan bir veya daha fazla referans kuyusu ekleyin. Cihazın kapısını açın ve sensör kolundan gelen ışık çıkışına dikkat edin. Sensör tepsisini, tepsi tırnakları sahne alanının yuvalarına yerleştirilerek sahne alanına yerleştirin.
Numune plakasını plaka tutucuya yerleştirin. Plakanın, plaka tutucusunda belirtildiği gibi düz ve doğru yönde oturduğundan emin olun. Kapıyı kapatın ve testi veri toplama programından başlatın.
Sensörler hala ön ıslatma gerektiriyorsa, deneyin başlatılmasını geciktirme seçeneğini seçin. Son olarak, tüm numune hazırlama işlemleri tamamlandıktan ve hem numune plakası hem de sensör tepsisi cihaza yüklendikten sonra, testi çalıştırmak için git düğmesine tıklayın. Test çalıştırıldıktan sonra, veri analizi yazılımını açın ve verileri içeren klasörü yükleyin.
Aşamalı işleme menüsünü ve veri seçimi altında her sensöre farklı bir renk atanmış ham kinetik verileri görmek için işleme sekmesine tıklayın. Numune plakası haritasındaki sensör seçim düğmesine tıklayın. İşleme menüsünde bir veya iki kontrol sensörü için kuyuları referans kuyuları olarak belirleyin.
Çıkarma kutusunu işaretleyin ve referans sinyalini diğer tüm sensör sinyallerinden çıkarmak için referans kuyularını seçin. Y eksenini hizala adımını kullanarak tüm izlemeleri Y sıfıra eşit olacak şekilde hizalayın. Ardından, zaman aralığı için hizalama adımı olarak taban çizgisini seçin.
Bu taban çizgisinin son 10 saniyesini girin. Bu temel adımın içine tıklamak hizalamayı gösterecektir. Ardından, ilişkilendirme ve ayrışma adımları arasındaki sinyal kaymalarını en aza indirmek için adımlar arası düzeltme kutusunu işaretleyin.
Taban çizgisi veya ayrışma için bir çizgi seçin. Çoğu durumda KY gole filtreleme işlevini seçin ve sağ alt paneldeki son işlem verilerini görsel olarak incelemeye devam etmek için işlem verilerine tıklayın. Verileri analiz etmek için, analiz adımı, ilişkilendirme ve ayrışmayı seçme adımı için veri analizinde analiz sekmesine tıklayın.
Model için, sığdırmak için bire bir seçin Genel seçin. Renk seçimine göre gruplandırmak için, partnerin hareketsizleştirilmiş proteine doymuş bağlanması üzerine maksimum sinyal yanıtının bağımsız olarak takılmasına izin vermek için sensör tarafından bağlantısız r max öğesini seçin. Son olarak, doğrusal olmayan regresyon analizini başlatmak için eğrileri sığdır'a tıklayın.
Regresyon eğrilerinin sensör veri izleri ile üst üste bindirilmesini, bağlantı artıklarının grafiklerini ve belirlenen parametre değerlerini ve istatistikleri içeren bir tabloyu içeren uygulama sonuçlarını inceleyin. Gerçek zamanlı bağlanma ve ayrışma BLI kinetiği burada gösterilmiştir. Bu deney, sensörler önceden ıslatılmış olduğu için 10 dakikalık bir temel adımla başlatıldı, sadece kısa bir süre için sensörlere biyotinile epsilon yüklendi.
Referans eğrisinden görüldüğü gibi, kalan tüm adımlar boyunca epsilonun saptanabilir bir ayrışması meydana gelmedi, bu da hiçbir bağlayıcı partner eklenmedi. İkinci bir referans sensörü, mobilize edilmiş bir proteinden yoksundu ve bağlanma partnerinin düşük spesifik olmayan bağlanmasını gösterdi. Sonuçları küresel olarak eşleştirmek ve ilişkilendirme hızı sabiti ile ilişkilendirme hızı sabiti için en iyi değerleri elde etmek için A'dan F'ye kadar olan sensörler için ilişkilendirme adımında çeşitli F1 eksi epsilon konsantrasyonları kullanıldı ve denge ayrışma sabiti KD sonuçları işlenerek mavi veri izleri elde edildi.
Bu durumda, referans sensör izi, bağlanma ortağının spesifik olmayan bağlanmasını ve sistem sinyali kaymasını düzeltmek için numune izlerinden çıkarıldı. Veri analizi adımında, bire bir, bire bir model ile tüm eğriler global olarak uygun hale getirildi. Global uyum, bağlayıcı ortağın tamamen ayrıldığını varsayar.
Burada, enzimin bir milimolar, A-T-P-A-D-T-A varlığında sensöre hareketsiz hale getirilmiş epsilona bağlandığı farklı bir deney gösterilmiştir. Bu, çoğu F1 epsilon kompleksini, kolayca ayrışan sensörlerin daha sonra farklı ligandlara sahip tahlil tamponu içeren ayrışma kuyularına taşınan inhibitör olmayan doğrulamayı varsaymaya yatkın hale getirir. Bu, farklı ligandların epsilonun doğrulanması üzerindeki etkilerini göstermektedir.
Örneğin, magnezyum A GP ve fosfata maruz kalma, net ayrışmayı önemli ölçüde yavaşlattı, bu da epsilonun onayı sıkıca bağlı inhibitör duruma kaydırdığını gösteriyor. BLI tahlillerini ilk kurarken, proteinin sensörlere spesifik olmayan bağlanmasını ve spesifik olmayan bağlanmanın kullanılacak protein konsantrasyonlarına göre önemli ölçüde değişip değişmediğini test etmek için kontrollerin dahil edilmesi önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, protein protein etkileşimlerinin kinetiğini ölçmek için BLI tahlillerinin nasıl tasarlanacağını, programlanacağını ve analiz edileceğini iyi anlamalı ve bunu takdir etmelisiniz.
BLI, küçük ligandların protein protein etkileşimleri üzerindeki etkileri için doğrudan bir teste izin verir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, Bio-layer Interferometry (BLI) kullanarak protein-protein etkileşimlerini ölçmek için protokoller sunmaktadır. Odak noktası, bakterilerde enerji metabolizmasında rol oynayan F-tipi ATP sentaz ve ε alt birimi arasındaki etkileşimdir.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Protein Etkileşimleri
Arka Plan
- F-tipi ATP sentaz, hücresel enerji üretimi için kritik öneme sahiptir.
- ε alt birimi, ATP sentazın aktivitesini inhibe edebilir.
- Bu etkileşimleri anlamak, metabolik düzenleme hakkında fikir edinmek için önemlidir.
- Bio-layer Interferometry, bu etkileşimlerin gerçek zamanlı ölçümüne olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Protein-protein etkileşimlerinin kinetiklerini ölçmek.
- Bu etkileşimlerde küçük ligandların allosterik etkilerini araştırmak.
- ATP sentazın katalitik kompleksini incelemek için BLI'yi adapte etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Yerleştirme için biotin ile proteinlerin hazırlanması.
- Bağlanma testleri için streptavidin kaplı biyosensörlerin kullanılması.
- Optik girişim kullanarak bağlanma ve ayrışmanın gerçek zamanlı ölçümü.
- Etkileşim sırasında oluşan protein komplekslerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- ATP sentaz ve ε alt birimi arasındaki bağlanma kinetiklerinin başarılı bir şekilde ölçülmesi.
- Protein komplekslerinin ayrışması üzerine gerçek zamanlı veriler.
- ATP sentaz aktivitesinin allosterik düzenlemesi hakkında fikirler.
- Protein etkileşimlerini incelemek için BLI'nin değerli bir araç olduğunun gösterilmesi.
Sonuçlar
- BLI, protein-protein etkileşimlerini incelemek için etkilidir.
- ATP sentaz ve ε alt birimi arasındaki etkileşim, metabolik kontrolü anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Gelecekteki çalışmalar, diğer protein etkileşimlerini araştırmak için bu yöntemler üzerine inşa edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Bio-layer Interferometry (BLI) enables real-time kinetic analysis of protein-protein interactions and allosteric ligand effects, supporting target validation in antibacterial drug discovery. By measuring binding and dissociation rates of the ε subunit with ATP synthase catalytic complexes, BLI provides quantitative data to de-risk mechanistic hypotheses and prioritize lead compounds. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking ligand-induced conformational changes to functional inhibition of a clinically relevant target.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how ligands shift ε subunit conformation between active and inhibitory states.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding kinetics without label interference, reducing assay variability.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating ligand binding with functional outcomes in bacterial energy metabolism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Measures association and dissociation rate constants to characterize binding affinity under physiologically relevant conditions.
- Operational Value: Tolerates varying buffer compositions, allowing screening of diverse ligand libraries without signal artifacts.
- Scalability: Compatible with 96-well formats for parallel evaluation of multiple ligand concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro binding data to bacterial-specific auto-inhibition mechanisms relevant to antibiotic development.
- Mechanistic De-risking: Clarifies allosteric regulation of ATP synthase, reducing ambiguity in target engagement strategies.
- Preclinical Alignment: Supports disease-relevant modeling by focusing on a validated antibacterial target (FDA-approved for tuberculosis).
Pipeline & Workflow Integration
BLI fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for antibacterial programs targeting energy metabolism.
- Discovery Biology: Tests target validity by measuring real-time kinetics of protein-protein interactions and ligand-induced conformational shifts.
- Screening: Delivers quantitative KD, kon, and koff values to support hit-to-lead progression and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides sensor-based optical interference readouts that enable global fitting and residual analysis for robust kinetic modeling.
- Translational Research: Connects biochemical mechanism to antibacterial phenotype through inhibition of a clinically validated target.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying protein-protein interactions across multiple targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by detecting allosteric effects of small ligands on protein complex stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through reference subtraction, baseline alignment, and inter-step correction during data processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic thresholds for target engagement and ligand efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on binding kinetics and conformational selectivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biotinylation, streptavidin biosensor handling, and BLI instrument setup.
- Depends on access to multi-well plate readers with temperature control and real-time optical monitoring capabilities.
- Necessitates standardized workflows for sensor regeneration, reference well inclusion, and data subtraction to minimize noise.
- Involves optimization of association and dissociation timing based on ligand binding kinetics and complex stability.
- Limited by the need for immobilized binding partners, which may affect native protein conformation or accessibility.
