Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Bu videonun genel amacı, modifiye edilmiş nükleosit fosfatların sentezinden tam biyokimyasal karakterizasyonlarına kadar olan prosedürü göstermektir. Bu, önce uygun şekilde korunan nükleosit öncüsünü, dört aşamalı bir kap prosedürünün uygulanmasıyla karşılık gelen tri fosfata dönüştürerek gerçekleştirilir. İkinci adım, elde edilen tri fosfatın önce bir çökeltme ve daha sonra ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile saflaştırılmasıdır.

Daha sonra, tri fosfat analogu, yüksek saflık sağlamak için nükleer manyetik rezonans ve matris destekli lazer DESORPSIYON iyonizasyon uçuş süresi veya NMR ve maloff ile karakterize edilir. Son adım, primer uzatma reaksiyonları ve terminal deoksi nükleotid transferaz veya TDT polimerizasyon reaksiyonlarıdır. Son olarak, reaksiyon ürünleri ve dolayısıyla tri fosfatın substrat kabulü, jel elektroforezi ile analiz edilir.

Bu yöntemin Borge yaklaşımı gibi diğer sentetik stratejilere kıyasla avantajı, daha az yan ürünün oluşması ve dolayısıyla saflaştırmanın daha kolay olmasıdır. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, birden fazla alanda bilgi gerektiren oldukça uzun ve karmaşık bir prosedür olduğu için mücadele edeceklerdir. Bu yöntemin filme alınması fikri ilk olarak modifiye fosfatları sentezlediğimizde ve ayrıntılı bir prosedür bulmanın oldukça zor olduğunu gördük.

Bu yöntemin bir başka avantajı da, modifiye edilmiş nükleik asitler alanındaki diğer soruların üstesinden gelmek için kullanılabilmesidir. Gerçekten de, çok çeşitli reaksiyonları katalize eden DNA enzimlerini seçmek için kullanılabilir. Ek olarak, bu yöntem nükleik asitlerin fonksiyonel etiketlenmesi için kullanılabilir.

Sentez ve saflaştırma adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü tri fosfatlar dikkatle ele alınması gereken polar ve aktif türevlerdir. Başlamak için, uygun şekilde üç asal hidroksil korumalı nükleozidi, gece boyunca vakum altında kurutmadan önce iki mililitre susuz pürin ile iki kez birlikte buharlaştırın. Aynı zamanda, ertesi gün gece boyunca vakum altında kuru mahkeme amonyum pirofosfat, nükleoziti en az 200 mikrolitre kuru piridin içinde çözdü.

Daha sonra bir COS çözücüsü olarak 400 mikrolitre kuru dioksan ekleyin. Son olarak, siklik fosfor üç türevini ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika reaksiyona girmesine izin verin. Daha sonra, 170 mikrolitre kuru dimetilformamid ve 58 mikrolitre taze damıtılmış tri bütil amin içinde bir kuru bütil amonyum pirofosfat çözeltisi hazırlayın.

Elde edilen çözeltiyi reaksiyon karışımına ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika reaksiyona girmesine izin verin. Daha sonra 980 mikrolitre pürin ve 20 mikrolitre su içinde 160 mikromolar iyot çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi reaksiyon karışımına ekleyin.

Alfa fosfor merkezini oksitlemek için. Elde edilen koyu çözeltinin oda sıcaklığında 30 dakika karışmasına izin verin. Fazla iyotu söndürmek için %10'luk sulu bir sodyum tiyosülfat çözeltisi kullanın.

Çözücüyü vakum altında çıkarın. Daha sonra beş mililitre su ekleyin ve döngüsel tri fosfat moty'yi hidrolize etmek için karışımın oda sıcaklığında 30 dakika bekletilmesine izin verin. Bu aşamada, koruyucu gruplar genellikle kaldırılır.

Sonuç olarak, ham numuneye %30 Imodium hidroksit ekleyin. Çözücüyü vakum altında çıkarmadan önce oda sıcaklığında 1,5 saat karıştırın. Daha sonra, iki mililitre su ekleyin ve karışımı tüp tüplerine bölün.

Aseton içinde klorat başına% 2'lik bir sodyum çözeltisinden 12 mililitre ekleyin ve prosedürü tekrarlamadan önce 30 dakika santrifüjleyin. Bir kez daha. Tri fosfattan sentezde kullanılan reaktifler, yağlı bir kalıntı oluşturarak çökelecek ve çözücülerin ayrılmasına izin verecek ve böylece yağlı kalıntının havayla kurutulmasından sonra takip eden ters faz HPLC saflaştırmasını önemli ölçüde basitleştirecektir.

Standart prosedürlere göre ham numunenin bir P 31 NMR spektrumunu kaydedin. NMR'yi takiben, yağlı kalıntı dört mililitre damıtılmış su içinde çözüldü. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi EENT A olarak ultra saf suda ve eent B olarak% 50 asetil nitril içinde 50 milimolar trietil amonyum bikarbonat hazırlayarak HPLC saflaştırmasına başlayın, hem EENT'yi vakum altında hem de 20 dakika karıştırarak gazdan arındırın.

10 mikrolitre ham tri fosfatı 300 mikrolitre damıtılmış suda çözerek analitik bir numune hazırlayın. Ardından 40 dakikada %0 B ile %100 B arasında değişen bir gradyan kullanarak. Numuneyi, yarı hazırlayıcı bir ters Faz C 18 kolonu ile donatılmış bir HPLC sistemine enjekte edin.

HPLC programını tri fosfat ve difosfatın tutma süresine göre ayarlayın. Bu koşulları kullanarak ham karışımı saflaştırın ve bir miktar difosfat içerebilecek erken fraksiyonları çıkararak, ürünü içeren tüm fraksiyonları birleştirin ve dondurarak kurutun. Daha sonra ultra saf su ile birkaç kez buharlaştırın.

Standart protokollerin uygulanmasıyla tri fosfatın saflığını NMR ve maloff ile değerlendirin. Bu protokolün uygulanmasıyla elde edilen tipik verimler, beş prime için substrata ve astarın etiketlenmesine bağlı olarak %30 ila %70 aralığındadır. Astar ve reaktifleri metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi karıştırın ve etiketleme reaksiyonunu 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Etiketleme reaksiyonu sırasında, bir mililitrelik pipet ucunu silolanmış cam yünü ile tıkayarak ve ucu G 10 çözeltisi ile doldurarak bir G 10 cidex sütunu hazırlayın. Döndürün ve 500 mikrolitre çift damıtılmış su ile üç kez yıkayın ve 50 mikrolitre çift damıtılmış su ile son bir yıkayın. Etiketleme reaksiyonunun inkübasyonunu takiben, kinazı 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca ısıtın.

Ardından, reaksiyon karışımını G 10'dan geçirin. Serbest radyoaktif etiketli jeli çıkarmak için, radyo etiketli astarı saflaştırın ve ezme ve ıslatma yöntemi, etanol çökeltmesi ve G 10 ile sızan oligonükleotidi tuzdan arındırarak geri kazanın. Astar uzatma reaksiyonu için, bir PICA mol radyoaktif işaretli astar, P bir 10 PICA mol astar, P bir ve 10 PICA mol şablon, T 10 x reaksiyon tamponunda bir birleştirin ve sıcak suda diz çökün.

Daha sonra yavaş yavaş 45 dakika boyunca oda sıcaklığına soğutun. Tüpü buzun üzerine koyun ve nükleosit fosfat veya DNTP kokteyli ve bir birim DNA polimeraz buzu ekleyin. Reaksiyonu toplam 20 mikrolitre hacim boyunca su ile tamamlayın, enzimin optimum çalışma sıcaklığında inkübe edin.

Daha sonra 20 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin ve numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Soğutun, numuneler sıfır santigrat dereceye kadar düşürün. Poli akrilamid jel elektroforezini denatüre ederek çözmeden önce.

TDT polimerizasyonu için bantları fosfo görüntüleyici ile görselleştirin, tek sarmallı etiketsiz primer P 2'yi ve radyo etiketli primeri bir mikrolitre TDT tamponunda seyreltin. Tüpü buzun üzerine koyun ve DNTP kokteylini ve TDT polimerazı ekleyin, ardından 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika ısıtmadan önce 10 mikrolitre durdurma solüsyonu ekleyin ve ardından sıfır santigrat derecede soğutun.

Poli akrilamid jel elektroforezini denatüre ederek numuneyi çözdükten sonra, bir fosfo görüntüleyici kullanarak bantları görselleştirin. Burada, fosfor merkezlerinin karakteristik sinyallerinin gözlemlenebildiği modifiye edilmiş bir DNTP'nin tipik bir ham P 31 NMR spektrumu gösterilmektedir. Ek olarak, difosfat ve monofosfat tarafından kaynaklanan sinyaller

Bu aşamada her zaman daha yüksek fosfatlı ürünler gözlenir. Ham karışımın ters faz HPLC analizi burada gösterilmiştir. Ana tepe noktası, beş asal fosfata karşılık gelirken, ana yan ürün olan beş asal difosfat, biraz daha düşük bir tutma süresi gösterir.

Son olarak, kapsamlı bir ters fazdan, HPLC saflaştırmasından sonra, modifiye edilmiş DNTP, NMR ile karakterize edilir ve burada gösterilecek olan maldi, sülfa ide, modifiye edilmiş DUTP analogunun maloff spektrumudur. Sodyum eklentisi, 712.54'lük kütle aşırı yükünde görülebilir ve hiçbir difosfat izi yoktur. Hem P 31 NMR hem de proton NMR spektrumları, modifiye edilmiş dps'nin saflığını değerlendirmek için çok önemlidir.

İstenmeyen boya ve mono fosfatların varlığı, gösterilen ayırt edici sinyalleri verdiğinden, burada trans prolin modifiye DUTP, histamin modifiye DATP ve valerik asit modifiye DCTP ile birincil uzatma reaksiyonlarının sonucu, iki modifiye DN dps'nin kombinasyonları olarak tek başına modifikasyonlar olarak veya tek bir doğal DGTP ile birlikte kullanılır. Son olarak, farklı modifiye edilmiş DUTP analogları ile temsili TDT aracılı polimerizasyon reaksiyonları, denatüre edici poli akrilamid jel elektroforezi ile analiz edildi. Bu bağlamda, cis prolin modifiye DUTP ve peptit modifiye DUTP, TDT için en iyi substratlardır.

Atık verimleri karşılaştırılabilir olduğundan veya bunun yerine doğal DTTP'ninkileri aştığından, üre modifiye edilmiş DUTP bu bağlamda oldukça zayıf bir substrattır. Az poli dağıldığından, daha uzun boyutlu oligonükleotidler gözlemlenebilir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık bir hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, nükleer sitrik fosfatların doğanın aktive edici yapı taşları olduğunu ve bu nedenle oluşturulduktan sonra bunları kullanırken dikkatli olunması gerektiğini akılda tutmak önemlidir.

Nükleik asitler alanındaki araştırmacılar, modifiye aberler ve katalitik nükleik asitler oluşturmak için kombinatoryal seçimleri araştırmak için bu yöntemi kullanırlar. Bu videoyu izledikten sonra, dört aşamalı bir pop prosedürü kullanılarak modifiye fosfatların nasıl sentezleneceğini ve karakterize edileceğini, ardından ters faz HPLC saflaştırmasını ve birincil uzatma reaksiyonlarını nasıl yapacağınızı iyi anlamalısınız. Normalde deney bölümlerinde bulunmayan bazı deneysel detaylar belirginleşecektir.

Bu yöntem, ek soruları yanıtlamak için PCR gibi diğer tekniklerle birlikte kullanılabilir. Gerçekten de, modifiye edilmiş tri fosfatların in VIO seçim yöntemleriyle uyumluluğunu değerlendirmek için kullanılabilir.