Bir In vivo Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vivo çapraz bağlama yaklaşımı kullanarak canlı drosophila embriyolarından protein kompleksleri elde etmektir. Bu işlem, öncelikle binlerce sineğin bir popülasyon kafesine yerleştirilmesi ve erken evre embriyoların toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, proteinler in vivo ortamda formaldehit ile çapraz bağlanır ve böylece dahili protein kompleksleri stabilize edilir.

Ardından, protein komplekslerinin immünopresipite edilebilmesi için çapraz bağlanmış embriyolardan protein ekstraktları hazırlanır. Sonuçlar, izole edilen protein komplekslerini Western blot analizi ile tanımlar. Bu tekniğin, protein komplekslerinin in vitro yaklaşımlarla geleneksel izolasyonu gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, bu in vivo yaklaşımın, geleneksel in vitro yöntemlerle tespit edilemeyebilecek, geçici ancak fonksiyonel olarak anlamlı protein-protein etkileşimlerini yakalamamıza olanak tanımasıdır.

Tekniği, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Min Gao uygulamalı olarak gösterecek. İlk olarak, suyu ve sinek agarını manyetik karıştırıcı ile karıştırın. Bu karışımı otoklav işlemi sırasında sterilize edin.

Sükrozu elma suyuna karıştırın ve bir plaka üzerinde 70 °C'ye kadar ısıtın. Daha sonra, karışımları birleştirin ve agar katılaşmadan önce 15 dakika boyunca soğumaya bırakın. Etanol içinde taze metil dört hidroksi benzoat hazırlayın.

Bu, koruyucudur. Katılaştırıcı karışıma ekleyin ve beş dakika boyunca karıştırın. Ardından karışımı, kabarcık oluşturmadan 300 santimetrekarelik plastik veya strafor plakalara dökün.

Plakaları 4 °C'de saklayın ve bir hafta içinde kullanın. Embriyo toplamak için 40.000 ila 50.000 sinekli bir popülasyon kafesi hazırlayın. Yüzeyine yaklaşık 4 g fırıncı mayası serpilmiş, mısır unu ve melas ile doldurulmuş iki taze plağı popülasyon kafesine yerleştirin.

Sineklerin bu plaklarda 25 °C'de 48 saat boyunca yaşamasına izin verin. İki gün sonra, iki adet elma suyu agar plağının üzerine yaklaşık bir gram maya serpin ve popülasyon kafesindeki plakları bu plaklarla değiştirin. Bir saat sonra, kafesteki plakları aynı tipteki iki plaka daha ile değiştirin.

Sineklerin bir saat boyunca kullandığı iki toplama plağı embriyolarla doldurulacaktır. Plaktaki embriyoları ve suyu süspande edin ve onları yerinden çıkarmaya yardımcı olmak için bir fırça kullanın. Ardından, bunları iki katmanlı bir elekten geçirin.

Üst katman 850 mikronluk çelik elek, alt katman ise 75 mikronluk çelik elektir. Embriyolar, bir resim fırçası kullanılarak kaba döküntülerden ayrılarak daha ince olan elek üzerinde toplanacaktır. Embriyoları, 50 mililitrelik konik tüp üst kısmından yapılmış ince naylon elek sepete aktarın.

Embriyoları suyla durulayın ve bir kağıt havluya karşı süzgeç içinde kurulayın. Ardından, embriyoları üç dakika boyunca %50'lik çamaşır suyu çözeltisine daldırın. Çamaşır suyu içinde hafifçe çalkalayın, sonra suyla iyice durulayın ve tampon yaparak kurulayın.

Ardından embriyolar yaklaşık 15 saniye boyunca izopropanol içine daldırılır. Çalkalama işlemiyle embriyo kümeleri ayrıştırılır ve bu işlem 30 saniyeden fazla sürmemelidir. Embriyolar kurutma kağıdıyla kurulanır ve ardından beş dakika boyunca heptan çözeltisine aktarılır.

Embriyoların kümelenmesini önlemek için üzerlerine sık sık heptan pipetleyin, embriyoları kurulamak için tamponlayın ve PBST ile durulayın. Embriyoları üç dakika boyunca duruladıktan sonra, mesh yardımıyla 10 ml PBST içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Mesh'i çıkararak embriyoları çözeltide bırakın ve 100 ile 300 mikrolitre arasında embriyo olduğundan emin olun.

Çökmesini bekleyin, PBST'yi aspire edin ve embriyoları çapraz bağlamak için derhal çapraz bağlama işlemine geçin. Öncelikle, embriyoların üzerine taze hazırlanmış 0.2% formaldehyde içeren PBST'den 10 milliliters ekleyin. Nazikçe çalkalayarak 25 degrees Celsius sıcaklıkta 10 dakika boyunca inkübe edin.

10 dakikalık reaksiyon süresinden sonra, embriyoların çökelmesini bekleyin ve solüsyonu uzaklaştırın. Ardından reaksiyonu durdurmak için solüsyonu hızlıca 10 mililitre 0,25 molar glisin içeren PBST ile değiştirin. Tüpü beş dakika daha çalkalanacak şekilde ayarlayın. Durdurma işleminin ardından solüsyonu uzaklaştırın ve her yıkama için 10 mililitre PBST kullanarak embriyoları üç kez yıkayın.

Kalan PBST'yi pipet aspirasyonu ile uzaklaştırın ve embriyoları ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın. Bir homojenizatör ve 2 mL lizis tamponu kullanarak, çapraz bağlanmış embriyoların 500 µL'sini homojenize edin. Bu işlem, sıkı bir havan eli ile yaklaşık 15 darbe gerektirir.

Lizatı bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 15 dakika boyunca hafifçe sallanacak şekilde ayarlayın. Ardından lizatı 16, 000 GS'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Pelet atılabilir. Şimdi süpernatanta, 40 µL anti-HA agaroz boncuk süspansiyonu ekleyin. Boncuk konjugasyonu tamamlandıktan sonra, yaklaşık 2,5 saat boyunca sallayıcıda bekletin.

Boncukları 2,500 Gs'de beş dakika boyunca çöktürün. Tüpte yaklaşık 250 µL süpernatan bırakın ve boncukları bunun içinde yeniden süspande edin. Süspande edilen boncukları bir spin kolon üzerindeki 10 mikronluk filtreye aktarın.

Çözeltiyi 12.000 Gs hızında on saniyelik bir santrifüjleme ile uzaklaştırın. Kolondaki boncukları 200 µL yıkama tamponu ile yıkayın ve tekrar santrifüjleyin. Bu işlemi toplam üç kez tekrarlayın. Ardından, boncuklara 40 µL elüsyon tamponu ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin.

Çıktıyı toplamak için bu süre boyunca tüpü her beş dakikada bir nazikçe çalkalayın. Kolonu bir kez daha 12, 000 GS'de 10 saniye boyunca santrifüj edin. Çapraz bağlamanın etkinliği ve çapraz bağlanmış iki protein kompleksinin saflaştırılması, %3 ila %7'lik kademeli bir jel üzerinde SDS page ve ardından western blot ile analiz edilmiştir. Çapraz bağlamanın derecesini izlemek ve protokol için farklı formaldehit konsantrasyonlarını test etmek amacıyla HA etiketi ve GFP proteini eksprese eden embriyolar kullanılmıştır.

İşlem görmüş embriyolardaki GFP'nin çoğu çapraz bağlanmamıştır, dolayısıyla bu durum gerçekleşmez. Rastgele çapraz bağlanmış iki kompleks, çapraz bağlanmamış kontrol ile karşılaştırılmıştır. Çapraz bağlanmamış iki protein, serbestçe göç eden 285 kilodaltonluk bir bantta görülmektedir.

Çapraz bağlı iki olanı daha ağırdır ve ham protein lizatında daha az göç eder. İki proteinin yaklaşık yarısı in vivo ortamda çapraz bağlanmıştır. HA peptidi ile elüsyonu gerçekleştirilen etkileşimli ortaklar, boncukların yıkanmasının ardından, elüsyon fraksiyonunda hem kompleks hem de serbest tüp proteinine sahipti.

SDS uzaklaştırıldığında, tüp büyük oranda serbest kalır ve minimum düzeyde tüp kompleksi oluşur. Bu prosedürün ardından, izole edilen komplekslerdeki protein bileşenlerinin tanımlanması gibi yöntemlerle ilgili ek soruları yanıtlamak için kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.