Name: Bir In vivo Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Öğrenin, Drosophila embriyolarından in vivo çapraz bağlama ile protein komplekslerini izole etme yöntemini. Bu teknik, hücresel fonksiyonlar için kritik geçici protein etkileşimlerini yakalar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz bu çalışma ile teknik yardım için Ürdün Davis, Yanyan Lin, Eric SCHADLER ve Jimiao Zheng teşekkür ederim. Bu çalışma ALA MCB-1054962 hibe NSF KARİYER tarafından desteklenen

1.. Büyük Elma Suyu-agar Plakaları hazırlanması <ol><li> 4 plakaları yapmak için, 1000 ml&#39;lik bir şişeye 375 ml 2 H, O, 11.25 g uçucu agar ve bir karıştırma çubuğu ilave edin. Bu gevşek sıvı mallar için tek bir 30 dakika sterilizasyon döngüsünde şapkalı şişe kapağı Mix A. otoklav Mix A. </li><li> 500 ml&#39;lik bir behere 125 ml elma suyu, 12.5 g sofra şekeri ve bir karıştırma çubuğu ilave edin. Karışım A ve otoklavlama işlemi bitene kadar yaklaşık 70 ° C&#39;de karıştırıldıktan ve sıcaklığı muhafaza ederken bu ısıtılmış bir platformda Mix B. ısı Mix B. </li><li> Mix tamamlanmasından sonra bir otoklav, A. yavaşça kombine karışımı karıştırma devam Mix Mix B transferi ve bunun 15 dakika boyunca soğumaya bırakın. Aşırı soğutma ve bir koruyucu eklenmeden önce neden agar katılaşma kaçının. </li><li> , Etanol içinde% 10 (ağırlık / hacim) metil 4-hidroksibenzoat, bir çözüm olun. Bu, koruyucu olarak hareket edecektir. Yukarıda elma suyu-agar karışımına solüsyonun 3.75 ml ilave edilir. Anothe karıştırıldıktan Ol5 dakika r. </li><li> Her 300 cm 2 plastik veya köpük tabak içine koruyucu ile 125 ml elma suyu agar karışımı dökün. Bu sırada oda sıcaklığma soğumaya ve katılaşmaya olsun. Dökme sırasında, hava kabarcıkları oluşturan kaçının. Not: elma suyu agar plakaları hemen kullanıma hazırdır. Net sarar ile kullanılmayan tabak örtün ve bir hafta kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2.. Drosophila Embriyo Toplama ve Ön çapraz bağlama tedavisi <ol><li> Embriyolar elde edilecek olan yaklaşık 40.000 ila 50.000 sinekler ile nüfus kafes yerleştirin. </li><li> Her iki levha 12 orta standart mısır unu-melas 125 ml içeren yapın ve her plaka üzerinde kurutuldu, fırıncı mayası içinde yaklaşık 4 gr serpin. Sinekleri şişmanlatıyor 48 saat boyunca 25 ° C inkübatör nüfus kafesin içine bu tabak yerleştirin. </li><li> 25 ° C sıcaklığa kadar ıstınız 2 elma suyu-agar plakaları Her biri üzerinde kurutuldu, fırıncı mayası içinde yaklaşık 1 gr serpinplakası. 0-1 hr-eski embriyoların toplamaya başlamak için nüfus kafes içinde 2 tabak yerleştirin. </li><li> 1 saat koleksiyonu sonunda plakalarını çıkartın. Koleksiyonun bir tur gerekirse 2 yeni plakalar ile değiştirin. </li><li> Plakaları kapak ve ince bir fırça ile hafifçe embriyolar tekrar süspansiyon yeterince su ekleyin. Paslanmaz çelik tel örgü yapılmış iki tabakalı bir elekten tekrar süspansiyon haline embriyolar dökün. Not: Üst tabaka embriyo ile icar ederken büyük bir böcek parçalarını toplayan orta gözenek boyutu (850 mikron) örgü yapılır. Alt tabaka maya ve su geçişine için verirken, embriyolar toplar ince örgü (75 mikron) yapılmıştır. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp ve ince naylon örgü ile yapılan bir toplama sepeti içine toplanan embriyolar transfer ince boya fırça kullanın. Su ile kısaca embriyoların durulayın sonra kuruması için kağıt havlu üzerine örgü kurulayın. </li><li> 3 dakika boyunca hafif bir döndürme ile% 50 çamaşır suyu embriyolar bırakın. Tam durulayınly su ile kalan çamaşır suyu çıkarmak için. Kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın. </li><li> (Bu, daha uzun bir süre 30 saniye sürmemelidir) 15 saniye boyunca hafifçe çalkalanarak izopropanol veya çok embriyo kümeleri arıza kadar dechorionated embriyolar bırakın. Iyice kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın. </li><li> Yeniden asılmış onları tutmak için embriyolar üzerinde heptan akışı için bir pipet kullanırken 5 dakika boyunca heptanda embriyolar daldırın. Kurulamak için kağıt havlu üzerinde örgü kurulayın. </li><li> 3 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 (PBST) içeren fosfat tamponlu salin, pH 7.4 (PBS) akışı ile embriyolar durulayın. </li><li> Toplama sepeti sökün ve 10 ml PBST ihtiva eden bir 15 ml tüp örgü ile birlikte embriyolar aktarılır. Örgü kapalı embriyoların yıkamak için tüp hafifçe çevirin. </li><li> Tüpten kafes çıkarın. Dikey konumda tüp koyun ve embriyolar yerçekimiyle tüpün dibine çöker sağlar. Not: Yaklaşık 100-300embriyoların ul bir kafesten bir 1 saat toplama beklenmektedir. </li><li> PBST çıkarın ve hemen çapraz bağlama gerçekleştirmeye devam. </li></ol> Toplanan Embriyolar 3.. In vivo Çapraz <ol><li> Kullanımdan hemen önce, PBST içinde% 0.2 &#39;lik formaldehit hazırlayın. Embriyoların için formaldehit sabitleyici 10 ml eklenir ve 10 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde hafif bir çalkalama ile 25 ° C&#39;de inkübe edin. Günün sonunda kullanılmayan fiksatif atın. </li><li> Çapraz bağlama reaksiyonu söndürün <ol><li> Çapraz bağlama sonunda, embriyolar tüpün dibine çöker sağlar. </li><li> Formaldehit çözeltisi çıkarın. Hemen çapraz bağlama, reaksiyonun sönmesi için PBST içinde 0.25 M glisin 10 ml ekleyin. 5 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde hafif bir çalkalama ile 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Embriyoların tüpün dibine çöker olsun. Söndürme çözeltisi çıkarın. PBST&#39;de 10 ml üç kez ile embriyolar yıkayın. </li><li> Tamamen P çıkarınBir pipet kullanarak TSİ yıkama solüsyonu. -80 ° C&#39;de kullanıma kadar saklayın embriyolar. </li></ol></li></ol> 4.. Protein Numune Hazırlama ve immüno-çökeltme <ol><li> 2 ml lisiz tampon maddesi içinde bir Dounce homojenleştirici kullanılarak 500 ul çapraz bağlanmış homojen embriyolar (0.5 M üre,% 0.01 SDS,% 2 Triton X-100, PBS içinde 2 mM fenilmetansülfonil florit [PMSF] ve proteaz inhibitörü kokteyli). Not: Aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında bu ve aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> 1.5 ml santrifüj tüplerine lizat aktarın ve yavaşça ayrıntılı lizizi sağlamak için 15 dakika için bir döner platform üzerinde sallayın. Hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 5 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de lizat santrifüj. Temiz bir 15 ml tüp içinde süpernatant kaydedin. </li><li> Anti-HA agaroz boncuklar süpernatana çamur 40 ul ilave edin ve 2.5 saat süreyle dönüşlü bir platform üzerinde inkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 2500 x g&#39;de santrifüjleme ile boncuk Pelet. Süpernatantı ama beğenme bırakıntüp içinde ximately 250 ul. Geri kalan süpernatan içinde yeniden süspanse edin ve boncuklar 10 mikron gözenek filtresi ile bir 1.5 ml döndürme kolonuna transfer. </li><li> 10 saniye boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj spin kolon ve akış atmak. </li><li> 200 ul yıkama tamponu (0.1 M glisin, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630,% 0.1 Tween-20, PBS) eklenerek ve boncukları yıkayın. 10 saniye boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ve sütun yıkama atın. Yıkandıkları iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Boncuklara 40 ul yıkama tamponu (2 mg / ml PBS içinde HA-peptid) eklenir ve yavaşça çalkalanarak her 5 dakika ile 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. 10 saniye boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ve sütun elüat toplamak. </li><li> Anti-HA antikoru kullanılarak western 13-blot analizi ile kompleks bir elüsyon kontrol edin. </li></ol>

<ol><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA+binding+sites+by+CLIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq.</a> Methods. , (2013).</li>
<li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+mass+spectrometry+%3A+JMS%22%5BJournal%5D)">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).</li>
<li>Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+specific+Tudor+domains+in+Tudor-Aubergine+protein+complex+assembly+and+distribution+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).</li>
<li>Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tudor+domains+in+germline+development+and+polar+granule+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture.</a> Development. 133, 4053-4062 (2006).</li>
<li>Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+gene+required+for+assembly+of+the+germ+plasm+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster.</a> Cell. 43, 97-104 (1985).</li>
<li>Thomson, T., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tudor+is+essential+for+polar+granule+assembly+and+pole+cell+specification%2C+but+not+for+posterior+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning.</a> Genesis. 40, 164-170 (2004).</li>
<li>Arkov, A. L., Ramos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+RNA-protein+granules%3A+insight+from+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Building RNA-protein granules: insight from the germline.</a> Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).</li>
<li>Gao, M., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+organelles%3A+Structure+and+role+of+germ+granules+in+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+reproduction+and+development%22%5BJournal%5D)">Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline.</a> Molecular reproduction and development. , (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+methylarginine-dependent+recognition+of+Aubergine+by+Tudor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor.</a> Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).</li>
<li>Liu, N., Han, H., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasa+promotes+Drosophila+germline+stem+cell+differentiation+by+activating+mei-P26+translation+by+directly+interacting+with+a+%28U%29-rich+motif+in+its+3%5BTitle%5D)+AND+%22UTR.+Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3.</a> UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).</li>
<li>Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthews%2C+KA+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+new+polar+granule+components+in+Drosophila+reveals+P+body+and+ER+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins.</a> Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).</li>
<li>Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein-protein+interactions+using+in+vivo+cross-linking+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry.</a> Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694(2006).</li>
<li>Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+facets+interacts+with+vasa+in+the+Drosophila+pole+plasm+and+protects+it+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation.</a> Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Formaldehit genellikle protein-protein, protein-nükleik asit etkileşimleri belirlemek için bir çapraz bağlama maddesi olarak kullanılmaktadır. Birlikte aşağı kütle spektrometresi prosedürleri ile uyumluluğu ile iyi çözünürlük ve hücre zarı geçirgenliği, hücre içi çapraz uygulamalar 3,15-17 için formaldehit ideal bir aday ajan olun. Özel olarak, başarılı bir şekilde Vasa, Drosophila 11 önemli bir germ hücre RNA helikaz ile ilişkili mRNA tespit etmek için kullanıldı. Yakın varlarsa molekülle...

Multisubunit protein montajlar ve DNA-ya da RNA-protein komplekslerinin izolasyonu protein kompleksleri, DNA-bağlanma düzenleyici proteinler veya RNA bağlama proteinlerinin RNA hedefleri tarafından kabul genomik lokusları tespit için gerçekleştirilir. Farklı yöntemler, belirli bir RNA-bağlama proteini (CLIP-seq) 2 ile ilişkili transkripsiyon faktörleri veya kromatin proteinleri (ChIP-seq) 1 ve RNA hedefleri tarafından tanınan DNA siteleri genom tanımlanmasını sağlar. RNA türetilmiş cDNA ya da DNA hedeflerinin diziler daha sonra derin dizilir. Bu yöntemler, kimyasal veya UV kaynaklı çalışılan kompleksinin bir protein bileşenine karşı bir antikor ile immüno-çökeltme (IP) takip kompleksleri stabilize etmek için çapraz bağlama kullanın. Bir organizmanın gelişimi sırasında, çok sayıda geçici protein kompleksleri oluşturur. Bu nedenle, kontrol dev moleküler mekanizmaların anlaşılması, in vivo olarak, bu komplekslerin bileşimi ve işlevini analiz için çok önemlidirelopment. Bu etkileşim bileşenleri ve in vitro olarak hücre biyokimyasal ortamı yerel konsantrasyonları üretmek için neredeyse imkansız olduğu için bu tür bir in vivo analiz in vitro yaklaşımına göre daha üstün olacaktır. Burada biz başarılı Drosophila embriyolar büyük protein kompleksleri izole etmek için kullanabileceğiniz bir in vivo yaklaşım göstermektedir. Bu yöntemde, canlı embriyolar protein kompleksleri düşük formaldehit konsantrasyonu ve daha sonra ilgi protein kompleksleri için kompleksleri ve kütle spektrometre analizi jel geçirilmiş, ardından arıtma komplekslerinin bilinen bir bileşenine karşı bir antikor ile IP ile izole edilir ile çapraz bağlanmış olan bilinmeyen karmaşık bileşenleri tanımlar. Formaldehit hücre zarı nüfuz edebilir ve 2.3-2.7 Â 3 bir dizi çapraz bağlama sahip olduğu için, protein kompleksleri, in vivo olarak çapraz bağlanabilir ve karmaşık parçaları birbirine yakın olması muhtemeldir. Bu makalede bizBir örnek olarak Tudor (Tud) protein kompleksinin izole edilmesini kullanarak bu yöntem açıklanmaktadır. Tud tohum çizgisi 4-7 gelişimi için gerekli olan bir tohum çizgisi proteindir. Bu protein için diğer polipeptidlerin 8-10 metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim için bilinen 11 Tud alanları içerir. Daha önce, fonksiyonel Tud 5 HA-etiketli ifade eder ve bu nedenle, spesifik bir anti-HA antikoru çapraz bağlamadan sonra Tud kompleksi aşağı çekmek için kullanılan bir transgenik Drosophila satır elde ettik. Protein-protein çapraz bağlar ek olarak, nükleik asit, formaldehit-protein çapraz bağlar oluşturabilir ve yonga-seq deneylerde kullanılır. Ayrıca, Drosophila, formaldehid ile çapraz bağlama, in vivo Vasa RNA helikaz protein 11 bir RNA hedefinin belirlenmesini sağladı. Bu yazıda in vivo çapraz bağlama ve pur için bir yöntem tarif ederkenDrosophila embriyolardan protein kompleksleri ification, bu yöntem diğer organizmalar ve dokular için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>Drosophila agar</td><td>Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td><td>FLY-8020-1</td><td>Elma suyu plakalarının kırılgan hale gelmesine neden olacağından su ve agar karışımını uzun süre otoklavlamayın</td></tr><tr><td>Metil 4-hidroksibenzoat</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>H5501</td><td>Diğer adı: TEGOSEPT</td></tr><tr><td>Nüfus kafesi</td><td>Flystuff ( http://www.flystuff.com/)</td><td>59-104</td><td></td></tr><tr><td>İnce naylon örgü</td><td>Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td><td>57-102</td><td>Toplama sepetini yaparken, sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için ağı şahin tüp kapağının açıklığından biraz daha büyük kesin</td></tr><tr><td>Dounce homojenizatör</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>D8938-1SET</td><td>Homojenizatörü buz üzerinde soğutun ve protein bozulmasını önlemek için kullanmadan önce soğuk lizis tamponu ile önceden durulayın</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli&nbsp;</td><td>Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td><td>4693132001</td><td>PBS, konsantre proteaz inhibitörü stok çözeltisi hazırlamak için kullanılabilir</td></tr><tr><td>Anti-HA agaroz boncukları</td><td>MBL uluslararası (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Kit ayrıca HA-peptid ve spin kolonlarını içerir</td></tr><tr><td>HA-peptid</td><td>MBL uluslararası (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>PBS ile 2 mg / ml'ye hazırlayın&nbsp;</td></tr><tr><td>Spin Column</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Spin kolonları kitin bir parçası olarak dahil edilmiştir</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td></td><td></td>BP26324</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Bilimsel (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Heptan Fisher</td><td>Bilimsel (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>H350-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td><td>AM9625</td><td>Kullanmadan önce nanosaf su ile 10X'ten 1X'e seyreltin</td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0724</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0730</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>P7626-1G</td><td>İzopropanol içinde 200 mM stok çözeltisi hazırlayın, ardından lizis tamponunda 2 mM'lik çalışma konsantrasyonuna seyreltin</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>15 ml'lik tüpler</td><td>USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır suyu</td><td>Clorox markası</td><td></td><td>%50 çamaşır suyu 50 ml'lik tüpler yapmak için eşit hacimde nanosaf su ile seyreltin</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Üst katman elek</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1AK</td><td></td></tr><tr><td>Alt katman elek</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1BA</td><td></td></tr></tbody></table>

bir in vivo</emŞu protein kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım drosophila embriyolar

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Pek çok hücresel süreçleri multisubunit protein kompleksleri tarafından kontrol edilir. Sıkça bu kompleksler geçici oluşturmak ve birleştirmek için doğal bir ortam gerektirir. Bu nedenle, bu işlevsel protein kompleksleri tespit etmek için, hücre lizizi ve daha sonra saflaştırma daha önce in vivo olarak bunları stabilize etmek için önemlidir. Burada Drosophila embriyolardan büyük niyetli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, hücre zarını kolayca geçebilir formaldehit düşük bir konsantrasyonu kullanılarak in vivo çapraz bağlama ile embriyoların içine komplekslerin embriyo nüfuziyet ve stabilizasyon dayanmaktadır. Daha sonra, ilgilenilen protein kompleksi jel geçirilmiş, ardından arıtma ve kütle spektrometresi ile analiz edilir İmmüno. Bu tohum çizgisi gelişimi için gerekli olan bir Tudor protein kompleksi, saflaştırılmasını kullanarak bu yöntemi örneklemektedir. - Küçük Tudor birden Tudor etki alanı içeren büyük bir proteindirHedef proteinlerin metillenmiş arginines veya lisin ile etkileşim modülleri. Bu yöntem, farklı organizmalardan ve dokulardan yerli protein komplekslerinin izolasyonu için uyarlanabilir.

Western blot ve ardından (Şekil 1 &#39;de gösterilen)% 7 aşama jel (Şekil 2) -, çapraz bağlanma etkinliği ve çapraz bağlanmış Tud protein kompleksinin başarılı bir saflaştırma% 3 üzerinde SDS-PAGE ile analiz edildi. % 3 kullanmanın amacı, -% 7 adım jel kompleksinin geri kalan çapraz bağlanmamış Tud protein ve konsantrasyondan Tud çapraz bağlanmış protein kompleksinin etkili ayrılmasına dayanmaktadır. Yukarıda sözü edilen in vivo eden çapraz bağlama ...

Çok bileşenli protein kompleksleri hücre fonksiyonu ve gelişme sırasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada çapraz bağlayıcı in vivo daha sonra yapı-işlev analizi için çapraz bağlı kompleksler, ardından arıtma ardından Drosophila embriyolardan yerli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder.

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vivo çapraz bağlama yaklaşımı kullanarak canlı drosophila embriyolarından protein kompleksleri elde etmektir. Bu işlem, öncelikle binlerce sineğin bir popülasyon kafesine yerleştirilmesi ve erken evre embriyoların toplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, proteinler in vivo ortamda formaldehit ile çapraz bağlanır ve böylece dahili protein kompleksleri stabilize edilir.Ardından, protein komplekslerinin immünopresipite edilebilmesi için çapraz bağlanmış embriyolardan protein ekstraktları hazırlanır. Sonuçlar, izole edilen protein komplekslerini Western blot analizi ile tanımlar. Bu tekniğin, protein komplekslerinin in vitro yaklaşımlarla geleneksel izolasyonu gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, bu in vivo yaklaşımın, geleneksel in vitro yöntemlerle tespit edilemeyebilecek, geçici ancak fonksiyonel olarak anlamlı protein-protein etkileşimlerini yakalamamıza olanak tanımasıdır.Tekniği, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Min Gao uygulamalı olarak gösterecek. İlk olarak, suyu ve sinek agarını manyetik karıştırıcı ile karıştırın. Bu karışımı otoklav işlemi sırasında sterilize edin.Sükrozu elma suyuna karıştırın ve bir plaka üzerinde

an-vivo-crosslinking-approach-to-isolate-protein-complexes-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz belirli genotipler Drosophila embriyolar "fileto" hazırlıkları üretmek için akıcı bir protokol açıklar. Bu protokol, genetik ekranlardan çeşitli verimli bir şekilde yürütülmesini sağlar. Aynı zamanda geç embriyo yapıları mükemmel görselleştirme sağlar.

VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil...

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

Biz yaşayan organelleri yoğunluğu ile ayrı bir metodu...

In-vivo Drosophila Embriyolar Santrifüj

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Bu protokol Proximity ligasyon Testi Drosophila larva nöromüsküler kavşakta yerinde protein-protein etkileşimleri tespit etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Bu teknikle, Diskler, büyük ve Hu-li tai shao postsinaptik bölgede bir kompleks, daha önce birlikte immunoprecipitation ile tespit dernek kurma gösterilmiştir.

Algılama In Situ Protein-protein kompleksleri Drosophila Larva Nöromüsküler Junction

Bu protokolün amacı , orta derecede (0.5-1 g) Drosophila embriyolarının toplanması ve afinite saflaştırması-kütle spektrometresi (AP-MS) gibi protein proteini uygulamalarında kullanılabilen protein ekstraktlarının hazırlanması için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlamaktır ).

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Öğrenin, Drosophila embriyolarından in vivo çapraz bağlama ile protein komplekslerini izole etme yöntemini. Bu teknik, hücresel fonksiyonlar için kritik geçici protein etkileşimlerini yakalar.

Bir In vivo Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Daha fazla video keşfet