Name: Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan cihazlarda tek nöron dizileme ve plazma desenleme yöntemleriyle birbirine bağlı nöronal ko-kültürler hazırlamayı. Bu teknik, minimal hücre girdisiyle yüksek verimli sinirbilim araştırmaları yapılmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar SEM görüntüleme için SU-8 üretimi ve Maria Becker (ISAS) Ulrich Marggraf (ISAS) müteşekkiriz. Araştırma mali Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), bir Bundesministerium für Bildung und Forschung hibe (Bmbf 0101-31P6541) tarafından ve Ministerium für Yenilik, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen tarafından desteklenmiştir. Heike Hardelauf sayesinde Uluslararası Leibniz Enstitüsü &quot;Systems Biology Lab-on-a-Chip&quot; mali destek için.

Protokoller nörologlar için tasarlanmıştır, ve Şekil 2&#39;de özetlenmiştir. Gibi ticari ya da kurumsal tesisler için dış kaynaklı olduğunu PDMS çoğaltma için kullanılan SU-8 ustaları bu mikroimalat tavsiye ederiz. İki katman maskesi tasarımları Kimya sitesinde 12 Royal Society hakkında ek bilgi (ZIP) olarak serbestçe kullanılabilir. Önemli olarak, birinci tabaka, SU-8 2,5-3,0 um derinliğe kadar imal edilmiştir ve 25-30 um&#39;lik bir derinliğe kadar ikinci olmalıdır. Bu etkili nöron arraying için gerekli temel boyutları vardır. 3 mikron veya açısal nöronlar iki bölme 12 arasında taşınan veya göç önlemek için de gereklidir. PDMS&#39;nin 1. Mikroakışkan Cihaz Çoğaltma <ol><li> 10:1 &#39;lik bir oranda sertleştirme maddesi (184) ile iyice karıştırın PDMS prepolimer ve tipik olarak 20 dakika boyunca bir vakumlu desikatör içinde edilen karışım gaz çıkışına. Alternatif olarak, karışımı koymakbir 50 ml Falcon tüpüne ve düşük g kullanımı ture Gaz çıkışı için santrifüje. </li><li> 80 ° C ocak üzerinde 2 katmanlı mikrostrüktür SU-8 gofret yerleştirin ve gofret üzerindeki her bir aygıta polimer çerçeveleri hizalayın. ≥ 5 mm derinliğe çerçeve içine dökün ve PDMS&gt; 1 saat tam sertleşmesini sağlamak için ısı sağlar. </li><li> Tedavi kez, ocak gelen gofreti çıkarın ve düz bir yüzey üzerinde soğumasını bekleyin. </li><li> Nazikçe ödül gofret çerçeve ve PDMS için sert bir neşter ile (uzakta SU-8 mikroyapılarda itibaren) bir köşesinden koruyucu gözlük ve iş giyin. </li><li> Çerçevesinden PDMS kalıp kaldırmak ve aşırı PDMS&#39;nin cihaz Döşeme bir makas kullanın. PDMS ince bir film polimer çerçeve ile gofret yüzeyi arasında yayılır, bu sözde yanıp sönen sıklıkla üretilir. </li><li> Kalan PDMS tüm gofret uygulanır ve depolama sırasında gofretin korumak için tedavi edilebilir. Önceki sonraki cihaz kalıplama bu kaldırmak ve bunu yaparken herhangi bir p kaldırınyüzeyinden kirletici ifade. </li></ol> 2.. Cihaz Montaj ve Arabağlantı <ol><li> 3 mm çaplı biyopsi yumruk kullanarak 6 arayüzü liman hazırlayın. Iyi ışık koşullarında ve mikroakışkan kanalları ile limanların uyum yardım için yukarı bakacak mikrostrüktürlü özelliklere sahip, karanlık bir yüzey üzerinde çalışın. </li><li> Partiküller için aygıtı kontrol edin. Tersinir yapışkan bant kullanarak bu çıkarın. </li><li> , Bu esnek bir tabanı üzerine PDMS-sertleştirme ajanı karışımının (10:01, 601) küçük bir hacmi (~ 0.5 mi) dökülerek hazırlanır: mikroakışkan devresi, bir cam lamel üzerine monte edilen bir ince PDMS tabaka kullanılarak kapsüllenmiştir bakteriyolojik dereceli Petri. Yavaşça, PDMS tabakası üzerine bir lamel basarak birkaç dakika için ocak ve termal kür üzerine yerleştirin. Çabuk soğutulduktan sonra, Petri kabı lamel PDMS bilayeri kesip ödül için bir neşter kullanabilirsiniz. Gerekirse makasla kesin. </li><li> Plazma bağ PDMS cihazıve iyi bir sızdırmazlık üretmek için destek katmanı: Optimum koşullar alet özeldir. Örneğin, 40 saniye boyunca 0,2 mbar oksijen atmosferinde 70 W ve 40 kHz&#39;de çalışan bir plazma fırın mükemmel bir PDMS-PDMS bağı oluşturur. Plazma tedavi kez, her iki parçayı bastırarak ve tam bağ için bir dakika bırakın. </li><li> Pompaları ve şırınga ile arayüzü için silikon tüp (3,2 mm OD 1,6 mm ID) kullanın. </li></ol> 3.. Biyomateryal desenlendirilmesi mikroakışkan İşlemleri In situ biyomateryal modelleme, nöron kültür ve akışkan tedaviler için protokoller, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2.. Illustrated mikroakışkan protokolleri. A) PL ve PLL-PEG-g-yapıya model verme; hücre yapışma tabakasının ilavesi (örn.,PL, yeşil), buharlaşma hizalanmış su maskeyi B) maruz PL Atmosferik hava plazma tedavisi üreten.; İki anten pin. C) PBS aspirasyon ile (mavi) ile yıkama PLL-PEG-g PL. D) Delivery (kırmızı ile plazma ile muamele edilmiş bölge kontamine olmasını önlemek için kullanılan pembe bir yıldız ile gösterilen plazma giriş anten ile kullanılır, ) kaplamak için aspirasyon plazma tedavi bölgeler E) Hücre yükleme ile.; aspirasyon hem komşu bölmelerin nöronların eşzamanlı microfluidic arraying, bir hidrostatik tahrikli akış G) İzole akışkan tedaviler kullanılarak F) medya (pembe) perfüzyon.; Bir test maddesi (siyah) çevresel tedavi aspirasyon ve aspirasyon ile alt merkez girişinden verilen H), merkezi işlemi ile alt yan girişten verdi. Şekil ve efsane Kimya Royal Society izni ile yeniden(RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> PDMS mikroakışkan kanalları yapıştırılarak hemen ardından plazma (temas açısı ≤ 5 °) derece hidrofilik vardır. Bu tip yüzeyler örneğin farklılaşmış insan SH-SY5Y nöron benzeri hücreler gibi hücre hatlarının yapışması ve kültürü için uygundur. Birincil nöronlar ve bu Lund mezensefalik insan hücre hattı (LUHMES), bir poliamin kaplama, polilisin (PL) veya poliornitin (PO) ya da ön-madde olarak nöronal hücre çizgilerinin kültürünün ex vivo kültür, bir elektrostatik çapa olarak gereklidir. Buna ek olarak bu, laminin ve fibronektin gibi yapışma proteinleri sıklıkla integrin arabirim kaplama olarak gereklidir. Ancak, PL ve PO kaplamalar kolayca dizi sitelerine mikroakışkan teslim engelleyen ve aynı zamanda istenmeyen kayma gerilmeleri heybetli, nöronlar bağlamak. Bu sorunu çözmek için-çip biyomateryaldesenlendirme tuzak siteler ve akıbet mikrokanalların de yapışma malzemeleri lokalize için gereklidir. Bu, aynı zamanda ara bölmesi bağlantılarının gelişimini teşvik eder ve yerel dolanması azaltır. Bu protokol, aynı zamanda proteinler ve nöronlar uzun kültür sırasında istenen yerle sınırlı olduğundan emin olmak için, komşu bölgelere PEG maddelerin eklenmesini içerir. Aşağıdaki protokol, Şekil 3 belgelenmiştir: <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3.. Su plazma neticede tarafından biyomalzeme desenlendirme için maskeleme. A) PDMS micropillars plazma neticede yerinde su menisküs çivileme ile su maskeleme sürecinin İllüstrasyon. Düşey düzlemde menisküsün eğrilik ihmal edilmiştir. B) su maske menisküs p kırmızı bir boya ile görüntülenmiştir ve konumlandırılmışprotein plazma neticede. D sonra görüntülü atış. C) desenli PL-FITC kaplama) eklenmesi plazma desenli PL-FITC kaplama reddeden ve hücre itici PLL-g-PEG-TRITC. Bu SH-SY5Y hücrelerinin kayıt için ve aynı zamanda LUHMES hücreler için ek bir katman fibronektin desenlendirme için kullanılmıştır. Şekil ve Kimya Royal Society (RSC) izni ile yeniden efsane 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <ol><li> Plazma neticede tarafından In-situ Biyomateryal Desenlendirme Su maskeleme <ol><li> Kısa bir süre sonra, plazma yapıştırma pipet orta alt bağlantı noktasına PL ya da PO (100 ug / ml içinde 1 x PBS) içinde bir 0.5 ul hacim. Birkaç saniye içinde tüm mikroakışkan devre kılcal hareket ile doldurulur. Birkaç dakika bekletin Polya ile tam kat hidrofil PDMS yüzeyler içinmayın. </li><li> 1 dakika boyunca (Şekil 2C bakınız) 1x PBS ile aspirasyon odaklı yıkanarak bağlanmamış poliamin molekülleri çıkarın. </li><li> Bağlantı noktaları tüm PBS çıkarın ve bir mikroskop ile aydınlatma aygıtı ısı. Bu hızlı su maske oluşumu için limanlarından buharlaşmayı artırır. Su maskesi (Şekil 3A&#39;da gösterilmiş ve Şekil 3B&#39;de belgelenen) ~ 5 dakika içinde kurulur. </li><li> Su maskeleme tamamlanmasını sağlamak üzere mikroskobu ile cihazı kontrol edin. Dizi sitenin üst rezervuar yapılar su maskesi (~ 15 dk) istikrarı uzatmak için maske tasarımı dahil unutmayınız. </li><li> Limanlar (Şekil 2B) içine paslanmaz çelik işaretçilerine yerleştirin. Bu boş mikroakışkan kanal içine 19,20 (2 MHz, 30 kV sinyal faaliyet, örneğin), atmosferik basınçta bir çift elle tutulan korona deşarjı ya da Tesla üreteci tarafından üretilen plazma için kullanılır. T ucu Noktao bir pim ve plazma ucuna yakın bir kaynak ≤ 1 saniye Mikrokanallı tedavi plazma. Plazma modelli gözlemlemek için düşük ışık koşullarında kullanın. </li><li> Bir yıkama kademesinden ile su maskeyi çıkarın. Üst 3 limanlardan paralel aspirasyon kullanın. Paralel aspirasyon ulaşmak için bir aspirasyon pompası 4-yollu bir adaptör ile bağlı silikon tüp 4 eşit uzunlukta kullanın. Aspirasyon başlatın ve mikroakışkan devre boyunca PBS çizmek için alt 3 liman içine PBS dağıtmak. Bu şekilde, bir PDMS-poliamin kontrast madde (Şekil 3C) üretilir. Mikroakışkan devreden PBS boşaltın ve yerli, hidrofobik durumunu geri yüklemek için birkaç saat bekletin. Bu hücre yapışması PDMS tam geçirgen olmayan işler. </li><li> Bu, laminin ve fibronektin gibi ek yapışma malzemeler, aşağıdaki adımlar hemen su maskenin kaldırılmasından sonra, gerekli olan ve yapılmalıdır ihtiyaç olmalıdır: Pipet greft kopolimerdir poli-L &#39;lik bir hacmi, 10 ul- Lizin-poli (etilen glikol) (PBS içinde PLL-PEG-g, 100 ug / ml) hem de alt yan kanal içine, 2 dakika boyunca, üst yan kanallarından aspirasyon ile izledi. </li><li> Akışını kesintiye uğratmadan, bir PBS tamponu ile değişimi ile aşırı PLL-g-PEG kaldırın. PEG ünitesi protein adsorpsiyonu ve hücre yapışmasını önlemek için hareket 17,21 ile bu kat seçici olmayan poliamin kaplı bölgeleri. </li><li> Bu, laminin ve fibronektin gibi yapışma proteinleri, daha sonra poli-amin kaplama ile ko-lokalize edilmiş olabilir: Bu ECM proteinleri (tipik olarak 10 ug / ml) pipetle 10 ul hacimli üç alt bağlantı noktalarına. Aygıt protein çözeltisi ile doldurulmuş ve kaliteli bir kaplama elde etmek için 1 saat boyunca inkübe kadar ilk üç limanlardan aspire. </li><li> Taban 3 limanlardan PBS aspire fazla proteinleri çıkarın. </li></ol></li><li> Mikroakışkan Tek Nöron arraying <ol><li> ÖDENEK ile Başbakan cihazlarmedya yedik. Alt 3 limanlarına 20 ul birimler eklemek ve üst üç limanlarından paralel aspirasyon hızla medya ile mikroakışkan devresini doldurun. Bir aspirasyon pompası eşit uzunlukta silikon tüp aracılığı ile çift için bir 4 yollu hortum konnektörü 3 üst bağlantı noktaları kullanın. </li><li> (Şekil 1 &#39;de 0,) yan giriş delikleri her birine bir ayrıştırılmış hücre süspansiyonu 20 ul (1 x 10 6 hücre / ml) ilave edin. </li><li> Bir akış regülatörü ile bir aspirasyon pompası donatmak veya üst 3 limanlarından nazik aspirasyon için bir şırınga kullanın. Komple nöron arraying tipik olarak 1 dakika gerektirir. </li><li> Sonraki mikroakışkan cihazlarda arraying için bir pipet ile 4 yan bağlantı noktası kalan nöronlar fazla hasat. </li><li> Boru çıkarın. Medya ile tüm portları doldurun ve inkübatör cihazı yerleştirin. Birkaç saat içinde hücreler, biyo materyal desen tamamen yapışkan hale gelir. </li></ol></li><li> Nöron Kültürü, Seçici Fluidic Tedavi ve Immunostaining <ol><li> Hidrostatik yem (2 mm kolon yükseklik farkı uygun şekilde yavaş olduğu) kullanarak periyodik perfüzyon ile medya değişimi. </li><li> Alternatif olarak, standart hücre kültürleri gibi (2-3 gün) periyodik medya alışverişi, medya mikroakışkan cihaz daldırın. </li><li> Aşağıdaki gibi nöron kültür bölmesinde veya merkezi nörit gelişimi bölmesine ya da tedavi için seçici akışkan elde edilir: ilgi kanalın alt portuna test maddesi 20 ul dağıtın ve hemen yukarıda limandan aspirat. Uzun süreli tedavi, bir akış düzenleme cihazı kullanıldığında akış oranını azaltmak ve gerektiği gibi test maddesini doldurmak için. </li><li> Immün protokoller her bir moleküler hedef ve bağlantılı reaktifler için değişir. Yavaş bir akış hızı kullanıldı nöronlara kesme kaynaklı hasar riskini karşı için. Bu, normal protokol kez uzanan tam sistem perfüze edilmesi için artan uygulama süresi ile sonuçlanır. Hy(2 mm örneğin) farklı sütun yüksekliği ile bağlantı noktalarını kullanarak drostatic perfüzyon reaktifleri teslim etmek için kullanılmıştır. Bir pompa kullanılarak Daha hızlı reajan ilave etme ve çıkarma deneysel zaman ölçekleri azaltmak için kullanılabilir. Alt 3 limanlarından reaktifleri çizmek için üst 3 portlarına bir aspirasyon pompası bağlayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+control+of+neurite+development+by+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Local control of neurite development by nerve growth factor.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).</li>
<li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sympathetic+neurons+in+compartmentalized+cultures.+I.+Local+control+of+neurite+growth+by+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor.</a> Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research.</a> Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).</li>
<li>Kilinc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian-like+degeneration+of+central+neurons+after+synchronized+and+geometrically+registered+mass+axotomy+in+a+three-compartmental+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotox.+Res%22%5BJournal%5D)">Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip.</a> Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+and+multifactor+involved+assay+of+neuronal+regeneration+after+chemical+injury+in+an+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics.</a> Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).</li>
<li>Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-optical+microfluidic+platform+to+study+injury+and+regeneration+of+single+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons.</a> Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).</li>
<li>Hellman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+axonal+injury+and+regeneration+in+micropatterned+neuronal+culture+using+pulsed+laser+microbeam+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection.</a> Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).</li>
<li>Kunze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-pathological+connected+primary+neurons+in+a+microfluidic+device+for+Alzheimer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).</li>
<li>Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chamber+for+analysis+of+neuron-to-cell+spread+and+axonal+transport+of+an+alpha-herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus.</a> PLoS One. 3 (6), (2008).</li>
<li>Markus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-Zoster+virus+%28VZV%29+infection+of+neurons+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Direct+demonstration+of+axonal+infection%2C+transport+of+VZV%2C+and+productive+neuronal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection.</a> J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).</li>
<li>Dinh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+construction+of+minimalistic+neuronal+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures.</a> Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).</li>
<li>Tan, W. H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trap-and-release+integrated+microfluidic+system+for+dynamic+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).</li>
<li>Frimat, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li>
<li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+enzyme+concentrations%2C+kinetics%2C+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+network+formation+assay%3A+A+spatially+standardized+neurite+outgrowth+analytical+display+for+neurotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening.</a> Lab Chip. 10, 701-709 (2010).</li>
<li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fidelity+neuronal+networks+formed+by+plasma+masking+with+a+bilayer+membrane%3A+analysis+of+neurodegenerative+and+neuroprotective+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes.</a> Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).</li>
<li>Whitesides, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+stencilling+methods+for+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Plasma stencilling methods for cell patterning.</a> Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).</li>
<li>Huang, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28L-lysine%29-g-poly%28ethylene+glycol%29+layers+on+metal+oxide+surfaces%3A+surface-analytical+characterization+and+resistance+to+serum+and+fibrinogen+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption.</a> Langmuir. 17, 489-498 (2001).</li>
<li>Li, N., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+topographical+and+biochemical+cues+by+axons+during+growth+on+microfabricated+3-D+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates.</a> Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).</li>
<li>Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+particle+separation+through+deterministic+lateral+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Continuous particle separation through deterministic lateral displacement.</a> Science. 304 (5673), 987-990 (2004).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+nanoparticle+functionality+and+toxicity+on+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system.</a> J. R. Soc. Interface. 7, (2010).</li>
<li>Brenneman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+olfactory+transport+of+inhaled+manganese+%28%28MnCl2%29-Mn-54%29+to+the+rat+brain%3A+Toxicokinetic+investigations+in+a+unilateral+nasal+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).</li>
<li>Magalães, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+neuritic+transport+of+scrapie+prion+protein+coincident+with+infection+of+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells.</a> J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).</li>
<li>Diogenes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+alpha-synuclein+oligomers+modulate+synaptic+transmission+and+impair+LTP+via+NMDA-receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation.</a> J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).</li>
<li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Mikroakışkan arraying teknik minimalist kültürleri kurulması için hassas tek bir nöron kullanım sağlar türünün ilk. Mikroakışkan yapılarla hücre desen hizalamak için in situ biyomateryal-yapıya model verme yöntemi, güçlü bir yaklaşım ile birleştiğinde, bu minimalistik kültürler azaltılmış yerel dolanması ile yüksek düzeyde intercompartment bağlantısı vardır. Basit bir tasarım değişiklikleri görselleştirme ve kantitatif analiz için tek tek aksonlar izole etmek için bir potansiyele sahip olan bu özellikl...

<html> Nöronal doku oldukça karmaşıktır; uzaysal hücre kişiler ve özellikle akson ve dendrit çıkıntılar aracılığı ile tanımlanan katmanları ve bölmeler içinde ve plastik bağlantı ile sipariş heterojen bir hücre karışımı. Yeni teknikler derin anlayışlar ve hastalık, gelişme ve sağlıklı fonksiyonu merkezi unravel mekanizmaları kazanmak için daha fazla deneysel özgürlüğünü engellemediği için gereklidir. Campenot odası 1,2 ve daha yakın zamanda mikrofabrike düzenlemeleri 3,4 seçici olarak farklı somatik popülasyonları karıştırmayı ve aynı zamanda nörit çıkıntılar yeteneği ile ağ nöronal ko-kültürler ex vivo hazırlanması için kullanılabilir. Bu mikroakışkan cihazlar, örneğin kimyasal 5,6 ya da lazer axotomy 6-8, tauopathy 9, viral yayılması 10,11 ve akson 4 mRNA lokalizasyonu aşağıdaki akson dejenerasyon ve rejenerasyon incelemek için kullanılmıştır. ent &quot;&gt; Neurobiologists ulaşmak uzatmak için, teknolojik gelişmeler minimalist nöronal co-kültürler hazırlamaları gerekmektedir. Bu, tek hücre ve hücre altı hassas sistemin soruşturma için nöronal ağ çözülmesini sağlar. Minimal hücre sayıları için gereklilik, Parkinson hastalığı, kulak spiral gangliyon, periferik dopaminerjik nöronlar için ilgili substantia nigra hücreleri dahil seyrek hücre tipleri, analiz etmek ve kök hücreler imkanı açar. Bunun ötesinde, hücresel ekonomi 3R&#39;si girişimi alakalı. Bu mikroakışkan platformları, büyük ölçekli toksisite ekranları veya diğer yüksek verim kullanma, hayvan nöronlar gerektiren veri zengin deneysel serisi şimdi kabul edilebilir. Bu yazıda mikroakışkan cihazın imalatı ve kullanılması için protokolleri açıklanmıştır. In situ biomateri bir kombinasyon halinde mikroakışkan arrayingal desenleme yöntemi minimal hücre numaralarını kullanarak son derece birbirine bağlı nöronal ortak kültürlerin kayıt için kullanılabilir. Mikroakışkan arraying bir diferansiyel akış yaklaşım mikro yapılı pnömatik gevşetmeli bir yapı trans devresi (Şekil 1 &#39;de SEM görüntüleri ile birlikte gösterilmiştir) içinde yer alan bu sayede 12-15, dayanmaktadır. Nörit gelişimi kanal girişleri - yol 0 1 → mikrostrüktürlü delik doğrusal bir dizi nöronlar taşınması için alt akışkan bir direnç (R2&gt; R 1) sahiptir. Tek bir hücre tarafından tuzak doluluk yerel komşu tuzakları sonraki hücreleri yakalama için akıcılık aktarmak akışını engellemektedir. Dizideki tuzakları tam doluluk fazla nöron uzaklaştırılması için işlemin bir bypass moduna üretmek için kavisli bir yolda (0 → 2) içine akıcılık aktarmak için akışkan oranını (R 1&gt; R 2) geçer. Şekil 1.. Mikroakışkan Devre. Nörit gelişimi kanalları ile birbirine kültür odaları sınırdaş olan tek nöron arraying A) diferansiyel direnç akışkan devresi,. B, menisküs iğneleme micropillars ile iki tabakalı bölümlere nöron ko-kültür dizinin C) SEM görüntüleri. Bu tasarım sayesinde, trident şeklinde nöron hapsi yapılar nörit çıkıntılar fasikülasyon teşvik etmek için kullanılmıştır. Şekil ve Kimya Royal Society (RSC) izni ile yeniden efsane 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> Düzlemsel alt-tabakalar üzerinde micropatterned nöronal ağların hazırlanması kolayca exampl için (elde edilebilir<html> Bizim gruptan es, Frimat vd. 16 ve Heike ve diğ. 17) bkz. Ancak, PDMS cihazlar içinde ve microfluidic kanalları bu mikrometre çaplı uyum şartı ile biyoaktif malzeme desen özetleyen bir büyük bir teknik sorun teşkil etmektedir. Bölüm 3.1 &#39;de bir protokol in-çip ya da in situ olarak, biyo-malzeme desen hazırlanması sunulmuştur. Bu desenler uzun kültür timescales sırasında nöron kayıt etkinleştirmek ve bölmeler arasında çıkıntılar teşvik. Menisküs-çivileme mikro nöron siteleri ve nörit gelişimi kanalları arraying ile adlandırılan bir su maske hizalamak için kullanılır. Maruz kalan yüzeyleri, biyo materyal bir modelin oluşturulması için parçalandı oysa su maskesi, plazma muamelesi esnasında yapışma molekülü kaplamalar korur. Buna ek olarak, protokoller, hücre kültürü için ve farklı ko-kültür bölmelerin seçici tedavisi için gerekli olan akışkan izolasyonu için temin edilmiştir. ve_content &quot;&gt; protokoller Benzer şekilde, yerinde biyomalzeme desenleme buharlaşma ve yüzey gerilimi olayları istismar, basittir. poli çoğaltma (dimetilsiloksan) (PDMS) mikroakışkan cihazlar 18 için yumuşak litografi kullanıcı dostu ilkelerini güçlendirmek için tasarlanmıştır ve yalnızca ucuz bir el plazma kaynağı gerektiren. microfluidic devre bu operasyonları yapma etkili programlar hücre yükleme ve kompartman spesifik tedaviler sadece doğru alt portuna maddelerin dağıtımı ve yukarıdan aspire meselesi. Bu şekilde, bu neurobiologists vermek için tasarlanmıştır kendi laboratuarlarında microfluidic cihazlar hazırlamak ve kullanmak için özgürlük.

<table><tbody><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Elastosil RT 601</td><td>Wacker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lameller</td><td>VWR</td><td>630-1590</td><td>130-160 mm kalınlığında</td></tr><tr><td>3 mm biyopsi zımbaları</td><td>Kai Medical</td><td></td><td>Dikkatli sap - son derece keskin</td></tr><tr><td>Tygon hortum</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-50-HL</td><td>1.65 mm ID; 3.35 mm OD</td></tr><tr><td>1 ml şırınga ( Inkjekt ve Omnifix)</td><td>Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>4 boru konnektörü</td><td>VWR veya Fisher Scientific Akış</td><td></td><td></td></tr><tr><td>regülatörü</td><td>Harvard Aparatı</td><td>722645</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm pimler</td><td>Terzilik Bölümleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>Depolamada stabilite bir sorun olabilir</td></tr><tr><td>poli-D-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Polilizin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3069</td><td></td></tr><tr><td>Poliornitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Ters floresan mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Örnek aspirasyon pompası</td><td>KNF Neuberger, Laboport</td><td>N811KVP</td><td></td></tr><tr><td>El tipi korona deşarj cihazı</td><td>Leybold-Heraeus, ABD</td><td>VP23</td><td>Ülkenizin güvenlik standartlarına uymayabilir</td></tr><tr><td>Femto plazma fırını</td><td>Diener Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu dessikatör veya santrifüj</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tek hücre hassas nevronik co-kültürler hazırlanması

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Campenot odasının mikrofluidik düzenlemeleri nörobilim eden büyük ilgi çekmiştir. Bunlar birbirine ko-kültür platformları enfeksiyon ve hastalık yayılması için gelişimsel ve fonksiyonel nörobiyoloji kapsayan, çeşitli sorular araştırmak için kullanılabilir. Ancak, geleneksel sistemleri önemli hücresel primer dopaminerjik substantia nigra, spiral ganglionlar ve Drosophilia melanogaster nöronlar gibi düşük bolluk hücrelerini inceleyerek yetersiz girdileri (bölmesi başına binlerce), ve yüksek verimlilik deney için pratik gerektirir. Kültürler de son derece yoğun yerel olarak iki kültür birbirine az çıkıntılar (&lt;% 10) ile, dolanmış edilir. (I) microfluidic tek nöron yöntemi arraying ve plazma desenlendirme biyomateryal kaplamalar REGI için (ii) bir su maskeleme yöntemi: Bu yazıda basit mikroakışkan ve desenlendirme protokoller bu sorunları ele tarif edilmiştirnöronlar ster ve bölmeler arasında gelişimini teşvik eder. Minimalistik nöronal ko-kültürler yüksek düzeyde (&gt; 85%) intercompartment bağlantısı ile hazırlandı ve tek bir hücre hassasiyet ile yüksek verimli neurobiology deneyleri için de kullanılabilir.

Su maskeleme patlatır yüzey gerilimi. Hava-sıvı arayüzünde basınç tolerans [eğrilik yarıçapına sahip ters terazi <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , Mikroakışkan boyutlarda son derece kararlı arabirimleri üreten. Micropillars etkin yerinde su maskesi çapa. Su maske oluşumu ısıtma artmış oranı ile, mikroakışkan limanlardan buharlaştırma ile tahrik edilir. Düşük büyütme (4X - 10X) gelen ısı kullanılarak mikroskop aydınlatma, su maske tipik ≤ 5 dakika içinde kurulması oldu...

Tek bir nöron mikroakışkan arraying ve biyomalzeme kaplamaların içinde-çip plazma desenlendirme için su maskeleme için protokoller anlatılmıştır. Yüksek birbirine eş hücre kültürleri en az girişler kullanılarak hazırlanabilir.

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Bu prosedürün genel amacı, bağlantılı bir nöronal ko-kültür hazırlamak için tekil nöronları iki mikroakışkan bölmeye dizmektir. Bu işlem, öncelikle mikroakışkan cihazın PDMS ile replika kalıplama yöntemiyle üretilmesi ve cihazın plazma bağlama ile kapsüllenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, mikroakışkan cihaz içerisinde polilizin desenlemesidir.Bu işlem, cihazın polilizin ile doldurulması, evaporasyon yoluyla bir su kütlesinin oluşmasına izin verilmesi ve ardından biyomalzeme desenini oluşturmak için açıkta kalan polilizini uzaklaştırmak amacıyla plazma işlemi uygulanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, tekil nöron dizilimi için nöronları mikroakışkan devre üzerinden aspire etmek üzere bir şırınga kullanın. Nörit çıkıntılarının uzaması ve iki nöron popülasyonunu birbirine bağlaması için cihaz doku kültürü inkübatörüne yerleştirilir.Son adım, nöronal devre içindeki materyallerin ve patolojinin yayılımını izlemek ve seçili bir bölmeyi tedavi etmek için bir aspirasyon pompası kullanmayı içerir. Prosedür, Yayu Chang ve ISIS laboratuvarından sarada tarafından gösterilecektir. Bu tekniğin, ticari olarak mevcut olan PDMS bileşen odaları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nöron ko-kültürlerinin, bireysel nöral algoritmaların analizi için tek hücre konumlandırmasıyla hazırlanmış olmasıdır.Bu yöntem, nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, Alzheimer hastalığında hiperfosforile tau agregatlarının yayılımının altında yatan mekanizma nedir veya enfekte organizma beyin boyunca nasıl yayılır? Teknik, her deneysel koşul için yalnızca birkaç yüz nöron gerektiğinden, yüksek verimli uygulamalar için oldukça uygundur.Prosedüre, PDMS ön polimerini kürleme maddesi ile 10'a bir oranında iyice karıştırarak başlayın. Ardından, karışımı vakumlu bir desikatörde tipik olarak 20 dakika boyunca gazdan arındırın. Daha sonra, iki katmanlı mikro yapılı SU-8 gofretini 80 °C'lik bir ısıtıcı plakaya yerleştirin ve polimer çerçeveleri gofret üzerindeki her bir cihazla hizalayın.PDMS'i çerçeveye dökün ve tam termal kürleşmeyi sağlamak için bir saat bekleyin. Kürleşme tamamlandığında, wafer'ı ısıtıcı tabladan alın ve düz bir yüzeyde soğumasını bekleyin. Ardından, koruyucu gözlük takılıyken, sert bir skalpel kullanarak çerçeveyi ve PDMS'i bir köşeden wafer'dan nazikçe ayırın.PDMS kalıbı çerçeveden çıkarın ve cihazı düzeltmek için bir makas kullanın. Saklama sırasında korumak amacıyla, kalan PDMS'yi tüm wafer yüzeyine uygulayın. Bu PDMS tabakası wafer üzerinden soyulduğunda, tekrarlanan PDMS kalıplama işlemine hazırlık amacıyla yüzeydeki tüm partikül kontaminantlar temizlenmiş olur.Şimdi, portların mikroakışkan kanallarla hizalanmasını kolaylaştırmak için mikro yapılandırılmış özellikler yukarı bakacak şekilde, üç milimetrelik bir biyopsi punch'ı kullanarak altı arayüz portunu hazırlayın. Cihazı partiküller açısından kontrol edin ve bunları geri dönüşümlü yapışkan bant kullanarak temizleyin. Ardından, Petri kabına az miktarda PDMS kürleme ajanı karışımı dökerek cam lamel üzerine monte edilmiş ince bir PDMS tabakası hazırlayın.PDMS tabakasının üzerine bir lamel bastırın. Isıtıcı plaka üzerine yerleştirin ve yaklaşık 10 dakika boyunca termal kürleme yapın. Soğuma işleminin hemen ardından, koruyucu gözlük takılıyken, lameli kaldırmak için bir skalpel kullanın.Cihazı kapsüllemek için Petri kabındaki PDMS çift katmanı kullanın. İyi bir PDMS-PDMS bağı gereklidir. PDMS çift katmanını ve mikroakışkan cihazı 40 saniye boyunca plazma fırınına yerleştirin.Plazma işlemi tamamlandıktan sonra, her iki parçayı birbirine bastırın ve tamamen yapışmasını sağlayın; plazma bağlamanın hemen ardından alt merkez portuna 0,5 µL polilizin pipetleyin. Tüm mikroakışkan devre, saniyeler içinde kılcal etkiyle dolmalıdır. Ardından, hidrofilik PDMS yüzeylerin polilizin ile tamamen kaplanması için birkaç dakika bekletin.Ardından, bağlanmamış polilizin aspirasyon destekli yıkama ile uzaklaştırın. Pompayı, eşit uzunlukta tüpler kullanarak üstteki üç porta bağlamak için dört yollu bir birleştirici kullanın ve aspirasyonu başlatın. Alttaki üç porta PBS ekleyin ve bir dakika boyunca yıkayın. Sonrasında, tüpleri ayırın ve portlarda kalan tüm PBS'yi uzaklaştırın.Sıvı maskesinin hızlıca oluşması için portlardaki buharlaşmayı artırmak amacıyla cihazı bir mikroskoba aktarın ve aydınlatma kullanarak ısıtın. Su maskelemesinin tamamlandığından emin olmak için cihazı mikroskopi ile inceleyin. Ardından, el tipi bir korona deşarj jeneratörü tarafından üretilen plazmayı boş mikroakışkan kanallara kuplajlamak için portlara paslanmaz çelik pinler yerleştirin.Plazma kaynağının ucunu bir pimin ucuna yakınlaştırın ve plazma uygulayın. Mikro kanala bir saniye boyunca işlem yapın. Ardından pimleri çıkarın ve üstteki üç portu pompaya bağlayın.Aspirasyonu başlatın ve alt üç porta PBS dağıtın. Bu işlem, PBS'nin mikroakışkan devre boyunca çekilmesini sağlayacaktır. Mikroakışkan devredeki tüm PBS'yi uzaklaştırın ve biyomalzeme desenlemesinin tamamlanması için gece boyunca bekletin.Burada desen, floresein ile etiketlenmiş polilizin kullanılarak görselleştirilmiştir. Bu işlemde, alt üç portun her birine 20 µL ekleyerek cihazı uygun medya ile hazırlayın. Ardından, mikroakışkan devresini medya ile hızla doldurmak için üst üç porttan paralel aspirasyon uygulayın.Yanlardaki alt portların her birine 20 µL disagrege edilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. Üstteki üç porttan nazikçe aspire etmek için bir şırınga kullanın. Neuron orang işleminin tamamlanması genellikle bir dakika sürer.Ardından, bir pipet kullanarak sonraki mikroakışkan cihazlar için portlarda kalan fazla nöronları toplayın. Bu örnek, nöronların tek hücre hassasiyetiyle nasıl dizildiğini göstermektedir. Bundan sonra, cihazı besiyerine daldırın ve hücrelerin birkaç saat içinde biyomalzeme desenine tamamen tutunmaları için cihazı inkübatöre yerleştirin.Normal kültürlerde olduğu gibi, nöron kültür bölmesini veya merkezi nöral çıkıntı bölmesini seçici olarak işleme tabi tutmak için besiyeri periyodik olarak yenilenmelidir. Test maddesinin 20 µL'sini, ilgili kanala bağlı olan alt porta aktarın ve doğrudan üzerindeki porttan aspire edin. Bu örnekte, merkezi bölmeye seçici bir işlem uygulanmıştır ve diğer örnekte ise yan bölmeye işlem uygulanmıştır.İşlemler bir dakika içinde kurulmuş ve 60 dakika boyunca sürdürülmüştür. Daha sonra, materyallerin veya patolojinin yayılımını ölçmek için nöron ko-kültürleri izlenebilir. Yöntem uzmanlık seviyesine ulaştığında, birçok mikroakışkan cihaz tek bir sabah içerisinde hazırlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, kendi laboratuvarlarınızda minimalist nöronal kültürlerin nasıl hazırlanacağı ve bunların beyindeki materyal ve hastalık yayılımının altında yatan mekanizmaları araştırmak için nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

preparation-of-neuronal-co-cultures-with-single-cell-precision

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video geç embriyo ve erken postnatal fare kortekste nöronal kültürlerin üretmek için bir prosedür gösterir. Bu kültürler immünsitokimya, biyokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum ve sodyum görüntüleme için kullanılan ve doğum sonrası ölümcül bir gen mutasyonu taşıyan transgenik hayvanlar nöronal geliştirme çalışması için bir platform sağlamak olabilir.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

In vitro MSS akson glia etkileşim araştırmaları için bir roman çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platformu geliştirdi. Platform altı paralel olarak bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahiptir ve yeni geliştirilmiş bir makro / mikro hibrid imalat yöntemi kullanılarak imal edildi.

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Burada kültür sıçan kortikal nöronların glial besleyici tabakasının varlığı için bir protokol sağlar. Kültürlü nöronlar polarite kurmak ve sinapslar oluşturmak ve glia elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme, hücre sağkalım deneyleri, immünhistokimya ve RNA / DNA / protein izolasyonu gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmak üzere ayrılabilir.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

Bu video, insan nöral progenitör hücrelerini (NPC'ler) nöronlara ayırmak için bir yöntem göstermektedir. NPC'ler, yerleşik bir fare astrosit-sıçan kortikal nöron ko-kültürüne tanıtılır ve NPC'nin nöronlara farklılaşmasını teşvik eder. Farklılaşma, hücrelerin konfokal bir mikroskop altında görüntülenmesiyle doğrulanır.

İnsan Nöral Progenitör Hücrelerini Nöronlara Ayırmak İçin Bir Ko-Kültür Tekniği

Bu video, bölümlere ayrılmış bir yaklaşım kullanarak dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmak için bir yöntemi göstermektedir. Bu kurulumda, nöronlar ve astrositler uzamsal olarak ayrılır, ancak şartlandırılmış bir ortamı paylaşırlar. Astrositler tarafından salınan nörotrofik faktörler, nöron farklılaşmasını ve sinaptik bağlantıların oluşumunu teşvik ederek nöron-glia etkileşimlerini düşündürür.

Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği

İnsan neuroprogenitor hücreleri (NPC) çoğalan koşullar altında genişletilmiştir. NPC nörotrofinlerin bir kombinasyonunun mevcudiyetinde nöron zengin kültürler içine ayırt edildi. Nöronal belirteçler immunofloresan boyama ile tespit edilmiştir. Nöron saf bir popülasyonu izole etmek için, NPC PEN membran slaytlar üzerinde farklılaştırılmış ve lazer yakalama mikrodiseksiyon uygulandı.

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Amperometrik tekniği spontan dopamin oksitlenmeye tarafından üretilen oksidatif akımı algılayarak tek bir hücreden dopamin salınımını ölçer. Eşzamanlı gerilim kelepçe ve amperometri metodolojisi dopamin taşıyıcısı ve dopamin ters taşıma Bu faaliyetin düzenleyici rolünün genel "faaliyet" arasındaki mekanistik ilişki bulunmaktadır.

Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü

Öğrenin, mikroakışkan cihazlarda tek nöron dizileme ve plazma desenleme yöntemleriyle birbirine bağlı nöronal ko-kültürler hazırlamayı. Bu teknik, minimal hücre girdisiyle yüksek verimli sinirbilim araştırmaları yapılmasını sağlar.

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Daha fazla video keşfet