Name: Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Öğrenin, farelerde orofarengeal LPS uygulaması ve bronkoalveoler lavaj ile konakçı immün yanıtını değerlendirme yöntemini. Bu teknik, akciğerlerdeki lokal inflamatuar yanıtları ve sitokin profillerini analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu proje için temel ve teknik destek sağlamak için veteriner tıp VA-MD Regional College teşekkür ederim. Bu çalışma NIH Kariyer Geliştirme Ödülü (K01DK092355) tarafından desteklenmektedir.

Tüm çalışmalar Virginia Tech için Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı altında ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, National Institutes göre yapılmıştır. 1.. Orofarengeal Yönetimi&#39;ni kullanarak LPS intratrakeal (it) Aşılama <ol><li> Her hayvan benzersiz bir kulak yumruk, kulak etiketi veya diğer kurumsal olarak onaylanmış bir yöntem kullanılarak tespit emin olun. </li><li> Bazal vücut ağırlığı ve her bir hayvan için vücut ısısını kaydedin. </li><li> LPS çalışma stok hazırlamak. Her fare, 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 mg / kg LPS, 50 ul bir doz alacaktır. Mock 1 x PBS ile tedavi edilmiş hayvanlar için 50 ul bir doz alacaktır. </li><li> Aşağıdaki damla yöntemiyle izofluran uygulama için uygun bir bölmeyi hazırlayın. Kurumsal kurallar initiat için izofluran ve diğer anestezik ajanların ve önceki kullanımına ilişkin değişiklikherhangi bir çalışma ing, kişilerin tüm esasların karşılandığı sigorta Hayvan Bakım / Refah onların kurumun Bölümü başvurmalısınız. Bırak yöntemi izofluran bir seçenek değilse, diğer anestezik ajanların kabul alternatiflerdir. <ol><li> Uygun bir güvenlik kabini içinde, 500 ml&#39;lik bir cam kaba altındaki bir katlanmış emici kağıt havlu ve yere izofluran, yaklaşık 3 ml uygulanır. </li><li> Kağıt havlu üzerine alüminyum folyo küçük bir parça koyun ve şeffaf bir kapak ile kabı kapsamaktadır. </li></ol></li><li> Bu aşılama sırasında yararlanılacak araçları ve reaktifler hazırlayın. Hayvanlar entübasyon standında baş güvenli olacak lastik bant yerleştirin. Bu işlem düz forseps bir çift, açılı veya kavisli bir forseps bir çift, ve ipuçları ile bir P200 pipet gerektirir. </li><li> Entübasyon standın yanında kolayca erişilebilir bir yerde pipet ve yerine yük LPS 50 ul. </li><li> Fare anestezisiizofluran odasına hayvan yerleştirilmesi ve şeffaf bir kapak ile odasını kaplayarak. Birinci odacık içinde yerleştirildiğinde, hızlı ve sığ olacak, hayvanın solunum şekilleri dikkate alınmalıdır. Nefes oranları genellikle odasında yerleştirerek 30 saniye içinde ulaşılır 1 nefes / 2 sn, yaklaştığınızda hayvan yeterince anestezi olacak. Drop yöntem izofluran ile onaylanan hayvan protokolü belirtildiği gibi fare anestezi olmalıdır. </li><li> Odasından anestezi fareyi çıkarın ve ön kesici dişler tarafından ayakta entübasyon üzerinde hayvan askıya. Hayvan güvenli ölçülü ve ağız ve dil erişilebilir olduğunu sigortalayın. </li><li> Yavaşça düz forseps ile dil sabitleyin. Açılı forseps ile dilini kavramak ve hafif bir direnç hissedene kadar yavaşça ağzından çekin. Bu eylem, epiglottis blok ve trakea erişmek için yeterlidir. </li><li> De dilini tutmayı sürdürürkenuzatılmış pozisyon, boğazın arkasına LPS&#39;nin 50 ul dozunu ve hemen bir eldivenli parmak ile hayvanın burun delikleri kapsamaktadır. Fare nefes kadar LPS boğazın arka görünür olacaktır. </li><li> Burun delikleri kapak ve 5-10 ek nefesler için genişletilmiş dilini tutmaya devam edin. </li><li> Entübasyon standından fareyi çıkarın ve anestezi kurtarır kadar geri yeni bir kafese hayvan. </li><li> Hastalığın ilerlemesi ile ilişkili vekil belirteçler izleyin. Vücut ağırlığı ve vücut ısısı çalışma süresince her 4-8 saatte izlenmelidir. Aynı şekilde, davranışsal özellikleri ve artmış morbidite ile ilişkili klinik belirtileri değerlendirmek. </li><li> LPS maruz kaldıktan sonra belirli bir zaman-noktalarında hastalığın ilerlemesi, hasat fareler değerlendirmek. LPS maruz kalma sonraki hasat için tipik zaman noktaları 0, 6, 12, 18, 24, ve 48 saat arasındadır. Kurtarma ve hayatta kalma değerlendirmek, 7 dekar için fareler değerlendirmekYS sonrası aşılama. </li></ol> 2. Serum ve Bronkoalveoler Lavaj Sıvısı (BAL) Koleksiyon <ol><li> Kurumsal olarak onaylanmış bir yöntem kullanarak fare Kurban. </li><li> Sırtında hayvan koyun ve yüksekliği (1.27 cm), ideal 0.5, otopsi kuruluna sabitleyin. </li><li> % 70 etanol ile tüm fare ıslatın. </li><li> Bir 27 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanarak, önceden herhangi bir kesik yapmak için bir kardiyak ponksiyon yaparlar. Bu, tek bir fare, bütün haldeki kan 500-800 ul çekmek mümkün olmalıdır. </li><li> Şırıngadan iğne çıkarın ve prelabeled 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bütün kan aktarın. Serum toplanması için, bütün kan, oda sıcaklığında en az 30 dakika süreyle pıhtılaşmaya izin verir. Serum koleksiyonuna ek olarak, bu prosedür, aynı zamanda önce bağışıklık hücrelerini dolaşımdaki çalışma, tam kan toplama tüpü ve enjektör, bir anti-pıhtılaştırıcı madde dahil edilerek modifiye edilebilir. </li><li> Yatay bir kesi a olunfare alt çenesine periton boşluğu uzunluğu ve periton boşluğundan dikey çapraz kesi. </li><li> Forseps kullanarak, kesi her iki tarafını kavrayın ve yavaşça yatan periton ve göğüs boşluklarında gelen cilt çekin. </li><li> Diyaframı kesim önlemek için dikkat çekici, genital sternum periton boşluğu uzunluğu boyunca büyük bir kesi yapmak. Yavaşça böbrekler birine erişim sağlamak için periton boşluğuna bağırsak geçiş. </li><li> Perfüzyon için bir drenaj noktası olarak hizmet etmek böbrek giden renal ven kesti. </li><li> Nick diyafram, makas kullanarak kalbin sol tarafını ortaya çıkarmak için, akciğerler ve kalbi önlemek için dikkat çekici. </li><li> El ile bir 27 G iğne ve 1 x PBS çözeltisi ile bir 10 ml şırınga kullanarak kalp serpmek. Tuzlu akciğerlere zorunlu olmadığından emin olmak için perfüzyon sırasında aşırı kuvvet uygulayarak kaçının. Kalan kan portal ven kesi drenaj gerekir.</li><li> Dikkatle kalp ve akciğerleri kesme önlemek için dikkat çekici, künt / künt makas kullanılarak sternum boyunca göğüs kafesi kesilmiş. Yanlışlıkla bu işlem sırasında akciğerleri kesme anlamlı toplanan BAL&#39;da miktarını azaltacak ve düzgün sabitleyici ile akciğerlerini şişirmek için bir yetersizlik neden olur. </li><li> Yavaşça kalp ve uzak forseps kullanarak göğüs kafesi akciğerleri izole. Dikkatle mümkün olduğunca omurga kadar yakın künt / künt makas kullanarak göğüs kafesi her bölümü kesilmiş ve tam iki bölümü çıkarın. </li><li> Forseps kullanarak tükürük bezleri ayırmak veya makas kullanarak bunları kaldırmak, trakea ortaya çıkarmak için. </li><li> Dikkatle makas kullanarak trakea kaplamak kasları kesti. Bu, soluk borusu, bu işlem sırasında kesilmeyebilir esastır. </li><li> Makas kullanarak, trakea örten köprücük ayırmak. </li><li> Yavaşça forseps kullanarak timus kavramak ve kalp uzak doku kaldırın. Dikkat çekerken, makas kullanarak timus çıkarınkalp ya da akciğerleri kesilmesini önlemek. </li><li> 1-2 halkaları açılı makas (45-90 º açı, keskin / keskin) kullanarak gırtlak altında trakea küçük bir yatay kesi olun. Kesi sıkıca kanül güvenli yeterince büyük olmalıdır. </li><li> Konik uç kesi altında 2-3 trakea halkaları uzanır, böylece kanül yerleştirin ve bir ipek dikiş kullanarak yerine kanül sağlamak. Sütür trakea ve özofagus arasında geçer ve kanül üzerinde sıkı çekti emin olun. </li><li> Hanks tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) içinde 1 ml bir 1 ml şırınga doldurun ve yavaşça kanül içine dişin yerleştirin. </li><li> Yavaş, ama sürekli hareket kullanarak, akciğerler şişirme, trakea içine ~ 900 ul enjekte ve hemen HBSS çekilme. Bir 15 ml konik bir tüp içinde geri kazanılan BAL yerleştirin. </li><li> Gelecek analizi için BAL&#39;da yaklaşık 3 ml toplamak için bu lavaj 2 kez daha tekrarlayın. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde ya da 4 ° C &#39;de BAL saklayın. </li></ol><ol><li> Akciğer enflasyon stand içine 10 ml şırınga takın. Ucu, vana için dişe ve şırıngaya vana için boru birleştirin. Musluk kapalı konumda olduğundan emin olun. 10 ml&#39;lik bir enjektör yerçekimi akış rezervuar olarak görev yapacak. Rezervuar hayvan yukarıda 4,75 durmak ve rezervuarın üst hayvan yukarıda 10,5 uzatmak gerekir enflasyona bağlı olmalıdır. </li><li> Nötr tamponlu formalin çözeltisi şırınga ile doldurun. Şırınga tamamen sabitleyici ile dolu olduğundan emin olun. </li><li> Hortumun açık ucu altında bir emici havlu yerleştirin ve sabitleyici boru doldurmak için izin vermek için musluğunu açın. Sabitleştirici borudan akan başladığında, hemen musluğunu kapatın ve sabitleyici ile üst şırınga doldurun. Bu enjektör tamamen akciğer enflasyonu için basınç temin etmek üzere uygun miktarda doldurulması önemlidir. </li><li&gt; Yavaşça yaklaşık 1-2 trakea halkaları kanül ucunun altında, trakea altında dikiş ipliğinin ikinci bir parça geçmek. </li><li> Sütür tek gevşek bir düğüm; Ancak, düğüm sıkı çekmeyin. </li><li> Kanül içine standı fare enflasyondan tüp yerleştirin. </li><li> Musluğunu açın ve akciğerler yerçekimi enflasyon doldurmak için izin. </li><li> Akciğerler maksimum enflasyon seviyesine ulaştıklarında, dikiş sıkı çekin ve ikinci bir düğüm. </li><li> Su musluğunu kapatın ve kanül tüp çıkarın. </li><li> Yavaşça, forseps bir çift dikiş tutup parmakları ile kanül tutarak trakea kanül çıkarın. Sıkıca göğüs boşluğuna ve geri fare burun doğru kanül aşağı doğru dikiş çekin. </li><li> Forseps ile yavaşça trakea veya sütür kavramak ve uzak boyun boşluğundan trakea kaldırın. </li><li> Künt makas kullanılarak bağlı sütür trakea caudal Sever. </li><li> Bir kez trakeostomiBir alttaki dokulara arınmış, uzak fare trakea çekmeye başlar. Yavaşça göğüs boşluğundan dışarı akciğerler kaldırın. </li><li> Dikkatle göğüs boşluğunda akciğerleri tutan bağ dokusu kesti. Uzakta fare vücuttan trakea çekerek devam edin ve altta yatan bağlantılarını keserken sürekli yukarı doğru kuvvet uygulanır. Akciğerleri kesim önlemek için özen gösterin. Kalp sol bu yöntem kullanılarak akciğerlere bağlı gerektiğini not edin. </li><li> Akciğerler çıkarıldıktan sonra, tamponlu formalin 10 ml yerleştirin. </li><li> Genotiplendirebilmek fare kuyruğu bir bölümü çıkarın. </li><li> Uygun kurumsal yönergeleri izleyerek fare karkas imha edin. </li></ol> 4. Sitokin Değerlendirme <ol><li> Serum izole edilmesi için 5 dakika için 12,000 xg&#39;de aşama 2.5 altında toplanan tam kan, santrifüj. -80 ° C&#39;de, bir 1.5 ml mikrosantrifüj prelabeled tüp ve saklamak için serum transferi </li><li> Seru değerlendirinELISA ya da başka bir benzer deney ile m sitokin seviyeleri. Serum 1:5 seyreltin - ardından, denemeye bağlı olarak, uygun bir seyreltme tamponu içinde 1:20 talimatları üretmektedir. Bu seyreltmeler önce deneysel örneklerin toplu çalışan belirlenmelidir. </li><li> Dolayı toplanan serum içinde düşük bir hacme kadar, yarı yarıya ELISA plaka üzerine yüklenen numune hacmi azaltır. Örneğin, bir çok ticari ELISA standart ve 100 ul numune hacimleri kullanmaktadır. Örnekleri, standartların yük 50 ul ve seyreltilmiş serum korumak başına iyi belirleyin. </li><li> Santrifüj 5 dakika boyunca 200 x g &#39;de bir buzdolabında masa üstü santrifüjde BALF. Ikiye hücresiz süpernatant aktarın -80 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza prelabeled </li><li> Inceltmeden ELISA veya benzer başka bir deney ile BALS sitokinler değerlendirin. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın kullanılmayan serum ve BAL </li></ol> 5. Diferansiyel Boyama ve BAL Hücresellik Değerlendirme <ol><li> BALF santrifüj ve tam HBSS çıkarıldıktan sonra, hipotonik tuzlu su ile tane haline kırmızı kan hücrelerinin lize edildi. Damıtılmış su içinde 900 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Hemen 10x PBS 100 ul ekleyin. </li><li> Tek tek her örnek lyse. Örnekleri, kırmızı kan hücrelerinin aşırı miktarda ise, hücreler 5 dakika ve kırmızı kan hücresi parçalama kuralı tekrarlanabilir boyunca 400 xg&#39;de masa üstü bir santrifüj içerisinde topak haline edilebilir. </li><li> Trypan Blue lekelemesi ile 10X ya da 20 X büyütme altında bir hemasitometre kullanılarak 1 ml süspansiyon içinde toplam BALF selülarite belirler. Değerlendirmek ve hücre / ml olarak bu verileri sunmak. </li><li> Sitospin ve diferansiyel boyama malzemeleri hazırlayın. Bir kalem veya solvent dirençli kalem kullanarak standart bir mikroskop slaytlar etiketleyin. Bir sitospin dirsek ve huni içine slaytlar sabitleyin. Sitospin rotor slayt düzeneğini sabitleyen. </li><li> 5 dakika boyunca 100 xg&#39;de Sıvıda Cytospin 150 ul. Hücre yoğunluğu etkin bir şekilde çok büyük olursa, hücre morfolojisini değerlendirmek slaytlar üzerine aşağı bükülmüş hacmini azaltmak. Slaytlar kuru gecede havalandırmak için izin verin. </li><li> Diferansiyel üretmektedir protokoller aşağıdaki slaytlar leke. Slaytlar kuru gecede havalandırmak için izin verin. Permount ile slaytlar lamel ve 20X ve 40X objektif ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak slaytlar değerlendirir. </li><li> Örneğin FACS, elektron mikroskobu, konfokal mikroskopi, gen ekspresyonu değerlendirmek için RNA ekstre etme, ve / veya western blot için protein ekstre etme gibi bir sonraki analiz için geri kalan hücreler, hasat. </li></ol> 6. Histopatoloji Değerlendirme <ol><li> Histopatolojik değerlendirilmesi için akciğer hazırlayın. Formalin tespit 24-48 saat sonra, ventral bütün şişirilmiş akciğer yönlendirmek ve parafin içine gömülmüştür. Ana iletken hava yolunu ortaya çıkarmak için elde edilen blok kesin. </li><li> Skor doğruluğunu artırmak için, aynı konumda akciğerlere pozisyon ve t en fazla uzunlamasına görselleştirme elde etmek için, her blok Döşemeo ana eksen havayolunu İntrapulmoner. Bu noktadan itibaren, 5 mikrondan seri bölümleri ve hematoksilen ve eozin (H &amp; E) ile leke kesti. Ek kesitler kesildi ve standart protokoller kullanılarak in situ melezleme için hazırlanabilir. </li><li> 0 (yok) ve 3 (şiddetli) arasında puanlanır aşağıdaki inflamatuar parametrelere dayalı yarı-kantitatif skorlama sistemi kullanılarak histopatolojisini değerlendirin: mononükleer ve polimorfonükleer hücre infiltrasyonu; epitel hücre hiperplazisi ve yaralanma havayolu; salgısı; perivasküler ve peribroncheolar Kesilen; ve enflamasyon ile ilgili akciğer oranında. Akciğer histopatolojik deneyimli bir patolog tarafından değerlendirilmesi gerekir. </li><li> Toplam puan histopatoloji oluşturmak ya da hastalığın ilerlemesinin belirli yönlerini ölçmek için tek tek puanları kullanılacak parametre puan her ortalama. Genotip ve tedavi hem kör yorumcular, bir çift kör tüm puanlama Davranış. Bu puanlama sistemi previousl olmuştury 6,7,10 tarif. </li></ol>

<ol><li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%3A+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li>
<li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+intratracheal+inoculation+method+for+the+study+of+pulmonary+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Infect.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164(2012).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+NLRP3+in+the+development+of+allergic+airway+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice.</a> J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+NLRP12+during+the+in+vivo+host+immune+response+to+Klebsiella+pneumoniae+and+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis.</a> PloS one. , (2013).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+NPSR1%2FGPRA+in+the+lung+before+and+after+induction+of+asthma-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).</li>
<li>Kebaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+mediates+virulence+in+a+murine+model+of+severe+pneumonia+through+activation+of+the+NLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome.</a> J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).</li>
<li>Roberts, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+murine+immune+response+to+pulmonary+delivery+of+precisely+fabricated+nano-+and+microscale+particles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Willingham, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+%28NALP3%2C+Cryopyrin%29+facilitates+in+vivo+caspase-1+activation%2C+necrosis%2C+and+HMGB1+release+via+inflammasome-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways.</a> J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).</li>
<li>Kline, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+airway+responsiveness+to+inhaled+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Med%22%5BJournal%5D)">Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide.</a> Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).</li>
<li>Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+chronic+mucin+secretion+to+airway+disease+in+normal+and+CFTR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Aşağıdaki gibi başarılı bir şekilde, farenin akciğerlerinde bulunan konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için en kritik adım: 1) değerlendirilen modeli için uygun fare suşu ve cinsiyet seçin; 2) akciğerlere PAMP teslim optimize edilmesi; 3) doğru toplamak ve Balf işlemek; ve 4) düzgün düzeltmek ve histopatolojik değerlendirmeler için akciğerlerin hazırlamak. Fare soyunun seçimi konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için önemli bir faktördür. C57BL / 6 fareleri, tipik olarak en P...

Patojenik bakteri türleri ile ilişkili pulmoner enfeksiyonlar küresel morbidite ve mortalite ortak bir nedenidir. Bu patojenlere karşı bağışıklık tepkisini tahrik mekanizmaları belirlenmesi bu enfeksiyonların etkisini hafifletecektir yeni önleme stratejilerinin ve terapötik ajanların geliştirilmesini teşvik edecektir. Burada açıklanan protokol genel amacı, canlı bakteriler için bir vekil olarak bir patojen ilişkili moleküler deseni (PAMP) kullanarak patojen enfeksiyona konak doğuştan gelen bağışıklık yanıtı değerlendirmek için esnek bir yöntem ile kullanıcıya sunmaktır. Bakteri konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisini değerlendirmek önceki çalışmaların büyük çoğunluğu nedeniyle yürütme göreli kolaylığı için peritoneal modeller üzerinde odaklanmıştır. Bu modeller son derece yararlıdır ve evsahibi-patojen etkileşimlerinin ve sistemik inflamasyon alanında önemli gelişmelere yol olsa da, bu modeller üretilen veriler her zaman çalışmaları için uygun değildir involvisolunum sistemi ng. Burada, akut akciğer iltihabı bir akciğer modeli klasik intraperitoneal (ip) enjeksiyonu model bir pratik ve klinik olarak anlamlı bir genişleme olarak önerilmiştir. Önerilen teknik, bir organ spesifik model sistemde doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin değerlendirilmesi için yerel sağlar. Burada açıklanan yöntemler kullanıcıların ortak PAMP olan LPS, konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için izin vermek için basit ve sağlam bir teknik sağlamak için tasarlanmıştır. Yöntem farelerde nefes borusu ve solunum yolu enfeksiyonları ve akut akciğer hasarı 1 geçiren insan hastalarda görülen patofizyolojik özellikleri birçok taklit akciğerlerinde sağlam bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi oluşturan LPS, (it) damlatma dayanmaktadır. Bu tekniğin bir avantajı, birinci kullanım in vivo çalışmalar yapılması ile ilişkili karıştırıcı faktörler ve güvenlik kaygıları olmayan bağışıklık tepkisini değerlendirmek için izin vermesidirCanlı bakteri kullanılmıştır. Aynı şekilde, bu protokolde tarif maruziyetin orofaringeal bu uygulama yolu, parenteral (in) burun ve cerrahi de dahil olmak üzere bu uygulama için diğer yaygın olarak kullanılan tekniklere göre önemli avantajları vardır. Örneğin, orofaringeal bu uygulama tipik olarak, burun boşluğunda ajanlar kaybına akciğer birikim artan değişiklere maruz kalır ve 2-4 sinüsler yönetim bölgesi ile karşılaştırıldığında nispeten doğru olan dozajlanmasını ve akciğer birikmesini sağlar. Bu uygulama yolu bu boşlukları circumvents ve trakea ve solunum doğrudan erişim sağlar. Aynı şekilde, cerrahi bu yaklaşımın bir ölçüde daha marazi uygulama yöntemidir ve master için kapsamlı bir eğitim gerektirir. Burada açıklanan protokolleri de ortak teknikleri ve inflamasyon ilerlemesini değerlendirmek ve lu hazırlanması için uygun teknikleri açıklayan bir protokol ile bitirmek için kullanılan vekil işaretçileri bir açıklama içerirhistopatolojik değerlendirmeler için NGS. Bu protokoller, her bir hayvandan elde edilen verileri maksimize her çalışma için gerekli olan farelerin sayısını en aza indirerek odaklandık. Anlatılan protokoller oldukça esnek ve hali hazırda, bir dizi çeşitli PAMPs hasar ve ilişkili moleküler modelleri (DAMPS) değerlendirmek için modifiye edilebilir. Bundan başka, bir kaç ilave değişiklik ile, bu protokol, aynı zamanda, alerjik nefes yolu, hastalığın ilerlemesini ya da canlı bakteri, virüs veya mantar 5-10 ile konukçu-patojen etkileşimlerine değerlendiren çalışmalar uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>Stok 000664</td><td></td></tr><tr><td>Kompakt Ölçekli</td><td>Ohaus Scale Corporation</td><td>71142845</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Hayvan Rektal Termometresi</td><td>Braintree Scientific</td><td>TH 5</td><td></td></tr><tr><td>Kemirgenler için Rektal Probu</td><td>Braintree Scientific RET</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>Kulak Zımbası</td><td>Braintree Scientific</td><td>EP-S 901</td><td></td></tr><tr><td>E. coli</em'den lipopolisakkarit> 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>LPS-EB</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Hayat Teknolojileri</td><td></td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Baxter</td><td>40032609</td><td></td></tr><tr><td>İntratrachael Uygulaması ve Akciğer Şişirme Standı</td><td>ICAP İmalatı</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kemirgen Entübasyon Standı</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>Makas (künt/keskin)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>forseps (düz)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td></td></tr><tr><td>forseps (45&ordm;, kavisli)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>Makas (künt/künt)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pipet (200 & mikro; l Kapasite)</td> <td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Şırınga</td><td>BD Medical</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Şırınga</td><td>BD Medical</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0.5 in İğne</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı Mikrosantrifüj</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Luer adaptörlü 1.2 mm Trakeal Kanüller</td><td>Harvard Aparatı</td><td>732836</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>4-0 İpek Örgülü Cerrahi Sütür</td><td>Ethicon</td><td>A183</td><td></td></tr><tr><td>Luer - Tüp Konnektör Kitleri</td><td>Harvard Aparatı</td><td>721406</td><td></td></tr><tr><td>Luer Musluk Kiti</td><td>Harvard Aparatı</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>Tygon formülü E-3603 Laboratuvar Boru Sigma</td><td></td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Formalin Çözeltisi, nötr tamponlu,% 10</td> <td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Fare IL-1 ve beta; OptEIA ELISA Kiti</td><td>BD Biosciences</td><td>559603</td><td></td></tr><tr><td>Fare IL-6 OptEIA ELISA Kiti</td><td>BD Biosciences</td><td>550950</td><td></td></tr><tr><td>Fare TNF-&alfa; OptEIA ELISA Kiti</td><td>BD Biosciences</td><td>560478</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre Kapak Camları</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-021-801</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3008401</td><td></td></tr><tr><td>Sitoloji Huni Klipsleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td></td></tr><tr><td>Sitoloji Hunileri</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Kartları</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-030-410</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin Sitosantrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Hızlı Boyama Kiti</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>47733150</tr><tr><td>Montaj Ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde host immün yanıtı değerlendirmek için orofarengeal intratrakeal pamp İdaresi ve bronchoalveolar lavage kullanımı

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Patojenlere karşı konak bağışıklık tepkisi karmaşık biyolojik süreçtir. In vivo çalışmaların çoğunluğu klasik konak-patojen ilişkileri farelerde seçin bakteri veya patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) intraperitoneal yararlanmak karakterize edilmesi için kullanılır. Bu teknikler, bulaşıcı hastalık patobiyolojisi ilişkili verileri vermiştir büyük olsa da, periton içine enjeksiyon modelleri her zaman akciğerde konukçu-patojen etkileşim çalışmalar için uygun değildir. Farelerde akut akciğer enflamasyonu kullanarak, bu doğuştan gelen bağışıklık tepkisi lipopolisakkarid (LPS) kullanılarak ana bir yüksek çözünürlüklü analizi yapmak mümkündür. Burada, biz, cerrahi olmayan orofaringeal İntratrakeal yönetimini kullanarak LPS yönetmek hastalığı patogenezi ile ilişkili klinik parametrelerini izlemek ve konak immün yanıtı değerlendirmek için, BAL sıvısında kullanmak için yöntemler açıklanmaktadır. Açıklanan tekniklerPAMPs ve patojenlerin çok çeşitli konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin incelenmesi için yaygın olarak uygulanabilir. Aynı şekilde, minör modifikasyonlarla, bu teknikler, aynı zamanda, alerjik nefes yolu iltihap değerlendiren çalışmalar ve farmakolojik uygulamalarda uygulanabilir.

Gram-negatif bakterilerin hücre duvarları ortamında çok bol LPS, oluşmaktadır. Hassas insan popülasyonlarında LPS solunumu solunum yolu reaktivitesi arttırır ve güçlü bir bağışıklık response11 tetikleme yeteneğine sahiptir. LPS aynı zamanda sağlam bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için, fare modellerinde kullanılan bir PAMP olduğunu. Burada açıklanan protokol olarak, fareler, E izole LPS&#39;nin bir o dozunu almıştır coli: orofarengeal bu yönetim kullanarak (serotip 0111 B4). LPS ma...

Patojen enfeksiyonuna karşı konak bağışıklık tepkisi sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Farelerde bir lipopolisakarit akciğer maruz modeli kullanarak, bu hastalığın patojenezi ile ilgili kompleks mekanizmalar yüksek çözünürlüklü değerlendirme yapmak mümkündür.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Bu prosedürün genel amacı, farelerde konakçı bağışıklık yanıtını değerlendirmek için orofaringeal intratrakeal LPS uygulaması ve bronkoalveoler lavaj kullanımını göstermektir. Bu işlem, öncelikle fareye orofaringeal uygulama yoluyla LPS inoküle edilerek gerçekleştirilir. İkinci adımda, yerel enflamatuar yanıtı değerlendirmek amacıyla bir trakeal kanül yerleştirilir ve ardından kanül aracılığıyla bronkoalveoler lavaj sıvısı toplanır.Son adımda, histopatolojik değerlendirme için akciğerler formalin ile şişirilir. Sonuç olarak, LPS'ye karşı konakçı bağışıklık yanıtını değerlendirmek için bağırsağın sitokin profili ve akciğerin histopatolojisi analiz edilebilir. Bu tekniğin intranazal uygulama ve cerrahi intratrakeal uygulama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, uygulanmasının nispeten basit olması ve doğru dozajlama ile akciğer depozisyonuna olanak tanımasıdır.LPS'yi ilk olarak intratrakeal olarak enjekte edin. Anestezize edilmiş bir fareyi entübasyon için askıya alın. Hayvanın güvenli bir şekilde sabitlendiğinden, ağız ve dilin erişilebilir olduğundan emin olarak ön kesici dişlerinden tutun.Dili düz pensle nazikçe sabitleyin, ardından dili açılı pensle kavrayın ve dili tutarke

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kemirgen solunum fizyolojisi ve solunum yolu inflamatuar hücrelerin örnekleme tekrarlanan ölçümler arzu edilir, ancak genellikle mümkün değildir. Burada sözlü havayolu inflamatuar hücrelerin havayolu hiperreaktivite ve örnekleme tekrarlanan ölçümler izin verir fareler Entübasyon için tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Havayolu Direnci Ölçümleri ve Fare Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı Örnekleme için, geri dönüşümlü, Non-invaziv Yöntemi

Biz anestezi farelerin trakea yoluyla ciğerlerine test malzemelerin cerrahi olmayan teslimat göstermektedir. Bu yöntem, bakteriyel ve viral patojenler, sitokinler, antikorlar, boncuk, kimyasallar, ya da boyalar akciğer maruz izin verir. Daha hasat ve flow sitometri akciğer ve akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) işlenmesi açıklanmaktadır.

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Biz 2.0 mm spekulum ile bir otoskop kullanarak direkt laringoskopi yoluyla farelerde entübasyon için, basit, güvenilir ve nispeten ucuz bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, atravmatik ve kronik deneylerde tekrarlanan ölçümler için de kullanılabilir. Biz üstün trakeostomi veya daha önce cerrahi dışı teknikler bildirdi bulabilirsiniz.

Farelerde Endotrakeal Entübasyon<em&gt; Via</emBir Otoskop Kullanma&gt; Doğrudan Larengoskopi

Reaktiflerin Entübasyon aracılı intratrakeal (IMIT) instilasyon solunum yolu hastalıkları, hem de akciğer içine doğrudan tedavi reaktifler aşılamak için bir yöntem incelenmesi için mükemmel, invazif olmayan bir yöntemdir. Bu klinik öncesi test için uygun bir hızlı ve yüksek oranda çoğaltılabilir bir yöntemdir.

Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi

Konak-patojen etkileşimlerinin in vitro çalışması spesifik immün yanıtların karakterizasyonuna izin verirken, karmaşık yanıtların etkilerini gözlemlemek için in vivo modeller gereklidir. Candida albicans maruziyetini ve ardından Pseudomonas aeruginosa aracılı akciğer enfeksiyonunu kullanarak, ventilatörle ilişkili pnömoni patojenitesinde yer alan mikrobiyal etkileşimlerin bir fare modelini oluşturduk.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Haemophilus influenzae'nin farelerin alt solunum yollarına intra-trakeal inokülasyon prosedürünü gösteriyoruz. Bu, fare modellerinde hava yolu iltihabını düzenleyen sinyal yollarını incelemek için çok kullanışlı bir araçtır.

intra-trakeal İdaresi<em&gt; Haemophilus influenza</em&gt; Fare Modelleri Havayolu inflamasyonu Eğitim için

Burada, fare modelinde BCG ile intranazal ve subkutan bağışıklamanın neden olduğu koruyucu etkinliği ve akciğer immün yanıtını karşılaştırmak için izlenen metodolojiyi detaylandırıyoruz. Sonuçlarımız, pulmoner aşılamanın faydalarını göstermekte ve aşı kaynaklı korumada IL17 aracılı yanıtın rolünü önermektedir.

Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından

Çeşitli yöntemler, farelerde bakteriyel pnömoni modelleme için literatürde tarif edilmiştir. Bu yazıda, orofarinksin pipetle bakteriyel inokulum aspirasyonu (yani, inhalasyon) yoluyla zatürree uyarılması için bir non-invaziv, ucuz, hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. akciğer doğal bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi için aşağı akış yöntemleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Burada etkinliği ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı aşı vivo içinde değerlendirilmesi için zarif bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı eğitim viral, bakteriyel aşı modelleri veya paraziter patojenler için adapte edilebilir.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Burada, noninvaziv orofaringeal endotrakeal entübasyon yoluyla intratrakeal lipopolisakkarit (LPS) doğumu için bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, hayvan için cerrahi prosedürün travmasını en aza indirir ve LPS'yi trakeaya ve daha sonra akciğerlere doğru bir şekilde iletir.

Farelerde Noninvaziv İntratrakeal Lipopolisakkarit Damlatma

Öğrenin, farelerde orofarengeal LPS uygulaması ve bronkoalveoler lavaj ile konakçı immün yanıtını değerlendirme yöntemini. Bu teknik, akciğerlerdeki lokal inflamatuar yanıtları ve sitokin profillerini analiz etmenizi sağlar.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

Daha fazla video keşfet