Bio-tabanlı Sanayi Feedstock olarak Tütün Ağacı ve Kavak Değerlendirme transkript ve metabolit profil

Bu prosedürün genel amacı, sistem biyolojisi odaklı tahminler için tütün ağacı yaprağı materyalinden metabolit ve RNA dizileme verilerini oluşturmak ve optimize etmektir. Bu, önce gelişimsel bir yaprak serisinin biyolojik materyalinin toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, sonraki analize bağlı olarak uygun çözücüler kullanılarak malzemenin ekstraksiyonunu gerçekleştirmektir.

Daha sonra, metabolitler ve hidrokarbonlar, gaz kromatografisi, kütle spektrometresi veya GCMS kullanılarak ölçülür ve transkriptler, RNA dizileme veri toplama kullanılarak analiz edilir. Sonuç olarak, RNA dizilimi yoluyla metabolit profillemesi ve transkripsiyonel profilleme kombinasyonu, tütün ağacı yapraklarının uzun zincirli hidrokarbonları ve diğer önemli bileşikleri nasıl geliştirdiğini göstermek için kullanılır. Bu yöntem, tütün ağacının yapraklarında yapılan önemli faydalı metabolitleri tanımlamak ve ölçmek için kullanılabilir.

Bu yöntem tütün ağacı metabolomu hakkında fikir verebilir. Tütün veya ilgili türler gibi diğer sistemler için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü tütün ağacı yapraklarından iyi RNA çıkarmak zordur.

Bu multi Bioo PRO videosunda, FERNA grubu üyelerinin ekstrakte edildiğini ve profil metabolize edildiğini göreceksiniz. GCMS'yi kullanarak, Fraser Group'tan bir üyenin hidrokarbonları çıkardığını ve ayrıca kendi grubumdan bir üyenin RNA dizilimi için RNA'yı çıkardığını göreceksiniz Birincil metabolitleri hazırlamak için metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi M iki profesyonel yetiştirme ortamı içeren 30 santimetre çapındaki saksılarda neko Oceana Glauca bitkilerini yetiştirerek başlayın, Bitkinin yapraklarını ve saplarını hasat edin ve malzemeyi hemen dondurun, donmuş bitki materyallerini üç gün boyunca dondurarak kurutarak liyofilize edin, daha sonra liyofilize numuneleri metal bilyeli mikser değirmeni ile öğütün, elde edilen ince öğütülmüş kuru malzemeleri iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne veya cam şişeye ayırın. Daha sonra, 10 miligram yaprak veya 20 miligram kök öğütülmüş kuru bitki materyalini iki mililitre vidalı kapaklı yuvarlak tabanlı tüplere ayırın.

1.4 mililitre% 100 metanol ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın. Ardından, girdaplamadan önce dahili bir kantitatif standart olarak 60 mikrolitre kaburga atol ekleyin. 10 saniye daha ekleyin, bir paslanmaz çelik bilye ekleyin ve 10 dakika santrifüjlemeyi takiben malzemeyi 25 hertz'de iki dakika mikser değirmeni ile homojenize edin.

Yerçekiminin 11.000 katında, süpernatanı bir cam şişeye aktarın. Karışımı 10 saniye boyunca girdaplamadan önce 750 mikrolitre kloroform ve 1,5 mililitre su ekleyin. Daha sonra 150 mikrolitreyi üst fazdan 1,5 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.

Ardından, numuneleri bir hızlı vakum kullanarak kurutun. Numunelerin, artık sıvı kalmayana kadar üç ila 24 saat arasında kuruluğa düşürülmesi zorunludur. Kuruduktan sonra 40 mikrolitre methin hidroklorür ekleyin.

Daha sonra karışımı yatay bir ısı bloğu çalkalayıcıda 37 santigrat derecede iki saat çalkalayın. 37 santigrat derecede iki saat boyunca tekrar çalkalamadan önce 70 mikrolitre M-S-T-F-A karışımı ekleyin. Sıvıyı GC MS analizine uygun cam şişelere aktarmadan önce kapaktaki damlaları kısa bir santrifüjleme ile döndürün.

GCMS'yi takiben, kütle spektrometresi verilerinin analizi için yazılımı yapılandırarak ve işlenecek veri analizini seçerek verileri analiz edin. Bileşik sınıfa uygun olarak tespit edilen ilgi tepelerinin bir tablosunu hazırlayın. Standart bileşiklerin koalisyonu ile zirveleri tanımlayın, ardından kütle spektrometresi analizi, yapısal karakterizasyon algoritmaları, literatür taraması ve hidrokarbon ekstraksiyonu için metabolit veritabanı araması kullanarak tespit edilen zirveleri açıklayın.

Yaklaşık 200 miligram taze hasat edilmiş ncoa glauco yaprağını iki ila 20 dakika boyunca batırın, yaprakları çıkarın ve çözücüleri döner buharlaştırma ile tamamen kurulayın. Daha sonra numuneleri bir mililitre HPLC dereceli heksan içinde yeniden süspanse edin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklanan parametreleri kullanarak örneklerin GCM analizini gerçekleştirmeye devam edin.

Başlangıçta kromatogram bileşenlerini otomatik bir MS kullanarak işleyin. Dekonvolüsyon ve tanımlama sistemi ve NIST 98 MS. Kütüphane. Tutma sürelerini ve klasik parçalanma modellerini bilinen otantik standartlarla karşılaştırarak doymuş uzun zincirli acan hidrokarbonlarının tanımlanmasını doğrulayın. Daha sonra, entegre tepe alanlarını doz yanıt eğrileri ile karşılaştırarak hidrokarbonları kantitatif olarak belirleyin.

Otantik standartlardan oluşturulmuş, Excel yazılımını kullanarak araçların ortalamalarını ve standart hatalarını hesaplayın. Bu protokol, bir mikser değirmeni ile metal bir bilye ile iki mililitrelik santrifüj tüplerinde 100 miligram donmuş bitki materyalini yüksek kaliteli RNA öğütme elde etmek için TRIOL RNA ekstraksiyonunu bir RN easy kiti ile birleştirir. Numune homojenizasyonunu takiben, malzemeyi 12.000 kez yerçekimi ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjledikten sonra bir mililitre triol ekleyin.

Süpernatanı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika inkübe etmeden önce tüpü birkaç kez ters çevirin. Karışımı 15 dakika santrifüjledikten sonra.

Daha önce olduğu gibi, üst sulu fazı yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Yaklaşık 2.5 hacim etanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirin ve eksi 80 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Ardından, herhangi bir çökelti dahil olmak üzere numuneyi bir döndürme sütununa taşıyın. Sütunu yerçekiminin 8.000 katı sıcaklıkta 15 saniye santrifüjleyin ve akışı atın. Ekstraksiyon kitinde sağlanan 700 mikrolitre yıkama tamponu RW one'ı sıkma kolonuna ve santrifüje ekleyin.

Yine, akışı attıktan sonra, 500 mikrolitre ikinci yıkama tamponunu, kit tarafından da sağlanan RPE'yi sıkma kolonuna ekleyin. Sütunu tekrar santrifüjleyin ve daha fazla tampon RPE ve santrifüjleme eklemeden önce akışı atın. Daha önce olduğu gibi, spin kolonunu yeni bir 1.5 mililitrelik reaksiyon tüpüne yerleştirin ve 50 mikrolitre RNA serbest su santrifüjü ekleyin, kolon bir dakika boyunca yerçekiminin 8.000 katı ile RNA'yı elde etmek için ekleyin.

Üreticinin talimatlarına göre DNA içermeyen bir kit kullanarak artık DNA'yı çıkarın. Son adım olarak, RNA'nın kalitesini belirleyin. RNA, yeni nesil dizileme için RNA'yı göndermeden önce sekizin üzerinde RNA bütünlük numaralarına sahip olmalıdır.

HPLC profili, ncoa glauca yaprağı ekstraktlarının izoprenoid analizinin temsili bir sonucunu göstermektedir. C 40 ve üzeri farklı izoprenoidler, bir foto diyot dizi dedektörü kullanılarak tespit edildi. Tepe noktaları, kod kromatografisine ve otantik standartlar arasındaki spektral karşılaştırmaya dayalı olarak açıklandı.

İki MS kromatogramı, ncoa, gloko yaprağı ve gövde materyalinden elde edilen birincil metabolit analizinin sonucudur. Serine karşılık gelen bir zirvenin MS spektrumu da verilmiştir, örnek olarak, RNA'nın kalitesini belirlemek için kullanılan biyoanalizörün temsili çıktısı gösterilmiştir. Kromatogramdaki iki ana tepe noktası, bu numunede bozulmamış RNA'yı gösteren RNA olan 18 s ve 25 s ribozomal'a karşılık gelir.

Parçalanmış ribozomal RNA'nın ek zirveleri, bir kez ustalaştıktan sonra kısmen veya büyük ölçüde bozulmuş RNA durumunda ortaya çıkacaktır. Bu teknik hızlı bir şekilde uygulanabilir ve bu prosedürü takiben diğer metabolitlerin analizi ile uyumludur. Gerçek zamanlı PCR veya RNA'yı analiz etmenin diğer yolları gibi diğer yöntemler, küçük RNA'ların üretimi veya belirli genlerin ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, tütün ağacından metabolit verilerinin nasıl çıkarılacağı ve değerlendirileceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.