Name: Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Öğrenin, konfokal mikroskopi ile canlı hücrelerde endozomal ve sitozolik pH'yi eşzamanlı ölçme yöntemini. HPTS ve SNF F1 probları kullanılarak hücre içi pH dinamikleri incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Gilles Dupuis'e makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. 
Finansman
Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri, hibe # MOP-126173 tarafından desteklenmiştir. C.M.D, Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ) tarafından finanse edilen Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel'in bir üyesidir.

Hücresel pH Kalibrasyon Çözümleri 1. Hazırlanması <ol><li> Kalibrasyon için kullanılmak üzere 5 çözümler hazırlamak için beş ayrı 50 ml konik tüplere aşağıdaki bileşikler ekleyin: <ul><li> NaCl (1 M NaCl 1 mi) (1 M NaCl, 10 ml H = 2 0 içinde 0.58 g) </li><li> KCl (6.75 1 M KCI mi) (1 M KCl, 10 ml H 2 0 içinde 0.75 g =) </li><li> Glikoz (1 M D-Glikoz 1 mi) (1 M D-Glucose = H 10 ml 1.80 g 2 0) </li><li> MgS0 4 (0.05 1 M MgSO 4 ml) (1 M, 10 ml MgSO H 2 0 içinde 4 = 1.20 g) </li><li> 20 mM HEPES (1 M HEPES 1 mi) (10 mi H 2 0 içinde 1 M HEPES = 2.38 g) </li><li> CaCl2 (1 M CaCI2 ve 0.05 mi) (10 mi H 1 M CaCl2 = 1.47 g 2 0) Çift distile H 2 O (GKD 2 O) tüm çözümler hazırlayın. </li></ul></li><li> GKD 2 O 35 ml solüsyonu ile, her tamamlamak ve böylece kadar bir manyetik karıştırıcı ile karıştırındevrim sisi elde edilir. </li><li> 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ve 7.5 pH değeri elde etmek üzere 1 N KOH ya da 1 N HCI ile, her çözeltinin pH&#39;ı ayarlayın. Daha sonra, 50 ml lik bir son hacme kadar deiyonize su ile hacim ayarlayın. </li><li> Tedbir 5 nigerisin mg ve stok çözeltisi nigericin 10 mm hazırlamak için mutlak EtOH 670 ul ekleyin. Dikkat: nigericin son derece toksik ve büyük bir dikkatle (eldiven, gözlük ve maske) ile ele alınması gerekir. Nigericin tamamen eriyene kadar inversiyon yolu ile çözüm karıştırın. </li><li> Her bir ayar çözeltiye 10 mM nigerisin (nihai konsantrasyon 10 uM) ve 0.05 ml ilave edilir. Nigericin hücre zar geçirgenliğini artırır ve hücre dışı K + kutuplaşma giderici bir konsantrasyonunun mevcudiyetinde hücre-içi ve hücre dışı pH&#39;ın dengede neden olan bir iyonofor olduğunu. </li><li> Kalibrasyon çözümleri 4 ° C&#39;de 1 ay kadar saklanabilir </li></ol> 2.. Hücre Hazırlanması <ol><li> Biyolojik bir Safet altında35 mm y kapağı, tohum hücreleri x 10 mm kültür tabakları,% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotikler ile desteklenmiş büyüme ortamı içinde 2 ml. 24 saat sonra yaklaşık olarak% 50 izdiham sağlamak için gerekli hücre miktarı kullanın. Not: Deneylerde, biz HT-1080 hücre çizgisi ve plaka kültür kabı başına 1 x 10 5 hücre kullanın. </li><li> Kalibrasyon için kullanılacak deney ve plaka 5 ek kültür tabakları için gereken kültür kaplarına sayısını belirler. </li><li> En az 24 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde yer kültür tabakları. </li></ol> PH-algılama Sondalar 3. Hazırlanması <ol><li> GKD 2 0 floresan prob pH 8-hydroxypyrene-1 ,3,6-trisülfonik asit, trisodyum tuzu (HPTS / pyranine) bir 1 M stok çözelti hazırlayın. Bu çözelti, oda sıcaklığında saklanan ve ışıktan korunmalıdır. </li><li> Thereâ adlandırılan (and-6)-karboksil seminaphthorhodafluor asetoksimetil ester asetat (C-SNARF-01:00 - 1 mM 5 &#39;lik bir stok çözelti hazırlayınfter SNARF-1) DMSO 1.76 ml Snarf-1, 1 mg çözülmesiyle. Iyice tekrarlanan pipetleme karıştırın. SNARF-1 çözeltisi, -20 ° C&#39;de saklanan ve ışıktan korunmalıdır. </li></ol> 4. Hücre Etiketleme <ol><li> Onaltı saat canlı hücre görüntüleme önce, tam ortam 2 ml içeren her kültür tabağına 1M HPTS stok solüsyonu 2 ul (nihai konsantrasyon 1 mM) ekleyin. </li><li> Inkübatör kültür yemekleri dönün. HPTS prob nedenle etiket prob pinositoza tarafından alınmalıdır organeller, hücre-laktobionat olduğunu. Bu durum HPTS hücre inkübasyonlar serum-takviyeli kültür ortamında gerçekleştirilir gerektirir. </li><li> HPTS ile inkübasyondan sonra, steril PBS ile iki kez Hücreleri yıkamak ve en az 2 saat boyunca serumsuz ortamda 2 ml ekleyin. SNARF-1 ile inkübasyon serum prob ortaya çıkmasını önlemek, çünkü serum içermeyen ortam içinde yapılması gerekmektedir. </li><li> AF elde etmek üzere bir 1 mM SNARF-1 ihtiyat çözeltisinden 10 ul ekleinal 5 uM arasında konsantrasyon ve hücreler loş ışık altında, 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübasyona izin verin. C-SNARF-1 konsantrasyon ve kuluçkalama süresi, hücre tipine bağlı olarak değişebilir. </li><li> İnkübasyonun sonunda, steril PBS içerisinde iki kez yıkama ve hücreler serum içermeyen ortam 2 ml ekleyin. </li></ol> PH Modülatörler 5. Ilavesi <ol><li> Yöntem hücrelerde pH değişiklikleri tespit edebilir olup olmadığını değerlendirmek için, hücre içi pH&#39;ın modüle farklı reaktif de kullanılabilir: <ul><li> Bafilomisin A1, V-ATPaz 5 spesifik bir önleyicisi </li><li> Na + / H + değiştirici izoformu 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH4CI, hücre içi pH 7 arttıran bir zayıf baz </li></ul><ol><li> Yukarıda bahsedilen reaktiflerin stok çözelti hazırlayın: <ul><li> Bafilomisin A1: 100 uM&#39;lik bir stok çözeltisi elde etmek üzere, DMSO ile 160 ul bafilomycin A1 10 ug eklemek </li><li> EIPA: obtai metanolün 1.67 ml EIPA 25 mg eklemek50 mM&#39;lik nihai konsantrasyon na </li><li> NH4CI: 1 mM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere GKD 2 O 10 ml amonyum klorürün 0.53 g çözülür. </li></ul> Not: Tüm stok solüsyonları -20 ° C sıcaklıkta saklanan ve ışıktan korunmalıdır bafilomycin A1 dışında 4 ° C&#39;de tutulmalıdır. </li><li> Ayrı bir kültür tabaklarında, aşağıda tarif edildiği gibi reaktifler ekleyin: <ul><li> 100 uM bafilomycin A1 2 ul (son konsantrasyon 100 nM) </li><li> 50 mM EIPA 1 ul (nihai konsantrasyon 25 uM) </li><li> 1 M NH4CI (nihai konsantrasyon 20 mM), 40 ul </li></ul></li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe hücreleri </li></ol></li><li> Görüntü alma geçin. </li></ol> 6.. Canlı hücre Görüntüleme Mikroskop Özellikleri ve Toplama Ayarlar <ol><li> Kullanarak canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek 40X objektif bir spektral ters tarama konfokal microsco üzerine montepe motorize XY aşamada, çevre kontrollü (sıcaklık, nem, CO 2) evre inkübatör cam alt kültür yemekleri barındıran bir bölme ile donatılmıştır. </li><li> Burada kullanılan konfokal alet (Olympus FV1000) ile donatılmıştır: <ul><li> Bir diyot lazer 405 nm </li><li> A 40 mW argon lazer (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Bir helyum neon lazer (543 nm) </li><li> Florit 10X objektif, NA0.4 </li><li> Bir LUCPLFLN 40X objektif, NA0.60 </li><li> Bir PLAPONSC PLANI APO 60X yağ objektif, NA1.4 </li><li> Dikroik ayna DM 405/458/488/543 </li><li> Bir SDM 560 ve SDM 640 dikroik filtreleri </li><li> A BA655-755 bariyer filtre </li><li> Bir ışın ayırıcı BS20/80 </li><li> Görüntü elde etme ve analiz için veri analizi yazılımı, </li></ul></li><li> Sahne inkübatör 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılır ve mikroskop kurulduktan sonra, önce konfokal sahne görüntüleme odasına HPTS ve Snarf-1 ile inkübe bir kültür çanak yerleştirin. </li><li> Ailgi alanı bulma ürkiye&#39;de, yazılım satın alma ayarları Şekil 1 ayarlayın. <ul><li> İki sanal kanal set kurmak. </li><li> 525 nm ve 570 nm 543 ve emisyon toplama SNARF-1 uyarım - - 600 nm 505 405 nm ve emisyon toplama HPTS uyarma karşılık ilk aşamasını başlatın. </li><li> 525 nm ve 640 de 543 nm ve emisyon toplama SNARF-1 uyarım - - 650 nm 505 458 nm ve emisyon toplama HPTS uyarma karşılık ikinci aşamasına. </li><li> Konfokal açıklık varsayılan olarak 175 um ayarlanır ve optimal diyafram elle 300 mikron ayarlanmış olması gerekiyor. </li><li> 0,4 mikron kalınlığında seri yatay optik bölümleri (800 x 800 piksel) istifleme Resmi atın. </li></ul></li></ol> NOT: 40X objektif aynı anda birkaç hücreleri gözlemlemek için yararlıdır ve organel görüntüleme için iyi çalışır. Ancak, uzaysal çözünürlüğü ve sinyal yoğunluğu Bette vardırR, bir 60X objektif kullanılarak yağ elde. Buna ek olarak, iki boyalar arasında bir uyarım veya emisyon cross-talk bulunmaktadır. PH-algılama Problar 7. Kalibrasyon <ol><li> Kalibrasyon önce, daha önce HPTS ve Snarf-1 ile inkübe kültür çanak orta kaldırmak steril PBS ile iki kez yıkama ve daha sonra, beş kalibrasyon çözümlerden biri 2 ml ekleyin. </li><li> Konfokal aşama odasına kültür tabağına yerleştirin. </li><li> Aşağıdaki ayarlara göre zaman atlamalı görüntü elde geçin: <ol><li> Deney için görüntülerin ve aralık süresi sayısını ayarlayın. NOT: tipik olarak 30 dakika ila görüntüleri arasında, 1 dakika süre aralığı kullanınız. </li><li> Her görüntünün edinimi arasındaki kapatmak için deklanşörü programlayın. </li></ol></li><li> Bir elektronik tablo yazılımı dakika başına floresan yoğunluğunu kaydedin ve floresan yoğunluğu sabit olduğu zaman belirler. 20 dk - Hücre içi pH 15 sonra genellikle kararlı. </li><li> REPEAT kalan her kalibrasyon çözümü için yeni bir kültür çanak kullanarak 7,1-7,4 adımları. </li></ol> 8. Veri Toplama <ol><li> Kalibrasyon yapıldıktan sonra, alan başına 15-20 hücreleri içeren 4-5 rastgele seçtikleri alanlarda örnek verileri kazanır. İki görüntüleri her alan için elde edilir: HPTS etiketleme (kesecikler) ve SNARF-1 etiketleme (Sitosol) için saniye biri. </li><li> Eşiğe (hücre dışı bir bölge) dijital hem de sondaların floresan görüntülerden çıkarılır. Ilgili saklanan görüntülerden Etiketli veziküller ve sitosol bir ikili maske kullanılarak seçilir. Her pH-algılama probu için, floresan yoğunlukları sayısal bir ölçek (0-4,095 gri seviye ölçeği) ölçülür. Organel ya da sitoplazmada tüm pikseller için bir ortalama yoğunluğu hesaplanır ve değerler floresan oranlarının hesaplanması için kullanılmaktadır. </li></ol> 9. Veri Analizi <ol><li> Çeşitli yazılım paketleri veri analizi için piyasada mevcuttur. YaniFluoview Yazılım. </li><li> Aşağıdaki gibi, bir tablo, kayıt değerleri içinde ve floresan oranları hesaplanır: HPTS durumunda, R = (F 458 nm / F 405 nm), ve SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm durumunda .) </li><li> Böyle GraphPadPrizmasındaki gibi bilimsel grafik yazılımı kullanarak veri çiziniz. Plot pH (X ekseni) bir fonksiyonu olarak floresans oranı (Y-ekseni) tasvir gerekir. Eğri uydurma, lineer olmayan regresyon kullanılarak elde edilir. </li><li> Adım 8.2 &#39;de tarif edildiği gibi örneklerin floresan şiddetlerini toplamak ve floresan oranları hesaplar. PH değerleri içine oranlarını dönüştürmek için kalibrasyon eğrileri kullanın. </li></ol>

<ol><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+Homeostasis+of+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Hinton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+a+subunit+isoforms+of+the+V-ATPase+in+pH+homeostasis+and+in+vitro+invasion+of+MDA-MB231+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells.</a> J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).</li>
<li>Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+intraorganelle+pH+in+the+endosomal-lysosomal+pathway+in+neurons+by+using+ratiometric+imaging+with+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).</li>
<li>Drose, S., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycins+and+concanamycins+as+inhibitors+of+V-ATPases+and+P-ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases.</a> J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).</li>
<li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li>
<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li>
<li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+pH+of+BALB%2Fc-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li>
<li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li>
</ol>

Çıkar çatışması beyan edilmedi.

Farklı hücre bölümlerinde canlı hücre görüntüleme Sayısal pH ölçümü doğru dış zorluklara hücre yanıtlarında pH değişimleri ölçmek için gereklidir. Bununla birlikte, hala önemli engellerden biri kolayca ve özel hücre bölmeleri hedef etmektir. Bu bağlamda, bir kaç çalışmada, elektroporasyon ya da mikroenjeksiyon ile 8-10 hücrelere katılan bir hücre içi pH göstergesi olarak HPTS kullanımını sermiştir. Bu teknikler yani elektro hücrelere geniş zararlara yol açar, ve mikroenjeksiyon özel ekipman ve teknik beceri g...

<table><tbody><tr><td>Kalibrasyon</td><td></td><td></td><td></td>çözeltileri</tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz (dekstroz)</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize su</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>Solunduğunda veya cilt ile temas ettiğinde toksik</td></tr><tr><td colspan="4"> 4 ° C'de ışıktan koruyun; C</td></tr><tr><td>Kültür kapları ve boş; 35mm</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr><td>pH algılama probları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Hidroksipiren-1,3,6-trisülfonik asit (HPTS)</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>H-348</td><td>Oda sıcaklığında ışıktan uzak tutun</td></tr><tr><td>5- (ve-6) -Karboksi SNARF&reg;-1, Asetoksimetil Ester, Asetat</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>C-1271</td><td>-20 ° C'de ışıktan ve nemden uzak tutun; C</td></tr><tr><td>Dimetil Sufoksit (DMSO)</td> <td>Fischer</td><td>BP231-1 & nbsp;</td><td>zararlı</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115 g</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Deiyonize su</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Otoklava getirin ve pH'ı 7.4'e</td> <td>ayarlayın</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40,5 g</td></tr><tr><td>Deoinize su</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>5 L</td></tr><tr><td>pH modülatörlerine</td><td></td><td></td><td></td></tr> getirin <tr><td>Bafilomisin A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5- (Etil-N-izopropil) amilorid (EIPA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Fischer</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

konfokal mikroskopi kullanılarak yaşayan hücreler içinde endositik ve sitosolik bölümleri eşzamanlı ph Ölçümü

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Hücre içi pH sıkı bir şekilde düzenlenir ve sitoplazma ile organeller arasındaki pH farklılıkları bildirilmiştir1. Hücresel pH'ın düzenlenmesi, protein, DNA ve RNA sentezi, veziküler kaçakçılık, hücre büyümesi ve hücre bölünmesini içeren fizyolojik süreçlerin homeostatik kontrolü için çok önemlidir. Hücresel pH homeostazındaki değişiklikler, zararlı fonksiyonel değişikliklere yol açabilir ve çeşitli hastalıkların ilerlemesini teşvik edebilir2. Hücre içi pH'ı ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur, ancak bunların çok azı sitoplazmada ve organellerde pH'ın aynı anda ölçülmesine izin verir. Burada, canlı hücreler üzerinde konfokal mikroskopi kullanarak sitoplazmik ve organel pH'ın aynı anda ölçümü için hızlı ve doğru bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz3. Bu amaca, seçici hücresel bölme bölümlemesine sahip iki pH algılama oranlı boyanın kullanılmasıyla ulaşılır. Örneğin, SNARF-1 sitoplazma içinde bölümlere ayrılırken, HPTS endozomal / lizozomal organeller içinde bölümlere ayrılır. HPTS yaygın olarak bir sitoplazmik pH indikatörü olarak kullanılmasına rağmen, bu boya, pinositoz3,4 tarafından alındıktan sonra endozomal-lizozomal yol boyunca vezikülleri spesifik olarak etiketleyebilir. Bu pH algılama problarını kullanarak, endositik ve sitoplazmik bölmeler içinde pH'ı aynı anda ölçmek mümkündür. HPTS'nin optimal uyarma dalga boyu pH'a bağlı olarak değişirken, SNARF-1 için değişen optimal emisyon dalga boyudur. SNARF-1 ve HPTS ile yüklemenin ardından hücreler, her prob için bir pH standart eğrisi oluşturmak üzere pH kalibre edilmiş farklı solüsyonlarda kültürlenir. Konfokal mikroskopi ile hücre görüntüleme, artefaktların ve arka plan gürültüsünün ortadan kaldırılmasına izin verir. HPTS'nin spektral özellikleri nedeniyle, bu prob hafif asidik endozomal bölmenin ölçümü veya endozomal / lizozomal organellerin alkalinizasyonunu göstermek için daha uygundur. Bu yöntem, veri analizini basitleştirir, pH ölçümlerinin doğruluğunu artırır ve hücrelerin dış zorluklara verdiği yanıtlar sırasında pH modülasyonu ile ilgili temel soruları ele almak için kullanılabilir.

Hücre içi ve endozomal / lızozomal hücre bölmelerine hem de pH değerinin ölçümü için aynı anda, rasyometrik floresan pH algılama Snarf-1 problar ve HPTS kullanılmıştır. HPTS endozomal / lizozom oran ölçer pH&#39;ı ölçümünü sağlar, oysa SNARF-1 sitosolik bölmesi ile sınırlandırılmıştır. 16 saat HPTS ile hücre yükleme endozomlar / lizozomlarında 4 seçici yerelleştirme sağlar. PH algılama probları ile yüklü HT-1080 hücreleri kaydedilen floresans tipik bir örneği, Şekil 2A&#39;da gösterilmiştir. ...

Hücre içi pH'ı ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur, ancak bunların çok azı sitoplazmik ve organel pH'ın aynı anda ölçülmesine izin verir. Burada, canlı hücrelerin oransal görüntülemesi ile sitoplazmik ve veziküler pH'ı aynı anda ölçmek için hızlı ve doğru bir metodolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, konfokal mikroskopi ile canlı hücrelerde veziküler ve sitozolik pH değerlerini eş zamanlı olarak ölçmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin sırasıyla endozomal ve lizozomal kompartmanları ve sitozolü işaretleyen pH algılayıcı problar olan HPTS ve SNF F1 ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hücreler konfokal mikroskop altında çevre koşulları kontrollü bir hazneye yerleştirilir ve yazılım, haznedeki probların floresansını ölçecek şekilde ayarlanır.Hücreler, farklı pH değerlerine kalibre edilmiş çözeltilerle inkübe edilir. Doğrusal olmayan bir regresyon kullanılarak bir pH standart eğrisi oluşturulur. Her iki prob için üstel denklemler belirlenir ve ardından örneklerin floresans yoğunluklarını pH değerlerine dönüştürmek için kullanılır.Bu yöntem, çeşitli işlemler sonrası örneklerden veziküler ve sitozolik pH'ın belirlenmesini sağlar ve biyolojik süreçler sırasında hücre içi pH düzenlemesinin incelenmesine olanak tanır. Bu tekniğin mevcut hücre içi pH ölçüm yöntemlerine karşı temel avantajı, görüntüleme sırasında artefaktları ve arka plan gürültüsünü ortadan kaldırarak canlı hücrelerdeki hücre içi pH dinamiklerinin ölçülmesine imkan vermesidir. Prosedür, bu yöntemi geliştiren doktora öğrencisi fess lucier tarafından gösterilecektir. Hücresel pH kalibrasyonu için pH 5,5'ten 7,5'e kadar 0,5'lik artışlarla beş adet 50 mililitrelik çözelti serisi oluşturulması gereklidir.pH değerlerini ayarlamak için bir normal potasyum hidroksit veya hidroklorik asidi damla damla ekleyin. Ardından, her bir pH kalibre edilmiş çözeltiye 0,05 mililitre IOR gersin ekleyin. 10 millimolar konsantrasyonda, 10 micromolar nihai konsantrasyon için risin, ekstraselüler potasyumun depolarize eden konsantrasyonları varlığında hücre membranı geçirgenliğini artıracaktır; bir çeker ocuk altında, 37 °C'de 24 saatlik inkübasyon süresince %50 konfluensle ulaşma hedefiyle, hücreleri %10 fetal bovine serum ve antibiyotik içeren iki mililitre ortamla 35 milimetrelik kültür kaplarına ekin.Deney için gerekli olan tüm plakları ektikten sonra, kalibrasyon için beş adet ek plaka ekin. Bu plakaları 24 saat boyunca inkübe edin, ardından 24 saat daha ve görüntülemeden 16 saat önce inkübasyona devam edin. Ertesi sabah, yaklaşık üç saat sonra, çözeltide 1 mM son konsantrasyon sağlamak için 1 M'lık organel etiketi HPTS'den iki µL ekleyin.Görüntüleme öncesinde, PBS ile iki kez yıkama yaparak HPTS'yi uzaklaştırın. Ardından iki mililitre serumsuz besiyeri ekleyin ve hücrelerin en az iki saat daha inkübe olmasını sağlayın.Görüntüleme işleminden hemen önce, hücreleri beş mikromolar snf ile inkübe edin; bunu yapmak için on mikrolitre bir milimolar snf ekleyin ve SNF bir inkübasyon süresini takip edin. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve iki mililitre serumsuz besiyeri ekleyin, ardından görüntüleme işlemine geçin. Hücreler.Hücrelerin görüntülemesi, motorlu sahne ve çevresel bölme ile donatılmış spektral ters taramalı konfokal mikroskop kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Plastik petri kapları kullanıldığında, 40x objektif en uygunudur. Yazılım, iki sanal kanal seti için ayarlanmalı, eksitasyon dalga boyu ve emisyon dalga boyları düzenlenmelidir.HPTS ve SNF için konfokal açıklık varsayılan olarak 175 mikron olarak ayarlıdır ve optimal açıklığın manuel olarak 300 mikron şeklinde ayarlanması gerekir. Hazne 37 °C'ye kadar ısındığında kalibrasyonu başlatın, bir hücre plağını PBS kullanarak iki kez daha yıkayın ve ardından ortamı ilk kalibrasyon çözeltisiyle değiştirin. Şimdi hücreleri hazneye yerleştirin ve her iki pH duyarlı boyayı kalibre ederek bir dakikalık aralıklarla 30 adede kadar zaman aşımı görüntüsü alın.Her bir görüntü yığını 0,4 mikron kalınlıkta ve 800 kare pikselde toplanabilir. Görüntüler arasında, perde kapalı kalacak şekilde programlanmalıdır. Genellikle 20 dakika civarında stabilize olacak olan floresan yoğunluğunu her dakika not edin.Floresan stabilize olduğunda, 15 ila 20 hücre içeren ve her iki probun da bulunduğu dört veya beş alandan görüntüler alın. Bu görüntüler eğri hesaplamaları için kullanılır. Bu işlemi her bir kalibrasyon çözeltisi için tekrarlayın.Ardından, yıkama işlemi gerektirmeyen deneysel koşul plakalarının görüntülemesine geçin. Her bir görüntünün analizinde, öncelikle hücre dışı arka plan floresanını dijital olarak çıkarın. Daha sonra, kayıtlı görüntülerdeki işaretli vezikülleri ve sitozolü ikili bir maske kullanarak seçin. Her bir pH algılama probu için florasan yoğunlukları, 0 ile 4.095 arasındaki bir ölçekte ölçülür.Organeldeki veya sitoplazmadaki tüm pikseller için ortalama yoğunluğu hesaplayın. Bu değerleri kullanarak HPTS ve snf için floresans oranlarını hesaplayın. Kalibrasyon eğrileri için, her bir kalibrasyon çözeltisi için elde edilen floresans oranlarını pH'ın bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün; kalibrasyon eğrisi uydurma işlemi eksponansiyel bir denklem kullanılarak yapılmalıdır.Son olarak, oranları pH değerlerine dönüştürmek için kalibrasyon eğrilerini kullanın ve böylece deneysel koşullar altındaki canlı hücrelerde sitozolik ve organel pH değerlerini elde edin. Endozomları boyamak için Alexa 546 konjugatlı transferrin ile veya floresan bir lizozomal prob olan LysoTracker ile birlikte yapılan ortak boyama ile HPTS'nin hem endozomal hem de lizozomal kompartmanları etiketlediğine dair açık kanıtlar elde edilmiştir.Her bir prob için, HT 10 80 hücrelerinde açıklandığı şekilde derin kırmızı zaman atlamalı görüntüler toplanmıştır. Beş kalibrasyon çözeltisi, pH 6 ve pH 7,5 çözeltileri gibi çözeltilerde 15 dakika sonra floresan yaklaşım stabilitesi açısından test edilmiştir. Belirli bir pH için kalibrasyon eğrisinde veriler, HPTS için 558 ve 405 nanometre veya SNF 1 için 644 ve 584 nanometre değerindeki floresan yoğunluklarının oranını temsil etmektedir. Her iki eğriye de eksponansiyel bir denklemle uyum sağlanmıştır.Yöntemin canlı HT 10 80 hücrelerindeki etkinliği, hücre içi pH'ı artıran zayıf bir baz olan amonyum klorür kullanılarak değerlendirilmiştir. Baz, hem sitozolün hem de veziküllerin pH'ını artırmıştır. Yöntem ayrıca, v-ATPase inhibitörü olan B mycin, A one kullanılarak da değerlendirilmiştir; bamy, A one hem endozomal hem de lizozomal kompartmanlarda alkalinleşme meydana getirmiş, ancak sitozolik pH'ı değiştirmemiştir.Son olarak, bir NHE1 inhibitörü olan EIPA test edildi. EIPA,lele sitozolü 6,62 pH değerine kadar asidifiye etti, ancak şu ana kadar pH'ı etkilemedi.Hücresel pH homeostazı çalışmaları, hem hücreler içinde meydana gelen hızlı pH değişimleri hem de hücre içi pH'ı inceleyecek araçların eksikliği nedeniyle sınırlı kalmıştır. Bugün, tek bir canlı hücrede hemle sitozolik hem de endozomal pH'ın eş zamanlı olarak ölçülmesi için basit, adım adım bir yaklaşımı tarif ediyoruz. Bu yöntem, özellikle mutasyonların veya ilaçların endozomal bölmedeki proton giriş ve çıkışını etkileyebildiği hücrelerde, hücresel pH homeostazının incelenmesi için büyük önem taşımaktadır.

simultaneous-ph-measurement-endocytic-cytosolic-compartments-living

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Video, fare serebral arter segmentlerinin endotel hücrelerinde hücre içi kalsiyum seviyelerinin ve membran potansiyelindeki değişikliklerin eş zamanlı ölçümünü göstermektedir. İzole edilmiş endotel tüpü, bir floresan kalsiyum indikatörü ile yüklenir ve hücre içi kalsiyum salınımını indükleyen bir ilaçla muamele edilir, bu da zar potansiyelinde bir değişikliğe neden olur. İndikatörün floresansı, kalsiyum seviyelerinin ölçülmesini sağlar ve membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçmek için bir...

Bir Fare Serebral Endotelyumunda Hücre İçi Kalsiyum ve Membran Potansiyelinin Eş Zamanlı Ölçümü

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Canlı Makrofagların içinde Phagolysosome Biogenesis&#39;den Çalışması

Fagozomal pH, fagozom olgunlaşmasını, oksidan üretimini, fagozomal öldürmeyi ve antijen sunumunu etkiler. Burada, floresan mikroskobu kullanarak canlı fagositlerdeki bireysel fagozomlardaki zaman-seyri ve son nokta pH değişikliklerini ölçmek için bir oransal yöntemi açıklıyoruz.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Bu yazıda phagosomal pH ve alan olarak rasyometrik göstergesi seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ya da S-1 kullanılarak, insan ve fare nötrofillerin sitoplazmik pH'ını ölçmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Bu canlı hücre konfokal floresan mikroskop ve görüntü analizi kullanılarak elde edilir.

Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Burada konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu tek bir enstrüman platformu nda birleştiren Conpokal tekniğinin protokolü sunulmuştur. Conpokal aynı hücre, aynı bölge, eşzamanlı konfokal görüntüleme ve canlı biyolojik örneklerin mekanik karakterizasyonu yakın sağlar.

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Bu protokol, sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için konfokal bir görüntüleme tekniğini tanımlar. Bu füzyon modları arasında 1) füzyon gözenek açma ve kapama içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) kaynaşmış vezikül büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.

Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi

Protokol, bireysel insan periferik kan mononükleer hücrelerinin sitokin sekresyon dinamiklerini kantitatif olarak ölçmek için gelişmiş bir mikroakışkan platformu tanımlar. Platform, örnek olarak lipopolisakkarit ile uyarılan her bir hücre için paralel olarak üç adede kadar sitokini (IL-6, TNFa ve IL-1β) ölçer.

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım 

Öğrenin, konfokal mikroskopi ile canlı hücrelerde endozomal ve sitozolik pH'yi eşzamanlı ölçme yöntemini. HPTS ve SNF F1 probları kullanılarak hücre içi pH dinamikleri incelenir.

Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Daha fazla video keşfet