Konfokal mikroskopi kullanılarak Yaşayan hücreler içinde endositik ve Sitosolik Bölümleri eşzamanlı pH Ölçümü

Hücre içi pH'ı ölçmek için çeşitli yöntemler mevcuttur, ancak bunların çok azı sitoplazmik ve organel pH'ın aynı anda ölçülmesine izin verir. Burada, canlı hücrelerin oransal görüntülemesi ile sitoplazmik ve veziküler pH'ı aynı anda ölçmek için hızlı ve doğru bir metodolojiyi ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, konfokal mikroskopi ile canlı hücrelerde veziküler ve sitozolik pH'ı aynı anda ölçmektir. Bu, ilk olarak hücrelerin sırasıyla endozomal ve lizozomal bölmeleri ve sitozozü etiketleyen pH algılama probları, HPTS ve SNF F1 ile inkübe edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, hücreler konfokal bir mikroskop altında çevresel olarak kontrol edilen bir odaya yerleştirilir ve yazılım, odadaki probların floresansını ölçmek için ayarlanır.

Hücreler, farklı pH kalibrasyonlu çözeltilerle inkübe edilir. Bir pH standart eğrisi, doğrusal olmayan bir regresyon kullanılarak oluşturulur. Üstel denklemler her iki prob için de belirlenir ve daha sonra numunelerin floresan yoğunluklarını pH değerlerine dönüştürmek için kullanılır.

Bu yöntem, çeşitli işlemlerden sonra numunelerden veziküler ve sitozolik pH tayinine izin verir ve biyolojik işlemler sırasında hücre içi pH'ın düzenlenmesinin incelenmesini sağlayabilir. Bu tekniğin hücre içi pH ölçümü için mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yöntemimizin canlı hücrelerde hücre içi pH dinamiklerinin ölçülmesini sağlarken artefaktları ve arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmasıdır Görüntüleme sırasında, prosedürü göstermek, bu yöntemi geliştiren doktora öğrencisi Fess Lucier olacaktır. 0,5'lik artışlarla pH 5,5 ila 7,5 arasında beş adet 50 mililitrelik çözelti serisi oluşturmak gerekir.

PH değerlerini ayarlamak için damla damla bir normal potasyum hidroksit veya hidroklorik asit ekleyin. Daha sonra her pH kalibre edilmiş çözeltiye 0.05 mililitre IOR gersin ekleyin. 10 mikromolar risin'lik bir nihai konsantrasyon için 10 milimolar'da, bir başlık altında hücre dışı potasyumun depolarize edici konsantrasyonlarının varlığında hücre zarı geçirgenliğini artıracaktır; 35 milimetre kültür kaplarında tohum hücreleri,% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotik içeren iki mililitre besiyeri, 37 santigrat derecede 24 saatlik inkübasyonda% 50 birleşme elde etmek amacıyla.

Deney için gerekli tüm plakaları tohumladıktan sonra, kalibrasyon için ek beş plaka tohumlayın. Bu plakaları görüntülemeden 24 saat, 24 saat sonra ve 16 saat önce inkübe edin. Ertesi sabah, yaklaşık üç saat içinde çözelti içinde bir milimolar HPTS'nin son konsantrasyonu için bir molar dişe iki mikrolitre organel etiketi HPTS ekleyin.

Görüntülemeden önce. PBS ile iki yıkama yaparak HPTS'yi çıkarın. Daha sonra iki mililitre serum içermeyen ortam ekleyin ve hücrelerin en az iki saat daha inkübe etmesine izin verin.

Görüntülemeden hemen önce, hücreleri beş mikromolar snf ile inkübe edin, biri 10 mikrolitre bir milimolar snf ekleyerek, biri SNF'yi bir inkübasyon periyodunu takip ederek. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve iki mililitre serum içermeyen ortam ekleyin, ardından görüntülemeye devam edin. Hücreler.

Hücrelerin görüntülenmesi, motorlu bir sahne ve çevre odası ile donatılmış, spektral ters taramalı konfokal mikroskop ile gerçekleştirilmelidir. Plastik petri kapları kullanırken, 40 x objektif en uygun olanıdır. Yazılım, yazılımdaki iki sanal kanal seti için ayarlanmalı, uyarma dalga boyunu ve emisyon dalga boylarını ayarlamalıdır.

HPTS ve SNF bir için, konfokal açıklık varsayılan olarak 175 mikrona ayarlanmıştır ve optimum diyafram açıklığının manuel olarak 300 mikrona ayarlanması gerekir. Hazne 37 santigrat dereceye kadar ısındığında, kalibrasyonu başlatın, PBS kullanarak bir hücre plakasını iki kez daha yıkayın ve ardından ortamı ilk kalibrasyon solüsyonuyla değiştirin. Şimdi hücreleri hazneye yerleştirin ve her iki pH'a duyarlı boyayı kalibre edin, bir dakikalık aralıklarla 30'a kadar hızlandırılmış görüntü elde edin.

Her görüntü yığını 0,4 mikron kalınlığında ve 800 kare pikselde toplanabilir. Ve görüntüler arasında, deklanşör kapalı kalacak şekilde programlanmalıdır. Her dakika floresan yoğunluğuna dikkat edin, bu tipik olarak yaklaşık 20 dakika stabilize olur.

Floresan stabilize olduktan sonra, 15 ila 20 hücre içeren dört veya beş alandan ve her iki probdan da görüntü alın. Bu görüntüler eğri hesaplamaları için kullanılır. Her kalibrasyon çözeltisi için bu işlemi tekrarlayın.

Ardından, yıkamaya gerek olmayan deneysel koşul plakalarını görüntülemeye devam edin Her görüntüyü analiz ederken, önce arka plan hücre dışı floresansını dijital olarak çıkarın. Ardından, ikili bir maske kullanarak depolanan görüntülerden etiketli vezikülleri ve sitosolu seçin. Her pH algılama probu için, floresan yoğunlukları sıfır ile 4.095 arasında bir ölçekte ölçülür.

Organel veya sitoplazmadaki tüm pikseller için ortalama yoğunluğu hesaplayın. Bu değerleri kullanarak, HPTS ve snf için floresan oranlarını hesaplayın. Kalibrasyon eğrileri için bir çizim, pH kalibrasyon eğrisinin bir fonksiyonu olarak her bir kalibrasyon çözeltisi için elde edilen floresan oranlarını çizer, üstel bir denklem kullanılarak yapılmalıdır.

Son olarak, oranları pH değerlerine dönüştürmek için kalibrasyon eğrilerini kullanın ve böylece deneysel koşullar altında canlı hücrelerde sitozolik ve organel pH değerlerini elde edin. HPTS'nin hem endozomal hem de lizozomal bölmeleri, endozomları boyamak için Alexa 5 46 konjuge transferrin ile veya floresan atrofik bir prob ile cos boyama yoluyla etiketlediğine dair net kanıtlar elde edildi. Lyo izci.

HT 10 80 hücrelerinde tarif edildiği gibi her prob için koyu kırmızı hızlandırılmış görüntüler toplandı. Beş kalibrasyon çözeltisi, belirli bir pH için kalibrasyon eğrisinde pH altı ve pH 7.5 çözeltileri gibi çözeltilerde 15 dakika sonra floresan yaklaşım stabilitesi test edildi, veriler HPTS için 558 ila 405 nanometre veya SNF için 644 ila 584 nanometre floresan yoğunluklarının oranını temsil eder. Her iki eğri de üstel bir denklem ile donatıldı.

Yöntemin canlı HT 10 80'deki etkinliği, hücre içi pH'ı artıran zayıf bir baz olan amonyum klorür kullanılarak değerlendirildi. Baz, hem sitozolün hem de veziküllerin pH'ını arttırdı. Yöntem ayrıca B misin, A, bir va a TPA bamy inhibitörü, A biri hem endozomal hem de lizozomal kompartmanların alkalinizasyonunu indükledi, ancak sitozolik pH'ı değiştirmedi.

Son olarak, bir NHE inhibitörü olan EIPA test edildi. Sitozu 6.62 pH'a kadar asitleştirdi, ancak pH'ı etkilemedi. Şimdiye kadar.

Hücresel pH homeostazı çalışması, hem hücrelerde meydana gelen hızlı pH değişiklikleri hem de hücreler içindeki pH'ı incelemek için araç eksikliği ile sınırlandırılmıştır. Bugün, tek canlı hücrelerde hem sitozolik hem de endozomal pH'ı aynı anda ölçmek için basit bir adım adım yaklaşımı açıklıyoruz. Bu, mutasyonların veya ilaçların endozomal bölme içindeki proton akışını ve akışını etkileyebileceği hücrelerde hücresel pH homeostazının incelenmesi için özellikle önemlidir.