Name: Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Öğrenin, sıçan retinasında ganglion hücrelerini kalsiyum boyası ile seçici etiketleme ve voltaj bağımlı kalsiyum kanallarının katkısını ölçme yöntemini. Bu teknik nörobilim araştırmalarında canlı hücre dinamiklerini incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz kalsiyum görüntüleme protokole katkılarından dolayı Dr S. Stella ve Helen Vuong teşekkür ederiz. Biz röportaj sahneleri filme Dr K. Sheets teşekkür ederim. Biz el yazması onu yorumlar için Dr Arlene Hirano teşekkür ederim. Bu araştırma ve geliştirme projesi Teletıp ve İleri Teknoloji UCLA Tıp, David Geffen School yazarlar tarafından yürütülen ve US Army Medical Research &amp; Levazım Komutanlığı (USAMRMC) tarafından verilen ve uygulanan bir sözleşme anlaşması ile mümkün yapılır ve Sözleşme Numarası altında MD Fort Detrick&#39;te Araştırma Merkezi (TATRC),: W81XWH-10-2-0077. Bu çalışmalar için destek de NIH EY04067 ve VA Merit Şu (NB) geldi. NCB Bir VA Kariyer Araştırmacı olduğunu.

Bütün deneyler İnsan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım ve Kaliforniya-Los Angeles Üniversitesi (UCLA) Hayvancılık Araştırma Komitesi ABD Kamu Sağlığı Hizmetleri Politikası tarafından verilen deney hayvanlarının refahı için yönergelere uygun olarak yürütülmüştür. Erkek ve dişi Sprague-Davvley fareleri 3-5 haftalık yaş arasında (Charles River Laboratuarı, Wilmington, MA) kullanıldı. Wholemount Retina ve İmmünhistokimya Protokolün 1. Hayvan ve Doku Hazırlama <ol><li> Bir diseksiyon mikroskobu, çok ince ipuçları, makas, selüloz filtre kağıdı, plastik pipet ve bir mikroskop lamı ile 2 forseps: Aşağıdaki malzemeleri ve araçları hazırlayın. </li><li> Derin, bir giyotinle birlikte dekapitasyon% 1-3 izofluran ile anestezi hayvan tarafından kapalı bir odada sıçan öldürülür. Hücre dışı çözelti içeren bir Petri kabındaki iris makasları ve yerine bir çift gözleri çıkarın. Bir Ames Me Hazırdakireç, sodyum ya da fizyolojik çözeltiler tavsiye edilir. </li><li> [İsteğe bağlı adım Flu-4 ile RGCs sepme isteniyorsa]. 2,3-2,4 adımları tarif edildiği gibi Fluo-4 etiketlenmesi. </li><li> Mikroskop (ışık yoğunluğu: 1,6 x 10 8 fotonlar / mm 2 ⋅sec) kullanılarak, gözün ön keserek kornea çıkarın. Forseps ile retina iç yüzeyinden lens ve vitreus çıkarın. Vitreus kaldırmak için, bir forsepsi sıkıca sklerasına tutarak küresi stabilize. Yavaşça diğer forsepsi retinada merkezine doğru camsı baz soyun. Bu aşamada hazırlanması için kullanılan cryosections Göz yuvası olarak adlandırılır. Cryosections hakkında daha fazla ayrıntı referanslarda 14,15 bulunabilir. </li><li> Göz yuvası gelen retina çıkarın. Sonra, dört keser retina düz koymak için izin yapmak. Yavaşça fotoreseptör kadar olan bir mikroskop lamı üzerine retinadaki. Retinaya çözümün bir damla ekleyin ve ce koymakretinaya llulose filtre kağıdı. Retina filtre kağıdı bağlanır başladığında, çözelti içinde retina yerleştirin. Gerekirse, bir fırça veya forseps ile retina düzleştirmek. </li><li> Tespiti için 10-15 dakika boyunca% 4 PFA içine wholemounted retina yerleştirin. </li><li> 0.1 M fosfat tamponu (PB), pH 7.4 içinde 30 dakika boyunca wholemounted retinalarında üç kez yıkayın. Gece boyunca 4 ° C &#39;de% 0.3 Triton X-100 ve% 0.1 NaN3 içeren 0.1 PB içinde% 5 normal keçi serumu ve eşek serumu ile retina bloke eder. Bu engelleme çözümler ve antikorları kurtarmak için tüm adımlar için 500 ul bir son hacme sahip önerilir. </li><li> Bir sonraki gün, 4 ° C &#39;de primer antikor ile 5-7 gün retinae wholemounts inkübe edin. Optimal seyreltikleri kullanıcı tarafından belirlenmelidir. </li><li> PB 0.1 M retinaları 3 x 30 dakika yıkayınız ve primer antikor (konsantrasyon 1: 1000) ve türlerine karşı olan, ilgili fluorofor-konjuge sekonder antikor olarak 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> PB ile 30 dakika her biri üç nihai yıkamadan sonra, orta montaj retina monte. Uzun süreli depolama için tırnak cilası ile lamelleri mühür. Mağaza numuneler, 4 ° C&#39;de ve ışıktan korur. </li></ol> Bir Kalsiyum Gösterge Boya ile Sıçan Wholemount retina ganglion hücrelerinin ve Aksonlar 2. Etiketleme <ol><li> % 95 O 2/5% CO ile fokurdatıldı memeli Ringer içeren 125 NaCl, 3 KCİ, 2 CaCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2, 25 NaHCO3 (mM olarak) 1.000 ml ve 10 glükoz hazırlanması &#173; 2. </li><li> 1,2-1,4 adımları tarif edildiği gibi bir diseksiyon. </li><li> Bir şırınga kullanılarak sırasında göz için yaklaşık 1 mm posterior optik sinir güdük içine Fluo-4 Pentapotassium tuzu (Y 2 O 40 mM stok), 0.5 ul, bir kalsiyum indikatör boyası ile, retinal bez hücrelerin (RGCs) ve aksonlar yük enjekte . [Ca gangliositi dinamik artışlarını ölçmek için 2+ </sup&gt;] böyle Flu-4 345 nM olan Kd ile yüksek afinite ile, bir gösterge, en uygunudur. Fluo-4 kalsiyum bağlandığmda&gt; 100 kattan fazla bir emisyon artışı ile sonuçlanan çok yüksek kuantum verimi sahip olmanın sağladığı fazladan fayda sağlar. </li><li> Memeli Ringer% 95 O kabarmış 2 /% 5 CO Göz yuvası yerleştirin &#173; 2 karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. </li></ol> Retina Ganglion Hücreleri ve Aksonlar 3. Kalsiyum Görüntüleme Protokolü. <ol><li> 1,1-1,4 adımda tarif edildiği gibi göz lens ve camsı çıkarın. Göz yuvası gelen retina yalıtmalı ve kadranlardan bölün. Dağı tek kadran ganglion hücre, bir cam slayt tarafı yukarı ve stabilize bir arp dilim ızgara kullanın. Koyu adapte diğer parçaları tutmak memeli Ringer% 95 O kabarmış 2 /% 5 CO &#173; Daha sonra kullanmak için buz üzerinde 2. </li><li> Memeli Ringer solüsyonu ile kayıt odasına Superfuse ve% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile sürekli köpüren çözüm tutmak. </li><li> Görüntü mikroskop altında doku. Oda sıcaklığında (~ 23 ° C) ya da, deney yapma, sahne ısınma numunenin altında, su banyosu ısısı veya numunenin yüzeyine sıcak hava uygulanarak fizyolojik sıcaklıklar elde. Not: Bu, pek çok hücresel işlev, hücre içi homeostazın 16 sağlanması bakımından önemli bir rol oynar sıcaklığı ile düzenlenmiş olması dikkat etmek önemlidir. Ancak, ısınma önlemlerin tanıtımı, ısıl genleşme 17 neden orta ve odak kayması buharlaşmasını ışıkla oranını artırabilir. Oda sıcaklığında kullanımı Flu-4 18 hücre içi bölümlere ayrılmasını azaltır. </li><li> Ilaçların yokluğunda iki eşleştirilmiş yüksek K + palslarının bir denetimi. Etkinleştirmek için her darbe sırasında 33 saniye için 60 mM 3 mM gelen o [K +] yükselterek RGCs ve RGH aksonlarını depolarizeSekiz kanal yer çekimi kontrolünde süperfüzyon sistemi VGCCs. Yükseltilmiş K + çözeltisi içinde isosmolarity korumak için 57 mM Na + azaltır. </li><li> Genel ya da özel Ca kanal blokerlerinin kullanımı ile kalsiyum sinyaline farklı VGCCs katkısını değerlendirin. Örneğin, spesifik olmayan bir kalsiyum kanal tıkayıcı, kobalt verilmesinden sonra kalsiyum sinyal azalması, yüksek K + -evoked kalsiyum sinyali VGCCs katkısının bir yarı-nicel ölçümünü sağladı. </li><li> (Şekil 2) ilgi RGCs çevresinde ilgi (ROI) bir bölge koyarak floresan yoğunluk değerlerini edinin. </li><li> İlk, yüksek K + ile tepe tarafından üretilen değişiklik, ikinci yüksek K + doruğu tarafından üretilen floresan yoğunluğundaki değişim normalize. Sonra, belirli kalsiyum kanal blokerleri test için, sadece bir çiftinin ikinci yüksek K + darbesi sırasında ilaç uygulamak ve karşı tepe normalleştirmekilk tepe değeri. Yüksek K + ile bir tepe üzerinde ilacın etkisini ölçmek için, birinci ile ikinci bu K + tepe genliğinin, bölün. Analiz ilacın yokluğunda ölçülen eşleştirilmiş yüksek K + tepe elde ettikleri uygun kontrollere göre, bu değerler üzerinde yapılmalıdır. </li><li> 5 sn aralıklarla görüntü kazanır. Foto-ağartma önlemek için, mümkün olduğu kadar düşük tutmak lazer uyarma. Photomultiplier tüp 505 nm LP filtresi aracılığıyla floresan emisyon toplarken, argon lazer 488 nm hattı ile uyarma sağlayın. </li></ol>

<ol><li>Guenther, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+calcium+currents+in+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat.</a> Brain Res. 633, 223-235 (1994).</li>
<li>Farrell, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+voltage-gated+ion+channels+in+rat+retinal+ganglion+cells+mediated+by+somatostatin+receptor+subtype+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4.</a> J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).</li>
<li>Caterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+regulation+of+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium--a+life+and+death+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium--a life and death signal.</a> Nature. 395, 645-648 (1998).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+microdomains+Organization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium microdomains Organization and function.</a> Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).</li>
<li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+diversity+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li>
<li>Rottman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribonuclease+protection+assay+a+powerful+tool+for+the+veterinary+pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist.</a> Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Segev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+spikes+from+a+large+fraction+of+the+ganglion+cells+in+a+retinal+patch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch.</a> Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).</li>
<li>Jeon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).</li>
<li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+extrasynaptic+factors+governing+glutamatergic+retinal+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves.</a> Neuron. 62, 230-241 (2009).</li>
<li>Daniels, B. A., Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((d-Serine+enhancement+of+NMDA+receptor-mediated+calcium+increases+in+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells.</a> J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).</li>
<li>Pérez de Sevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+voltage-gated+calcium+channel+%CE%B1%282%29%CE%B4%284%29+subunits+in+the+mouse+and+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina.</a> J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).</li>
<li>Hirano, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP25+expression+in+mammalian+retinal+horizontal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells.</a> J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+dynamics%2C+homeostasis+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Dailey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+live+cells+and+tissue+slices+in+the+imaging+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+ProtocI%22%5BJournal%5D)">Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup.</a> Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).</li>
<li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+intracellular+calcium+ion+dynamics+in+hair+cell+populations+with+Fluo-4%5BTitle%5D)+AND+%22AM.+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4.</a> AM. PLoS One. 7, e51874(2012).</li>
<li>Kwong, J. M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).</li>
<li>Pérez deSevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).</li>
<li>Pérez de Sevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracer+coupling+of+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+to+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).</li>
<li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyan+fluorescent+protein+expression+in+ganglion+and+amacrine+cells+in+a+thy1-CFP+transgenic+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina.</a> Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).</li>
<li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Thy1-CFP+DBA%2F2J+mouse+line+with+cyan+fluorescent+protein+expression+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).</li>
<li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+and+block+of+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor+channels+by+divalent+cations+in+mouse+cultured+central+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones.</a> J Physiol. 394, 501-527 (1987).</li>
<li>Ascher, P., Nowak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+divalent+cations+in+the+N-methyl-D-aspartate+responses+of+mouse+central+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture.</a> J Physiol. 399, 247-266 (1988).</li>
<li>Aizenman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+mediated+by+excitatory+amino+acid+receptors+in+solitary+retinal+ganglion+cells+from+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat.</a> J Physiol. 396, 75-91 (1988).</li>
<li>Taschenberger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+current+kinetics+in+a+solely+AMPA-receptor-operated+glutamatergic+synapse+formed+by+rat+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons%2C+but+is+less+specific+for+individual+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+mechanisms+generate+maintained+activity+in+ON+and+OFF+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeurosciI%22%5BJournal%5D)">Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells.</a> J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).</li>
<li>Margolis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+signaling+in+ON+and+OFF+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).</li>
<li>Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recordings+of+the+effects+of+cholinergic+ligands+on+neurons+in+the+ganglion+cell+layer+of+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina.</a> J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).</li>
<li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+glutamate+clearance+mechanisms+in+a+chronic+rat+glaucoma+model+using+retinal+ganglion+cell+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging.</a> J Neurochem. 94, 794-807 (2005).</li>
<li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+activity-mediated+refinement+of+axonal+projections+from+a+mosaic+of+genetically+identified+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells.</a> Neuron. 59, 425-438 (2008).</li>
<li>Kim, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li>
<li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklama yok.

1) İmmünhistokimya retina wholemounts içinde ganglion hücrelerine Flu-4 yerelleştirme göstermek için, ve 2) Kalsiyum görüntüleme retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamikleri analiz etmek: Bu makalede, iki farklı teknikler tarif var. Wholemounts kullanılarak immünohistokimya 20-23 retina kemirgen proteinlerin lokalizasyonunu ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Ancak, birkaç sınırlamalar vardır. Boyanma kalitesi, ilgili antijen ve ilgilenilen özel tabakasına ...

1,2 akım kanalı Ca tam hücrenin, bu bileşenlerin farmakolojik blokajı yoluyla belirlendiği gibi, retinal ganglion hücrelerinin (RGCs) L, N, P / Q-ve T-tipi VGCC ifade eder. VGCC verici sürümü, gen transkripsiyonu, hücre düzenleme ve sinaptik plastisite 3,4,5 katılan transmembran Multimerik proteinlerdir. 1 gözenek ve kanal biyo-fiziksel ve farmakolojik özellikler, esas olarak, hücre dışı yardımcı α 2 δ alt birimleri ve hücre içi β alt birimi tespit alt birimleri oluşturan α büyük, zar: Fonksiyonel VGCCs alt ünitelerinin en az üç farklı sınıflardan oluşur. Farklı α 1 alt birimleri ile son iki şekilde heteromerik kompleksleri ve plazma membranı 6 kanalların yolluk kinetik ve kaçakçılığı değiştirebilir. Son on yılda, birçok teknik protein Expre incelemek için istihdam edilmiştirBu İmmünohistokimya, enzime bağlı immünosorbent deneyi batı analizi ve akış sitometresi olarak salgılanması. Bu teknikler, ilgi konusu bir proteinin tespit edilmesi için spesifik antikorların kullanılmasını gerektirir ve farklı dokular içindeki yerine ve özel proteinlerin dağıtılması için güçlü bir araç sağlar. Antikorları kolayca olmadığında bu tür kuzey leke analizi gibi özel bir proteinin mRNA ifade seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılan teknikler, RT-PCR, gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR, in situ hibridizasyon, cDNA mikrodizileri ve ribonükleaz koruma deneyi için alternatif bir yaklaşım sağlar özel bir proteinin ya da eğer mevcut ekspresyon seviyeleri 7 düşüktür. Ancak, bu tür moleküler teknikler kullanılarak bir sınırlama gen dizisinin gerekli tanımlanmasıdır. Retinada proteinleri lokalize etmek için immünohistokimya wholemount retina üzerinde gerçekleştirilebilir. RGCs erişilebilirlik, wholemount nedeniyleHazırlık RGC somata ve akson özel proteinlerin yerelleştirme incelemek için mükemmel bir platform sağlar. Bulundukları bölgeye ek olarak, RGCs VGCCs bazı fonksiyonel özellikleri kalsiyum görüntüleme teknikleri kullanılarak ispat edilebilir. Biz seçici hücre içi kalsiyum dinamiklerini ölçmek için bir kalsiyum gösterge boya ile RGCs etiketlemek için bir kalsiyum görüntüleme protokol açıklar. Çeşitli hücre bölmesi içinde bulunan kalsiyum sinyaline farklı VGCCs katkısı alt tiplerine spesifik Ca kanal blokerlerinin kullanımı ile izole edilebilir. Belki burada tarif kalsiyum görüntüleme tekniğinin en yararlı yönlerinden biri aynı anda ve birbirinden bağımsız birden fazla RGCs ve aksonlarından kaydetmek için yeteneğidir. Bu Tam hücre yama kenetleme kayıt gibi bir çok fizyolojik teknikleri, yüksek zamansal çözünürlüğü membran akımların kayıtları, somatik veya thes aksonal kaynağı sağlamak rağmenKaydedilen E akımları ayrımcılık olamaz ve kayıtları bir seferde sadece tek bir nöron yapılabilir. Multielectrode diziler (ölçüm) eş zamanlı olarak bir kısım hücrelerde ani kaydetme özelliğine sahiptir, fakat tespit veya aktivasyonunu ayırt, kalsiyum kanallarının, örneğin, farklı alt tipler kaldırılmaz. Tercihen büyük sivri 9 oluşturmak hücrelerinden belirli bir elektrot 8 ve kaydetmek için yakın bir yerde bulunduğu bir hücre kayıt ölç. Optik görüntüleme yöntemleri, tek hücreli mikro elektrot ve yama kelepçe kayıt ve MEA kayıt elde edilen bilgilerin entegre edilebilir hücrelerin bütün popülasyonlarının eşzamanlı ve bağımsız kayıtları etkinleştirmek için alternatif bir strateji sağlamak. Burada açıklanan kalsiyum görüntüleme teknikleri RGCs kalsiyum dinamiklerinin incelenmesi için kullanılmıştır, ancak, yama kelepçe ve ÇÇA daha da iyonik akımları ve RGCs spike özelliklerini açıklamak için paralel olarak kullanılabilir. <psınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; yerinden amacrine hücreleri 10 retina farede ganglion hücre tabakasında nöronal nüfusun yaklaşık% 60&#39;ını oluşturan bizim amacımız isteğe bağlı olarak bir sentetik kalsiyum endikatör boyası ile RGCs etiketler bir yükleme yapmak için teknik wholemount hazırlanması. Sentetik kalsiyum göstergesi boyalar hücre içi kalsiyum dinamikleri çalışma için mükemmel bir platform sağlar rağmen, yaygın kullanımı etkili belirli bir ağ içinde nöronların belirli popülasyonlarının yüklemek için yetersizlik tarafından engellenmiştir. Bu tür dökme yükleme 11 ve elektroporasyon gibi birçok teknik 8,12 hücre popülasyonları bütün Bununla birlikte, bu tür teknikler, özel hücre tipleri arasında ayrım yapamaz ve yüklemek için yapılmıştır. Genetik olarak kalsiyum göstergeler seçici hücrelerinin spesifik popülasyonlarının etiket olanağı sağlar kodlanmış Bununla birlikte, bu yöntemler, transgenik hayvanların 13 üretilmesini gerektirir. Bizim teknik bir yöntemii açıklard seçici bir kalsiyum gösterge boyasının optik sinir güdük enjeksiyon yoluyla Wholemount hazırlanmasında RGCs etiketlemek için. Birlikte ele alındığında, bu makalede özetlenen yapısal ve fizyolojik teknikleri RGCs ve akson olarak lokalizasyonu ve kalsiyum sinyali VGCCs katkısını incelemek için bir platform sağlar.

<table><tbody><tr><td>Düz makas</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>diseksiyon aletleri</td></tr><tr><td>Düz Forseps</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>diseksiyon aletleri</td></tr><tr><td>kavisli iris makası</td><td>WPI</td><td>504487</td><td>diseksiyon aletleri</td></tr><tr><td>Selüloz filtre kağıdı</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp; productID=A1247501">A12475-01</a></td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vektör</td><td>H-1000</td><td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp; rct=j& Q=& esrc=s& kaynak=web& cd=1& cad=rja& sqi=2& ved=0CC0QFjAA& url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279& ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw& usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA& sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg& bvm=bv.48705608,d.cGE">Floresan için Montaj Ortamı</a></td></tr><tr><td>Fluo-4 pentapotasyum</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Abbott Laboratuvarları</td><td>05260-05</td><td>anestezi</td></tr><tr><td>Mikroskop lamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 Pascal mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0.8) objektif lens</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Antikor</td><td>Moleküler Problar</td><td>A-11034</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>Bir tavşan poliklonal antikoru &nbsp; RBPMS&nbsp'nin N-terminaline karşı üretildi; polipeptit (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, ticari bir satıcı tarafından (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>

wholemount sıçan retina immunohistochemical ve kalsiyum görüntüleme yöntemleri

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Bu yazıda araçları, reaktifler ve için gerekli olan pratik adımları açıklar: imünohistokimya için Wholemount retina 1) başarılı bir hazırlık ve retinal kalsiyum sinyalini aracılı voltaj kapılı kalsiyum kanalı (VGCC) çalışmasında 2) kalsiyum görüntüleme ganglion hücrelerinin. Kalsiyum görüntüleme yöntemi biz ganglion hücre tabakası yerinden amacrine hücreleri olmayan spesifik yükü ile ilgili alt ettiği durumlar açıklanmaktadır.

Spesifik antikorlar ile immün retina ve kalsiyum görüntüleme tekniği ilgi belirli proteinlerin lokalizasyonu incelemek için bir platform sağlar retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson olarak kalsiyum dinamiklerine VGCCs katkısının çalışmasına izin verir. Ganglion hücre proteini RBPMS karşı selektif RGCs 19 etiketler (çoklu ekleme ile RNA bağlayıcı protein) bir antikor kullanarak, Fluo-4 etiketleme ganglion hücrelerinde (Şekil 1) ile sınırlı olduğunu göstere...

İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Bu prosedürün genel amacı, bir kalsiyum indikatör boyasının optik sinir güdüğüne enjekte edilmesi yoluyla, bütün mount preparasyondaki retinal ganglion hücrelerini seçici olarak işaretlemektir. Bu işlem, öncelikle flow four gibi çok yüksek afiniteli bir kalsiyum indikatör boyasının optik sinir güdüğüne enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, retina göz çukurundan izole edilir ve bir lam üzerine yerleştirmek için kadranlara ayrılır. Fizyolojik koşulları taklit edecek şekilde kurulan bir kayıt odasında, voltaj kapılı kalsiyum kanallarının kalsiyum sinyaline olan katkıları incelenir.Retinal ganglion hücrelerindeki akımlar, kanal blokörleri kullanılarak depolarize hücrelerde ölçülebilir. Sonuçlar, voltaj bağımlı kalsiyum kanallarının, yüksek potasyum ile uyarılan kalsiyum sinyali gibi bir sinyale olan katkısına dair yarı nicel ölçümler sağlayabilir. Bu tekniğin elektroporasyon ve toplu yükleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bütün montaj preparatında retinal ganglion hücrelerini ve aksonlarını seçici olarak işaretleyebilme yeteneğidir; bu işlem için diseke edilmiş fare gözleri, hibernate mediums veya benzeri bir solüsyon kullanılır.Şimdi, kalsiyum görüntüleme deneyl

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Gömme sonrası immünogold yöntemi, spesifik moleküllerin hücre altı lokalizasyonunun yüksek çözünürlüklü analizlerini sağlamanın en etkili yollarından biridir. Burada, retinal şerit sinapslarında glutamat reseptörlerini kantitatif olarak analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Biz üç farklı doku hazırlama teknikleri immunohistokimyasal görselleştirme sıçan retina mikrovasküler perisitlerden, Yani, soğutucu bölümü, Bütün bağlar ve damar ağının hipotonik yalıtım için göstermek.

Retina Cryo-kesitler, Bütün bağlar ve mikrovasküler perisitlerden immunohistokimyasal görselleştirme hipotonik izole damarlara hazırlıkları

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Mevcut protokol, gıda sargısı, şeffaf silikon ve kapak camı kullanarak büyük (6 x 3 mm2) bir kafatası penceresi yapmayı açıklamaktadır. Bu kafatası penceresi, aynı farede in vivo geniş alan ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme deneylerine izin verir.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Retina protezleri görsel algı oluşturma özelliğine sahiptir. Yeni protezlerin geliştirilmesini ilerletmek için, implantasyondan önce cihazları test etmek için ex vivo yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu makale, elektriksel stimülasyona maruz kaldığında retinal ganglion hücre tabakasındaki kalsiyum aktivitesini incelemek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Elektrikle Uyarılan Düz Monte Retinalarda Kalsiyum Görüntüleme

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI), duyusal nöron sinyalinin sağlam, popülasyon düzeyinde bir analizini sağlar. Burada, sıçan trigeminal gangliyon nöron aktivitesinin in vivo GECI görselleştirmesine izin veren yeni bir yaklaşım geliştirdik.

Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Bu protokol, tüm retina montajlı fare retinasını izole etme ve tüm retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) etiketlemek için immün boyama gerçekleştirme prosedürünü açıklar. İşlemi, yapay zeka tabanlı yazılım kullanılarak RGC'lerin görüntülenmesi ve otomatik olarak sayılması takip eder ve bu da tüm fare retinasındaki RGC'leri ölçmek için basit, hızlı ve doğru bir yöntem sağlar.

Tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı

Öğrenin, sıçan retinasında ganglion hücrelerini kalsiyum boyası ile seçici etiketleme ve voltaj bağımlı kalsiyum kanallarının katkısını ölçme yöntemini. Bu teknik nörobilim araştırmalarında canlı hücre dinamiklerini incelemeye olanak tanır.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Daha fazla video keşfet