Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, bir kalsiyum indikatör boyasının optik sinir güdük enjeksiyonu yoluyla tüm montaj preparatındaki retinal ganglion hücrelerini seçici olarak etiketlemektir. Bu, önce optik sinir kütüğüne akış dört gibi çok yüksek afiniteli bir kalsiyum indikatör boyasının enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, retina göz kabından izole edilir ve bir cam slayt üzerine monte etmek için kadranlara bölünür Fizyolojik koşulları taklit etmek için kurulmuş bir kayıt odasında, voltaj kapılı kalsiyum kanallarının kalsiyum sinyaline katkıları.

Retinal ganglionda depolarize hücrelerde kanal blokerleri kullanılarak hücreler ölçülebilir. Sonuç olarak, sonuçlar, voltaj eğitimli kalsiyum kanallarının yüksek potasyum uyarılmış kalsiyum sinyali gibi bir sinyale katkısının yarı kantitatif ölçümlerini sağlayabilir. Bu tekniğin, elektroporasyon ve yığın yükleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, retinal ganglion hücrelerini ve aksonlarını bütün bir montaj hazırlama Deposunda seçici olarak etiketleme, diseke rad gözler ve bir amaç ortamı veya benzer bir çözeltiyi kış uykusuna yattırma yeteneğidir.

Şimdi, kalsiyum görüntüleme deneyleri yapmayı düşünüyorsanız, retinal ganglion hücrelerini dördüncü akışla doldurun. 0.5 mikrolitre 40 milimolar akışlı dört penta potasyum tuzu, su içinde optik sinire enjekte edin, göz küresinin yaklaşık bir milimetre arkasındaki güdük. Göz küresini memeli halkalarına aktarın.

%95 oksijen, %5 karbondioksit veya oda sıcaklığında bir saat ile köpürtülür. Hazırlığı karanlıkta tutun. Gözleri kontrollü ışık yoğunluğu ile mikroskop altında inceleyin.

Bir tıraş bıçağı kullanarak nazikçe göz küresinin önünde küçük bir kesi yapın ve korneayı çıkarın. Daha sonra forseps kullanarak lensi iç retina yüzeyinden çıkarın. Sklerayı sıkıca tutun.

Vitreusu diğer forsepslerle çıkarırken, vitreus tabanını retinanın merkezine doğru nazikçe soyun. I kabı olarak adlandırılan elde edilen preparat, immünohistokimyasal tam montaj hazırlığı, kalsiyum görüntüleme hazırlığı için işlenebilir veya immünohistokimyasal bir tam montaj hazırlığı yapmak için enine retinal kesitler için hazırlanabilir. İlk olarak, retinaya düz durması için dört kesik yapın.

Retinayı, ganglion hücre tabakası aşağı bakacak şekilde cam kapak sürgüsüne yerleştirin. İkinci olarak, retinaya bir damla çözelti ekleyin ve gerekirse selüloz filtre kağıdı ile örtün, retinayı bir fırça veya forseps ile düzleştirin. Üçüncüsü, retina tamamen düz olduğunda ve filtre kağıdına ayrıldığında, tekrar çözeltiye yerleştirin.

Önce hazırlığı işlemek için, 10 ila 15 dakika boyunca% 4 paraform aldehite aktarın. Daha sonra retinaları pH 7.4'te 0.1 molar fosfat tamponunda yıkama başına 30 dakika boyunca toplam 90 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, retinaları gece boyunca dört santigrat derecede 500 mikrolitre bloke etme solüsyonunda inkübe edin.

Bu çözelti, önümüzdeki beş ila yedi gün boyunca% 0.3 tritton ve% 0.1 sodyum azid içeren fosfat tamponunda% 5 normal keçi serumu veya eşek serumudur, retinaları birincil antikor çözeltisinde dört santigrat derecede inkübe edin. Bu çözümün yapısına ampirik olarak ulaşılmalıdır. Fiksatif yıkandığı gibi birincil antikor solüsyonunu yıkayın.

Daha sonra retinaları ikincil antikorda bir ila 1000 konsantrasyonda gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İkincil antikoru üç yıkama ve fosfat tamponu ile çıkarın. Daha sonra görselleştirme için retinaları monte edin ve oje ile kapatın.

Bu slaytlar karanlıkta dört santigrat derecede saklanmalıdır. Zil seslerinde I fincanından bir kalsiyum görüntüleme tam montaj hazırlığı yaparak başlayın. İlk olarak, retina dokusunu kadranlara ayırın.

Ganglion tabakası yukarı bakacak ve böylece fotoreseptör tabakası aşağı bakacak şekilde kayıt odasına düz bir kadran yerleştirin. Çevredeki alanı bir Kim mendiliyle dikkatlice kurulayın ve yağlanmış arpı nazikçe dokunun üzerine yerleştirin. Şimdi retina preparatını teçhizata yükleyin ve sekiz kanallı yerçekimi tahrikli süperfüzyon sisteminin kurulumunu tamamlayın.

Arp yerleştirildikten sonra monte edilen retina hareket ederse, arpı dikkatlice çıkarın ve temizleyin. Retinayı çevreleyen alanı kurulayın ve arp süperini yeniden monte edin. Kayıt odasını memeli zil çözeltisi ile birleştirin ve çözeltinin %95 oksijen, %5 karbondioksit ile sürekli olarak köpürmesini sağlayın.

İlk olarak, ilaçsız bir kontrol olarak, 33 saniye boyunca üç milimolar ila 60 milimolar arasında iki eşleştirilmiş yüksek potasyum darbesi gerçekleştirin. Depolarize edici olarak, RGC, preparat çalışıyorsa voltaj kapılı kalsiyum kanallarını etkinleştirmelidir. Şimdi deneylere devam edin.

Nifedipin ve L tipi voltaj kapılı kalsiyum kanal blokeri, L tipi voltaj kapılı kalsiyum kanallarının depolarizasyon ile uyarılmış kalsiyum sinyali kobalt arasındaki katkısını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Spesifik olmayan bir kalsiyum kanal blokeri, voltaj kapılı kalsiyum kanallarını seçici olmayan bir şekilde bloke etmek için kullanılabilir. Floresan rgc'nin görüntülerini görselleştirmek ve elde etmek için hazırlığı her beş saniyede bir tarayın.

Mümkün olduğunca düşük bir lazer gücü kullanın. Uyarma 488 nanometreye ayarlanmalı ve emisyon 505 nanometre LP filtre ile toplanmalıdır. Açıklanan protokoller kullanılarak, çoklu ekleme akışına sahip bir RNA bağlayıcı protein olan ganglion hücre proteini RBPMS'ye karşı immün etiketleme yapıldı. Dört.

Boyama gerçekten de antikor spesifikasyonuna bağlı olarak ganglion hücreleri ile sınırlıydı. Daha sonra, voltaj kapılı kalsiyum kanallarının R GC'lerdeki kalsiyum sinyaline katkısı, rgc'den elde edilen floresan yoğunluk değerleri kullanılarak incelenmiştir. Başlangıç seviyelerinde, RGC ve RGC aksonları akış dört ile etiketlenmiş olarak görülebilir.

Floresan yoğunluk değerlerini elde etmek için, ROI'ler ganglion hücresi, somata ve/veya aksonlar üzerine yerleştirildi. Tüm montaj hazırlığına yüksek potasyum uygulandıktan sonra, RG C'lerin floresan sinyali arttı. Bunu, ikinci yüksek potasyum darbesi sırasında kobalt varlığında floresan yoğunluk değerlerinde müteakip bir azalma izledi.

Bu videoyu izledikten sonra, retinal ganglion hücrelerinin bütün bir montaj hazırlığında sentetik bir kalsiyum indikatör kalıbı ile seçici olarak nasıl yükleneceğini iyi anlamalısınız.