HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücresel sitotoksisitelerini ve vahşi tip veya ilaca dirençli HIV'i tek bir tur enfektivite testinde bir kez inhibe etme yeteneklerini belirlemek için ilgilenilen bileşikleri taramaktır. Bu, önce hücrelerin alım için bileşiklere maruz bırakılması ve daha sonra tedavi edilen hücrelerin vahşi tip veya ilaca dirençli HIV birini ifade eden lusiferaz ile inkübe edilmesiyle elde edilir. Virüsün lusiferaz aktivitesi daha sonra ölçülebilir.

Sonuç olarak, lusiferaz okuma sinyali, bileşikler tarafından HIV V bir viral vektör replikasyonunun inhibisyonunu ölçmek için kullanılabilir. Bu teknik, ilaca dirençli HIV'e karşı daha iyi etkinlik sergileyen yeni bileşikleri taramak için kullanılabileceğinden terapötik etkilere sahiptir. Bu tür bileşikler, HIV bir hastalarında antiretroviral tedavilerde potansiyel olarak kullanılabilir Transfeksiyondan bir gün önce, 1.500.000 hücre yoğunluğunda 100 milimetrelik çanaklar üzerinde 93 hücre

Ertesi gün, kalsiyum fosfat yöntemi uygulamasını kullanarak hücreleri 16 mikrogram vahşi tip veya mutant HIV ve dört mikrogram VSV ile transfekte edin. Altı saat sonra, 2 93 hücreyi PBS ile iki kez yıkayın ve ardından 48 saat boyunca taze ortamla inkübe edin. İki gün sonra, 100 milimetre çapındaki çanaklardan S süpernatanları içeren virüsü toplayın ve süpernatantları oda sıcaklığında 1.620 Gs'de 10 dakika boyunca düşük hızlı santrifüjleme ile berraklaştırın.

Daha sonra, süpernatanları 45 mikromolar gözenek boyutunda bir şırınga filtresinden süzün ve viral süspansiyonları turbo DNA'larla tedavi edin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, virüsü taze ortamla seyreltin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Deneyden bir gün önce bir enfektivite testinde bileşiklerin taranmasını gerçekleştirmek için, ilgilenilen hücrelerin 4.000'ini 96'lık bir kuyucuğa tohumlayın.

100 mikrolitre ortamda kuyu plakası ve bunları% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra, bileşiği stok çözeltisinden taze ortama seri olarak seyreltin. Seçilen nihai konsantrasyonlar, tabloda belirtildiği gibi ampirik olarak belirlenmiş bir konsantrasyon aralığına bağlı olacaktır.

Daha sonra, bileşiklerin seri seyreltmesini üç nüsha halinde kuyucuklara ekleyin. Nihai konsantrasyonun hacminin 10'da birinde, bileşiklerin hücrelerle uygun seyreltmesini en az üç saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra, oyukların her birine 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.

Negatif kontrol kuyularını kabul edin. Ardından plakaları 48 saat daha inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 200 mikrolitrelik pipet ucu ile donatılmış bir cam pipet ucu ile donatılmış bir cam pipet kullanarak, ortamın üst kısmından başlayarak ve yavaşça kuyunun alt köşesine doğru ilerleyerek ortamı aspire edin.

Hemen her bir oyuğa 0.5 milimolar magnezyum klorür ile takviye edilmiş 100 mikrolitre PBS ekleyin, daha sonra lusiferaz aktivitesini ölçmek için, lüminesans raportör gen testinden 10 mikrolitre substrat tamponu, sağlanan liyofilize reaktifin her bir şişesine ekleyin. Daha sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre sulandırılmış reaktif ekleyin ve sinyalin gelişmesine izin vermek için plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Son olarak, bir mikroplaka luminometresi kullanarak 96 kuyulu plakayı okuyun.

Başarılı bir bileşik tarama prosedüründen elde edilen lusiferaz değerleri tabloda sunulmaktadır. Potansiyel olarak güçlü bileşiklerin, bu temsili Kaleido greftinde en yüksek sinyali sergileyen kontrol ile artan lusiferaz aktivitesi sergilediğini unutmayın. Bileşiğin konsantrasyonu, Lucifer aktivitesinin inhibisyon yüzdesine karşı, bileşiğin vahşi tip veya ilaca dirençli HIV'in replikasyonunu inhibe etmede etkili olup olmadığını belirlemek için çizilmiştir.

Bu prosedürü denerken, plakaların tüm oyuklarına eşit miktarda hücre ve virüsü doğru bir şekilde dağıtmak ve her bir oyuğa uygun konsantrasyonda bileşik koyduğunuzdan emin olmak önemlidir.