Name: HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Öğrenin, HIV-1'e karşı hücresel sitotoksisite ve antiviral aktiviteyi değerlendirmek için lusiferaz deneyi kullanarak bileşiklerin hızlı taramasını. Bu yöntem, ilaç dirençli suşlara karşı yeni antiretroviral tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma NCI İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Usta Hisse 1. Hazırlanması <ol><li> DMSO içinde test edilecek olan bileşiklerin ana stokları olun. 20 mM&#39;lik bir konsantrasyonda standart stokları hazırlayın. Not: 10 mM üzerinde herhangi bir konsantrasyonu kullanılabilir. Bu analizi doğrulamak için pozitif kontrol olarak kullanılabilir bileşikler RAL, EVG ve DTG içerir. </li><li> Emin bileşikler 15 saniye için çözümler birden çok kez vorteks ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek DMSO içinde çözündürülür. Kullanılana kadar -20 ° C&#39;de karanlıkta, 20 mM stok çözelti saklayın. </li></ol> Bileşik elemesi için 96 oyuklu plakalar, 2. Hazırlanması <ol><li> Test edilecek olan hücre hattı (örneğin, HOS veya TZM-bl) seçin ve (ortam içinde (4000 hücre / göz) 4 x 10 4 hücre / ml bir yoğunlukta bu hücrelerin 100 ul tohum örneğin Dulbecco tadil edilmiş Eagle ya da DMEM ortamı % 5 (v / v) fetal sığır serumu,% 5 yeni doğmuş buzağı serumu ve penisilin (50 birim / ml) ile takviye edilmiş artı streptomycin). </li></ol> Virüs Hisse 3. Nesil 32-34 (Şekil 1, aşama 1 &#39;de gösterildiği gibi), 293 hücrelerinin transfekte edilmesiyle VSV-g-psödotipli HIV üretir. <ol><li> , Transfeksiyondan önce günde, 1.5 x 10 6 hücre yoğunluğunda olacak şekilde 100 mm&#39;lik çapı olan kaplara 293 hücreleri üzerinde plaka. </li><li> , Kalsiyum fosfat yöntemi kullanılarak 35 ve 4 VSV (pHCMV-g) ug - transfeksiyon gününde, 16 vahşi tipli ya da mutant HIV (ΔLUC pNLNgoMIVR) içinde 293 ug hücreleri transfekte. </li><li> Kalsiyum fosfat çökelti, yaklaşık 6 saat sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez yıkama ve 293 hücreleri 48 saat süreyle taze ortam ile inkübe ilave edilir. [DMEM% 5 (v / v) fetal bovin serumu,% 5 yeni doğmuş buzağı serumu ve penisilin (50 birim / ml) artı streptomisin (50 ug / ml) ile takviye edilmiş]. </li><li> 100 mm çapında olan ortam kaldırarak supernatantları içeren virüs hasatyemekler, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Turbo DNase ile süpernatantlar tedavi, bir 45 mikron gözenek boyutunda bir şırınga filtreden geçirilerek filtre üst fazlar, 10 dakika için 3000 rpm&#39;de düşük hızlı santrifüjleme ile süpernatantlar açıklık ve enfeksiyon deneylerinde hazırlanması için ortam içinde süpernatantlar seyreltik . -80 ° C&#39;de, alikolar içinde dondurulmuş viral süpernatantlar saklayın Not: süpernatan içinde p24 miktarı, bir HIV-1 p24 enzim-bağlı immünsorbent deney paketi kullanarak belirlenir. P24 konsantrasyonu numunedeki virüs miktarını kontrol etmek için kullanılır. Virüs yaklaşık 500 ng enfeksiyon öncesi günde 1.5 x 10 5 hücre / tabak yoğunluğunda 60 mm&#39;lik çapı olan kaplara üzerine kaplanmıştır HOS hücrelere ilave edilir. Inkübasyon 48 saat sonra, hücreler hasat edilir santrifüj ile toplandı, yıkandı ve 100 ul PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Lüminesans raportör gen deneyi reajanı eşit miktarda ekleyin ve bölümler 5.4.1 &#39;de tarif edildiği gibi lusiferaz etkinliğini ölçmek ve5.4.2. Adım 4.6 &#39;da ele alındığı gibi, bu kaynaktan, virüsün uygun bir seyreltme yapılabilir. </li></ol> 4.. 96 oyuklu plakalar içerisinde bileşik Tarama , Üç kopya halinde her bir bileşik taraması ve sonuçları ortalama. Not: viral replikasyonu üzerindeki her bir bileşiğin etkisi, herhangi bir bileşik olmadan elde edilen replikasyon düzeyine normalize tarafından düzeltilir. <ol><li> Taranması için deneysel konsantrasyon aralığını belirler. Not: Genellikle, 11 seri seyreltme ile ekranlar kolon ve bunu 7 seri seyreltme ile ekranlar ile plaka kolona bileşiğin eklenmesi ile yapılır satıra göre olan bileşiğin eklenmesi suretiyle yapılır. Kuyuların set biri üçlü bileşik yok kontrolü için ayrılmış olmalıdır. Buna ek olarak, tek bir sütun ya da bir satır negatif / arka plan kontrolü olarak hareket için boş olması gerekir. Virüs ilave edilmiş ise Son olarak, bu hücresel sitotoksisite tahlili ya da enfekte olup olmadığını belirleyecektir. </li><li> Hazırlamak20 mM stok çözeltisinden seri seyreltileri. (Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi) konsantrasyonları, test edilecek konsantrasyonları ampirik bir biçimde tespit aralığına bağlı olarak seçilir. Nihai konsantrasyon 100 uM olacak, yani eğer, bir 1 mM çalışma stok yapmak, 10x istenen nihai konsantrasyon ortam içinde seyreltim dizileri hazırla. Not: 50 s 5-10 mm yukarıda IC ile bileşikleri ilaç geliştirilmesi için genellikle iyi bir aday değildir. İlk deneylerde sadece WT vektör karşı bileşikleri test edin. Etkin bir şekilde inhibe eden vektör WT gelecek vaat eden bileşikler, daha sonra, ilaç dirençli mutantların bir paneline karşı test edilir. </li><li> (Şekil 1, aşama 2&#39;de gösterildiği gibi) inkübatör 96 oyuklu plakalar çıkarın ve üç kopya halinde oyuklara test edilecek bileşiklerin seri dilüsyonları ekleyin. Not: oyuğuna ilave hacmi nihai konsantrasyonu 1/10 hacim olmalıdır. Sonuç olarak, 22 ul / oyuk (nihai hacim s eklemekost virüs enfekte ek tahliller için 220 ul) &#39;dir. Sitotoksisite analizi için, 11 ul / oyuk (son hacim 110 ul / oyuk olan) ekleyin. </li><li> Inkübatör 96 oyuklu plakalar döndürür. Hücresel sitotoksisite ekran için, 37 ° C&#39;de 96 oyuklu plakalar, 48 saat inkübe edilir ve başka bir manipülasyon Protokolü 4 ihtiyaç vardır: Protokol 5&#39;e geçin enfekte tahlilleri için, Protokol 4 talimatları takip etmektedir.. </li><li> Enfekte edebilirlik analizleri, sadece. Analiz edilecek bileşikler ile 37 ° C &#39;de 3 saat inkübasyondan sonra, en az bir inkübatör plakaları çıkarın. Not: Bu bileşik, HIV vektör ile enfeksiyon öncesinde hücreler tarafından alınmasını sağlar. </li><li> Virüsün 33 &#39;lik bir stok seyreltme hazırlayın, 34 (genellikle yaklaşık 01:03) muamele edilmemiş hücrelerdeki 0,2-1,5 olan nisbi lusiferaz birimlerine (RLU) arasında bir lusiferaz sinyal üretecek. Bütün bir plaka Dilu yaklaşık 10 ml alacakted virüs. 8 ya da 12 kanallı pipet kullanarak, kuyu her virüsün 100 ul ekleyin. Negatif / arka plan kontrol kuyuları için virüs katmayın. 48 saat boyunca 37 ° C inkübatör plakaları dönün. Not: Virüsün stok 1:03 seyreltme viral üstte yüzen madde içindeki konsantrasyonu, yaklaşık 500 ml 1.0 ng olduğunu gösteren bir p24 deneyinde göre 0.2 -1.5 arasında, bir lusiferaz RLU sinyal üretecek tipik bir dilüsyonudur. </li></ol> 5. Hazırlanması ve 96 kuyucuklu plaklar içinde NE sitotoksisi ve enfektivitesini Ölçümü <ol><li> Kuyulardan medya aspire (medyada fenol kırmızı lusiferaz sinyali etkileyebilir). Ucuna bağlanmış bir 200 ul pipet ucu ile bir cam pipet kullanın. Medyanın üstünde başlamak ve yavaş yavaş kuyunun alt köşesinde aşağı doğru çalışır. Kuyunun alt kısmında çok fazla zaman harcamak etme, ya da hücreler de kaldırılabilir. </li><li> PBS içinde 100 ul ekle 0,5 m ile desteklenmişHer bir oyuğa M MgCI2. Bu hücreler, kurumaz, böylece ortam çıkarılır hemen sonra yapılması gerekmektedir. </li><li> Sadece sitotoksisite deneyleri için, liyofilize edilmiş bir reaktif temin her şişeye Luminescence ATP algılama tahlilinden alt-tabaka tampon maddesi 5 ml ekleyin. Bir şişe, 96 oyuklu bir plaka için yeterlidir. <ol><li> Her bir oyuğa Luminescence ATP tarama deneyinde hücre liziz tamponu 50 ul ekle. Kompakt bir termomikser ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 700 rpm&#39;de 96 oyuklu plaka çalkalayın. </li><li> Negatif kontrol / arka plan gözü hariç bütün oyuklara yeniden Luminescence ATP tespitinde maddesi 50 ul ekle. Kompakt bir termomikser ile 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 700 rpm&#39;de çalkalanır. Sinyal gelişimi için zaman tanımak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Mikro luminometre kullanılarak 96 oyuklu plaka okuyun. Not: SoftMaxPro mikrolevha Lüminometre programını açın. Emin Lüminometre lumi ölçmek için ayarlanmış olduğundan emin olun5 okuma / iyi bir duyarlılıkta lüminesans. </li></ol></li><li> Sadece enfekte deneyleri için, liyofilize edilmiş bir reaktif temin her şişeye Luminescence raportör gen tahlili ikinci alt-tabaka tampon maddesi 10 ml ekleyin. Bir şişe her bir 96-çukurlu plaka için yeterlidir. <ol><li> Her bir oyuğa yeniden Luminescence raportör gen tahlili tepkin maddesi 100 ul ekle. Sinyal gelişimi için zaman tanımak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bölüm 5.3.3 &#39;de yapıldığı gibi, bir mikro-luminometre kullanılarak 96 oyuklu plaka okuyun. </li></ol></li></ol> Bileşikler CC 50 ve IC 50 Değerleri 6.. Belirlenmesi <ol><li> Bir excel elektronik tabloya mikrolevha lüminometre gelen lusiferaz veri aktarımı. <ol><li> Ortalama hem de üç kopya ve arka plan / kontrol sinyal verileri lusiferaz verileri. Tüm konsantrasyon aralığı için ortalama üç nüsha sinyalden ortalama arka zemin / kontrol sinyali çıkarın. </li> &lt;li&gt; arka bu inhibisyon yüzdesi belirlemek için herhangi bir bileşik yokluğunda, sitotoksisite veya enfekte olup olmadığını, aktivitesine karşı konsantrasyon aralıkları için ortalama sinyali düzeltilmiş Normale. Not: yüzde önleme 100 ile çarpılarak ilacın yokluğunda lusiferaz aktivitesi ile bölünen ilaç varlığında, lusiferaz aktivite olarak tanımlanır. </li></ol></li><li> CC 50 ve IC 50 değerlerini elde etmek Kaleidagraph yazılım programını kullanın <ol><li> Ampirik bir biçimde tespit konsantrasyon aralığını ve KaleidaGraph içine lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi her iki aktarın. </li><li> X ekseni üzerinde konsantrasyon aralığı ve Y ekseni üzerinde lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi ile veri çizilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li>
<li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li>
<li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li>
<li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland%3A+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li>
<li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+indinavir%2C+zidovudine%2C+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li>
<li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+dynamics+in+vivo%3A+virion+clearance+rate%2C+infected+cell+life-span%2C+and+viral+generation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li>
<li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li>
<li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+adherence+interventions%3A+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li>
<li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li>
<li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr%22%5BJournal%5D)">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li>
<li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir%2Femtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients%3A+156-week+results+from+STARTMRK%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li>
<li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum%2C+prevention%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li>
<li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+daily+dolutegravir+%28S%2FGSK1349572%29+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV%3A+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1%2C+a+dose-ranging%2C+randomised%2C+phase+2b+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li>
<li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-formulated+elvitegravir%2C+cobicistat%2C+emtricitabine%2C+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz%2C+emtricitabine%2C+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+phase+3+trial%2C+analysis+of+results+after+48+weeks%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li>
<li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abacavir%2Flamivudine+versus+tenofovir+DF%2Femtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV%3A+final+results%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li>
<li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+virus+assay%3A+a+rapid%2C+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li>
<li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li>
<li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li>
<li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+DNA+integration%3A+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li>
<li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li>
<li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raltegravir%3A+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li>
<li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elvitegravir%3A+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Opin.+Invest.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li>
<li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S%2FGSK1349572%2C+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicr.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li>
<li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med%22%5BJournal%5D)">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li>
<li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li>
<li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li>
<li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors%2C+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li>
<li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li>
<li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li>
<li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Rev%22%5BJournal%5D)">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li>
<li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Med%22%5BJournal%5D)">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li>
<li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li>
<li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+%28S%2FGSK1349572%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li>
<li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li>
<li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2%27%2C3%27-dideoxy-3%27-thiacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li>
<li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li>
<li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li>
<li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz, sitotoksisite ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 hem de replikasyonunu inhibe etme kabiliyetleri açısından bileşikleri taramak için kullanılabilecek bir hızlı, etkili ve yeniden üretilebilir bir deneyi tarif eder. Hızla bileşikleri belirlemek ve etkinliğini ve sitotoksisite test etmek için yeteneği, HIV-1&#39;e karşı, yeni ve geliştirilmiş ilaçların geliştirilmesinde önemlidir. Kurşun bileşikleri belirlendikten sonra, kurşun bileşiği analogları üretilen ve aynı deneyi kullanılarak test edilebilir. Tahlil oldukça basittir. Kullanıcının en sık karşılaşılan sorunlar (zehirli bileşikler, vektör stoku ile ilgili sorunlar) teşhis etmek için izin hem pozitif ve negatif kontroller vardır. Ilavesiz bileşiği ile kuyu, üçlü bir dizi kullanım, virüs tarafından enfeksiyon meydana geldiğini göstermektedir. Sitotoksisite bağımsız deneyde ölçülür olması viral replikasyonu üzerindeki özel bir etkisi olarak sitotoksisiteye neden lusiferaz bir azalma yanlış yorumlanması önler. Kritik adımlarHücrelerin eşit olarak kuyu her virüsün aynı miktarda eklenmesi, ve lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi, oyuklar test edilecek bileşiklerin uygun konsantrasyonları sahip olduğu, kuyularda, dağıtılır ve böylece protokolde plakaları hazırlanıyor CC 50 ve IC 50 değerleri belirlemek. Tahlil, kasa sayısal ve tekrarlanabilir. Vektör, replikasyon kusurlu olduğu için deney güvenlidir. Doğru ve uygun denenebilir lüsiferoz ifade eden bir tek yuvarlak vektör, dayalı olduğu için tahlil nicel ve tekrarlanabilir. Bir çok yuvarlak virüs çoğaltma tahlilinde, ölçülen IC50 viral yaşam döngüsü sayısına bağlıdır; deneyler WT ve önemli ölçüde farklı çoğaltma kapasitelerine sahip olabilir, ilaç dirençli iki virüs içeren bu bir sorundur. Birkaç enzimatik deneyler bu olabilir orada önceden bildirilmiştirIN inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir. Entegre DNA ölçmek için gerçek zamanlı PCR teknolojisi içeren deneyler daha emek yoğun ve 36, 37 her ikisi de pahalıdır, saflaştırılmış rekombinant protein (ler) gerektirir, ve genel olarak, bulunmaktadır. Bu, diğer viral enzimler (RT ve proteaz) üzerinde bileşiklerin etkisini ölçmek için enzimatik testleri kullanmak mümkün olsa da, her bir enzim, kendi deney sistemi gerektirir. Bir yuvarlak deney vektörü tarif edildiği gibi, RT inhibitörlerinin taranması için, değişiklik olmadan, kullanılabilir. Benzer bir deney, proteaz inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir; Bununla birlikte, bir proteaz inhibitörü deneyde, bileşikler vektörlerini üretmek için kullanılan hücrelere ilave edilmelidir. İlgili bir deney, çeşitli hücreler ve vektörler kullanılarak, aynı zamanda zarf (env) ve HIV giriş füzyon inhibitörlerinin taranması için kullanılabilir. Son olarak, deney otomatik robot dağıtım aracı ile birlikte, daha büyük bir ölçekte, kullanılabilir. Bu nedenle, tahlil, WT ve m karşı bileşiklerin büyük kütüphaneleri taramak için kullanılabilirutant HIV. Ancak, gerçek deney verileri yorumlamakta bir sınırlama viral yaşam döngüsü noktaları farklı aşamalarında hareket HIV replikasyon inhibitörü algılayabilir. Kendi başına deney, yaşam döngüsünde adım bir bileşik ile bloke edildiği tanımlamaz. Bu soru doğarsa, bu ilave tahliller 38 saati kullanılarak çözüldü ve saflaştırılmış rekombinant viral proteinlere karşı bileşiği test tarafından yapılabilir. Ne yazık ki, anti-HIV ilaç başarıya rağmen, direnç ve toksisite hem de sorunlar hala var. Etkili bir anti-HIV aşı yokluğunda, mevcut ilaç dirençli mutantların karşı etkili olacak, ancak aynı zamanda virüsün yayılmasını azaltmak önleyici ilaçlar geliştirmek için yeni bir tedavi edici ilaçlar geliştirmek için sadece bir ihtiyaç vardır. Anti-HIV ilaçlarının profilaktik kullanımı bulaşmamış insanların tedavi incudes ise, bu yaklaşım l var olan ilaçların geliştirilmesi üzerinde özel bir yük getireceğiittle veya uzun süreli toksisite.

HIV-1 viral yaşam döngüsündeki çeşitli temel adımları hedefleyen ilaçların durumuna çok HIV-1 enfeksiyonlarının tedavisi ve uzun vadeli hayatta kalma geliştirdi kombine ilaç tedavisi (yüksek oranda aktif bir anti retroviral terapi olarak adlandırılan veya HAART) yol açmıştır Hastaların. Tipik olarak iki, nükleosid ters transkriptaz (RT) inhibitörü ve bir proteaz inhibitörü ya da bir nükleosid olmayan bir RT inhibitörü kombinasyonlarını kullanan HAART, şimdi bir yaşam boyu durum 1-5 içine ölümcül bir hastalık dönüştürülmüş bulunmaktadır. Ancak, viral replikasyonunun zaman içinde tutulan bastırılmasına içinde HAART çok başarılara rağmen, bu sınırlamaları vardır. HAART&#39;a HIV ortadan kaldırmak değildir, bu nedenle hastalar tedavi edilmez ve tedavi hayat uzun. Ilaç toksisitesi ve ilaca dirençli suşların ortaya çıkması ile sorunlar vardır. Direnç HIV integrazın (IN) hedef yeni onaylanan ilaçlar dahil onaylı anti HIV ilaçları, tüm ortaya çıkabilir. İlaç direnci muhtemelen beca doğarViral replikasyon (3 x 10 -5 mutasyonlar / baz / çoğaltma döngüsü hata oranı) sırasında meydana gelen spontan mutasyon kullanım 6. Mutasyonlar anti-retroviral ilaç hedefleri kodlayan genlerde ortaya çıkar, bu mutasyonların küçük alt ilaçlara viral suşun duyarlılığında bir azalmaya yol açacaktır. Ilaç direncinin geliştirilmesini önlemek için, bir ilaç konsantrasyonu tam olarak HIV çoğalmasını önlemek seviyede muhafaza edilmelidir. Tedavi rejimine kötü bağlılık sorunu şiddetlendirir, ve direnç 7-9 hızlı gelişimine yol açabilir. İlaç konsantrasyonları farklı emilim, metabolizma, dağıtım, ve boşaltım seviyelere hastalarda değişebilir olmasına rağmen, yüksek ilaç konsantrasyonları toksisite 10 yol açabilir. Tedavi hastanın yaşam boyunca devam yana, anti-retroviraller uzun süreli toksisite konusunda ciddi güvenlik endişeleri vardır. HAART yaygın kullanılan anti-retroviraller olumsuz etkilere sahip olabilir and yan etkileri yaşamı tehdit 11-15 oylandı olaylar olmuştur. Hastalar direnci ve toksisite gelişimi ile karşılaşma sorunları etkili bir şekilde çok az veya hiç toksisite ile uzun süreli virüsün ortak ilaca dirençli türlerinin çoğalmasını bloke yeni ilaçlar geliştirmek için ihtiyaç altında yer alır. Bu nedenle, hızlı bir şekilde, viral yaşam çevriminde temel adımları bloke bileşiklerin taranması için bir analiz için bir ihtiyaç vardır. Burada bir bileşikler ve hızlı ve verimli bir şekilde WT ve ilaca dirençli HIV türlerinin her ikisinin replikasyonunu bloke etme kabiliyetleri sitotoksisitesini değerlendirmek için kullanılabilecek etkili bir tahlili tarif eder. Kullandığımız deney hasta 16-18 izole virüs ilaç direnci taranması için geliştirilmiş bir deneyde benzer. Deney HIV ters transkripsiyon engelleyebilir bileşikler için ekrana değişiklik olmadan da kullanılabilir olsa da, descri doyurmayaibe inhibitörleri IN değerlendirmek için tahlil kullanılarak. IN hücresel genom içine 19 ekler viral DNA, bir viral temel bir enzimdir. Inhibitörleri umut verici bir dizi geliştirilmektedir da, bazıları halen, sadece Isentress 20, 21 (aynı zamanda Raltegravir veya RAL olarak da bilinir), klinik denemeler sürmektedir ve son zamanlarda, Elvitegravir (EVG) 22 ve Dolutegravir (DTG) 23 olmuştur FDA tarafından onaylanmıştır. Bu bileşikler, HIV Yatak ve hücre kültüründe non-B alt tipleri hem karşı ve hastaların 24, 25 aktiftirler. Bununla birlikte, RAL ile tedavi Y143R, N155H ve G140S/Q148H 24, 26-31 de dahil olmak üzere mutantlan, IN ilaca dirençli HIV-1 için seçer. N155H ve G140S/Q148H ayrıca bu direnç mutasyonlarına karşı etkili olan iplikçik transfer inhibitörleri (INSTIs) IN ikinci nesil tasarım ve geliştirilmesi gereğini vurguluyor EVG etkinliğini azaltmak.

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Lüminesans ATP Algılama Test Sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus Yüksek Hassasiyetli Lüminesans Raportör Gen Test Sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun PBS</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Sinerji Yazılımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell Beyaz Polistiren Plaka</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Termomikser Kompakt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Teknolojileri-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Millex HA Filtre Ünitesi, 0.45 & M</td><td>Millipore SLAHA033SS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İttifakı HIV-1 p24 Elisa Kit</td><td>, Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>HOS hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl hücreleri</td><td>NIH AIDS Reaktif Programı</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3 & Delta; Env.LUC</td><td>NIH-NCI HIV İlaç Direnci Programı- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI HIV İlaç Direnci Programı- Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

hiv ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Anti-HIV ilaçlarının bir dizi kabul edilmiş olmasına rağmen, toksisite ve ilaç direnci ile ilgili sorunlar hala mevcuttur. Bu, en az toksisite ile ortak bir ilaç dirençli HIV-1 suşları ile enfeksiyonu önleyebilen yeni bileşiklerin belirlenmesi için bir ihtiyaç gösterir. Burada, hızlı hücre sitotoksisitesinin ve WT ve mutant virüs suşlarına karşı bir bileşiğin etkinliğinin belirlenmesi için kullanılabilecek etkili bir deneyi tarif eder. Arzu edilen hedef hücre hattı, 96 oyuklu bir plaka içerisinde tohumlanmıştır ve 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, test edilecek bileşiklerin seri seyreltileri ilave edilir. Daha başka manipülasyonlar hücresel sitotoksisite deneyleri için gerekli olan; anti HIV lusiferaz hücrelere ilave edilir eksprese eden bir WT veya ilaç dirençli HIV-1 vektörü ya da bir önceden belirlenmiş miktarda deneyleri. Sitotoksisite, bir ATP bağımlı parlaklık deneyi ve enfeksiyon üzerinde bileşiklerin etkisini kullanarak ölçülür lucife miktarının belirlenmesi ile ölçülürvarlığında ya da varsayılan inhibitör yokluğunda rase. Bu tarama deneyinde tamamlamak için 4 gün sürer ve çok sayıda bileşiğin paralel olarak taranabilir. Bileşikler üç kez taranır ve veri hedef bileşiklerin yokluğunda enfekte / ATP seviyeleri normalleştirilir. Bu teknik potansiyel anti HIV bileşiklerin etkinliği ve toksisite hızlı ve doğru ölçüm sağlar.

Tahlil (Şekil 1, adım 1 ve 2) başarılı bir şekilde gerçekleştirildi, daha sonra lusiferaz değerleri Tablo 2&#39;de sunulan veriler benzemelidir konsantrasyon aralığında tarama.; Potansiyel olarak kuvvetli bir bileşik, soldan sağa lusiferaz aktivitesinin arttırılması ortaya çıkaracaktır, ve kontrol, yüksek lusiferaz aktivitesi olmalıdır. Lusiferaz aktivitesi konsantrasyon aralığında 0,1 Bağıl Lusiferaz birimlerine (RLU) geçmez, bu genellikle bileşiğin hücreleri öldürdüğünü gösterir. Lusiferaz veriler, daha fazla ya da tüm seri seyreltileri karşısında 2.0 RLU eşit ise, bileşikler, test edilen konsantrasyonlarda HIV-1 enfeksiyonlarının inhibe etmek mümkün değildi. Kaleidagraph (Tablo 3, bölüm A) içinde lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi karşı bileşiklerin konsantrasyonunu çizimi, lineer regresyon analizi ile, t benzer sonuçlar üretecek<html> Tablo 3, Kısım B&#39;de gösterilen hortum <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> HIV-1 viral stoklar ve hücresel toksisite ve tek yönlü bir bulaşıcılığı Tahliller Kur Şekil 1.. Hazırlanması. Adım 1 &#39;de, 293T hücreleri pNL4.3ΔEnv.LUC ve VSV-G ile transfekte edilir ve 34 virüs üretmek için 48 saat boyunca kuluçkaya yatırılmıştır . Bu enfekte deneylerinde kullanılıncaya kadar virüsü (alikotları -80 ° C&#39;de donduruldu) toplanır ve depolanır. Adım 2 için, HOS hücreler, 96 oyuklu plaka içerisine tohumlanır ve 24 saat için kuluçkalanmıştır. Hücreler daha sonra 3 saat boyunca, test edilecek bileşiklerin seri seyreltileri ile önceden yatırıldı ve daha sonra virüs (WT ya da ilaç dirençli iki) ile enfekte edilir. 48 saatlik bir inkübasyondan sonra, lusiferaz hareketliliği ölçülür. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tablo 1. Seri Seyreltme Prototip tarama Drug. Bir daha sıkı bir tarama tipik olarak 10 uM başlar ve 0.0005 uM &#39;da sona 11 seri dilüsyonları içerir. Seri seyreltmeler 10x hazırlanır; 100 ul hücre ve de her virüsün 100 ul) vardır. Bu hacim ve bu hesaplamalar neticesinde de, seri seyreltiler, bütün bir 96-yuvalı plakanın 3 satır için yeterli olacaktır. Sitotoksisite deneyleri, aynı şekilde hazırlanır; Bununla birlikte 11 seri seyreltme 250 uM başlar ve 0.05 uM &#39;da sona. Seyreltileri sadece 11 ul hücre 100 ul içeren plaka içindeki oyuklara ilave edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">bu şekilde daha büyük bir sürüm görüntülemek için tıklayın.</a> <img alt="Tablo 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tablo 2. Lusiferaz Sinyal veri okuma ve lusiferaz aktivitesi, bir yüzde Önlenmesinin Belirlenmesi. Verileri tablosu bir başarılı bir bileşik için lusiferaz verileri tipik bir dizi gösterir. Tabloda ayrıca lusiferazm yüzde önlenmesini ve CC 50 ve IC 50 değerlerini belirlemek için gerekli ek hesaplamaları gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tablo 3. Doğrusal Regresyon Analizi Veri Tablosu. Kısım A. KaleidaGraph lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi karşı kullanılan konsantrasyon aralığını Grafik uygun inhibisyon eğrileri üretecektir. Kısım B, inhibisyon eğrileri, 3 parametrik tanımlanırSigmoidal fonksiyonu ve lineer regresyon ile verilere uygun 18 analizleri. Bu veriler tablo, daha sonra% 50, örneğin, IC 50 ve CC 50 ile virüs entegrasyon ve hücresel sitotoksisite engellemek için gerekli ilaç konsantrasyonlarını hesaplamak için Microsoft Excel ile birlikte kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilgi duyulan bileşikleri tek tur enfektivite testi ile hücresel sitotoksisitelerini ve yabanıl tip veya ilaca dirençli HIV 1'i inhibe etme yeteneklerini belirlemek için taramaktır. Bu işlem, öncelikle hücrelerin bileşikleri alması için bu bileşiklere maruz bırakılması ve ardından işlem görmüş hücrelerin lusiferaz eksprese eden yabanıl tip veya ilaca dirençli HIV 1 ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra virüsün lusiferaz aktivitesi ölçülebilir.Nihayetinde, lusiferaz okuma sinyali, bileşiklerin HIV V one viral vektör replikasyonundaki inhibisyonunu nicelleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, ilaç dirençli HIV'e karşı daha iyi etkinlik gösteren yeni bileşiklerin taranmasında kullanılabileceği için terapötik çıkarımlara sahiptir. Bu tür bileşikler, HIV one hastalarında antiretroviral tedavilerde potansiyel olarak kullanılabilir. Transfeksiyonun bir gün öncesinde, 100 milimetrelik kaplara 1.500.000 hücre yoğunluğunda 2 93 hücreleri ekleyin.Ertesi gün, kalsiyum fosfat yöntemi kullanarak hücreleri 16 µg yabani tip veya mutant HIV ve 4 µg VSV ile transfekte edin. Yaklaşık altı saat sonra, 293 hücrelerini iki kez PBS ile yıkayın ve ardından taze besiyeri ile 48 saat boyunca inkübe edin. İki gün sonra, 100 mm çapındaki kaplardan virüs içeren S süpernatanlarını toplayın ve süpernatanları oda sıcaklığında 1.620 Gs'de 10 dakika boyunca düşük hızlı santrifüjle berraklaştırın.Ardından, süpernatanları 45 micromolar gözenek boyutuna sahip bir şırınga filtresinden süzün ve viral süspansiyonları turbo DNAs ile işleme tabi tutun. Oda sıcaklığında 30 dakika beklettikten sonra, virüsü taze besiyeri ile seyreltin ve minus 80 degrees Celsius'ta saklayın. Deneyden bir gün önce, bir enfektivite analizinde bileşiklerin taramasını gerçekleştirmek için, ilgili hücrelerden her bir 96 kuyucuklu plağın kuyucuğuna 4,000 adet hücre ekin.Kuyucuk plakasını 100 µL besiyerine alın ve 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edin. 24 saat sonra, stok çözeltideki bileşiği taze besiyeri içerisinde seri olarak dilüe edin. Seçilecek nihai konsantrasyonlar, tabloda belirtilen ampirik olarak belirlenmiş konsantrasyon aralığına bağlı olacaktır.Ardından, bileşiklerin seri dilüsyunlarını kuyucuklara üç paralel şeklinde ekleyin. Son konsantrasyon hacminin onda biri oranında, bileşiklerin uygun dilüsyunlarını hücrelerle en az üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrasında, her bir kuyucuğa 100 µL dilüe virüs eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.Negatif kontrol kuyucuklarını kabul edin. Ardından plakaları 48 saat daha inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kuyucuklardaki medyayı aspire etmek için 200 microliter pipet ucu takılmış bir cam pipet kullanın; aspirasyona medyanın üst kısmından başlayarak yavaşça kuyucuğun alt köşesine doğru ilerleyin.Her bir kuyucuğa hemen 0,5 milimolar magnezyum klorür ile desteklenmiş 100 mikrolitre PBS ekleyin; ardından lusiferaz aktivitesini ölçmek için, sağlanan liyofilize reajen tüplerinin her birine lüminesans raporlayıcı gen analiz kitindeki substrat tamponundan 10 mikrolitre ekleyin. Sonrasında, her bir kuyucuğa yeniden konstitüe edilmiş reajenden 100 mikrolitre ekleyin ve sinyalin gelişmesi için plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Son olarak, 96 kuyucuklu plakayı bir mikroplak lüminometre kullanarak okuyun.Başarılı bir bileşik tarama prosedüründen elde edilen lusiferaz değerleri tabloda sunulmuştur. Potansiyel olarak etkili bileşiklerin artan lusiferaz aktivitesi sergilediğine ve bu temsili Kaleido greftinde kontrol grubunun en yüksek sinyali verdiğine dikkat ediniz. Bileşiğin replikasyonu inhibe etmedeki etkisini, yabani tip veya ilaca dirençli HIV üzerinde belirlemek amacıyla bileşik konsantrasyonuna karşı lusiferaz aktivitesinin inhibisyon yüzdesi grafiğe dökülmüştür.Bu prosedürü uygularken, plakaların tüm kuyucuklarına eşit miktarda hücre ve virüsün doğru şekilde dağıtılması ve her kuyucuğa uygun konsantrasyonda bileşik konulduğundan emin olunması önemlidir.

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

Antiretroviral tedavisi (ART) başarısız HIV-1 enfekte bireyler için ilaç direnci test gelecekteki tedaviler rehberlik ve tedavi sonuçlarını artırabilir. HIV yaygınlığının yüksek ama kaynak sınırlı ayarları optimize bireysel ve nüfus sağlık çıktıları sonuçta uygun fiyatlı ve erişilebilir ilaç direnci genotiplendirmesi ve yorumlama yöntemlerini gerektirir.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

Bu rapor, akut enfekte olmuş hücrelerin sitoplazmik ekstraktlarında insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) ön entegrasyon kompleksi (PIC) ile ilişkili entegrasyon aktivitesini ölçmek için bir in vitro testi açıklar. PIC ile ilişkili HIV-1 DNA'sının heterolog hedef DNA'ya entegrasyonu, iç içe geçmiş bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu stratejisi kullanılarak ölçülür.

Ölçümü İn Vitro HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

Bu el yazması, aynı anda yukarı akış ve aşağı akış vektör-konakçı bağlantı DNA'sını analiz edebilen çift yönlü bir entegrasyon alanı tahlilinin deneysel prosedürünü ve yazılım analizini anlatmaktadır. Çift yönlü PCR ürünleri, herhangi bir aşağı akım sıralama platformu için kullanılabilir. Ortaya çıkan veriler, entegre DNA hedeflerinin yüksek verimli, niceliksel bir karşılaştırması için kullanışlıdır.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Rekombinant retroviral integrase ve DNA reaksiyonlar viral DNA uçları taklit eden bir intasome bilinen bir enzimatik etkin kompleks oluşabilir. Intasomes biyokimyasal, yapısal ve Kinetik çalışmalar için kullanılır. Bu protokolü nasıl bir araya getiren ve prototip köpüklü virüs intasomes arındırmak ayrıntılı.

Derleme ve prototip köpüklü virüs Intasomes arıtma

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Burada yeni doğmakta olan 3'-termini tarafsız bir belirlenmesi yanı sıra tek iplikçikli DNA moleküllerinin mutational profilleri sağlar bir derin sıralama yaklaşım mevcut. Ana uygulama doğmakta olan retroviral tamamlayıcı DNA'lar (cDNAs), retroviral Ters transkripsiyon işlemi sırasında oluşturulan ara ürün karakterizasyonudur.

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

Bu çalışmada, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini yüksek verimli bir tarama formatında taramak için replikon bazlı ve viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan protokolleri açıklıyoruz.

Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

Bu çalışma, Numaralandırılmış Etravirin'i HIV için umut verici bir terapötik ajan olarak tanımlamak için in silico stratejiler kullanmıştır. Moleküler etkileşimler ve dinamikler hakkındaki bulgularımız, olası HIV tedavi alternatifleri olarak yeni NNRTI'lerin rasyonel tasarımını desteklemektedir.

Nükleotid Olmayan Ters Transkriptaz İnhibitörlerinin Kantitatif Yapı-Aktivite İlişkisi, Aktivite Tahmini ve Moleküler Dinamiği

Öğrenin, HIV-1'e karşı hücresel sitotoksisite ve antiviral aktiviteyi değerlendirmek için lusiferaz deneyi kullanarak bileşiklerin hızlı taramasını. Bu yöntem, ilaç dirençli suşlara karşı yeni antiretroviral tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Daha fazla video keşfet