İnce tabaka kromatografi (TLC) Ayırımı ve bitki özleri Biyodenemeler Antimikrobiyal Bileşikler tanımak

Bu prosedürün genel amacı, anaerobik bakterilere karşı antimikrobiyal etki gösteren bitki metabolitlerini tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle bir bitki ekstraktının ince tabaka kromatografisi veya TLC ile ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, kromatogram bir veya daha fazla bileşik içeren bölgelere ayrılarak kesilir.

Ardından bölgeler, anaerobik bakterilerle ekilmiş agarlar üzerine yerleştirilir ve inkübasyona bırakılır. İnkübasyonun ardından bölgeler kaldırılır ve bakteriyel büyümeyi inhibe eden bileşikleri belirlemek için plaklar boyanır. Elde edilen veriler, antimikrobiyal bitki metabolitlerinin varlığını veya yokluğunu ortaya koyar.

Bu yöntem, bitkisel ikincil metabolitlerin belirli mikroorganizmalar tarafından besin maddesi kullanımına etkileri gibi ruminant besleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, rumen bakterileri için inhibitör olan bitki bileşiklerini ortaya çıkarsa da diğer bakteri veya funguslar için inhibitör olan bileşiklerin belirlenmesinde de uygulanabilir.

Bu protokolde, temas biyografisi yoluyla antimikrobiyal bileşiklerin tanımlanmasını göstermek için kırmızı yonca iletCik phenolic bileşikleri kullanılacaktır. Çalışmaya, çeker ocak altında ince tabaka kromatografisi veya TLC plaklarını temizleyerek başlayın. TLC geliştirme haznesinin tabanını ve bir TLC plağının alt kenarını kaplayacak kadar temizleme çözücüsü hazırlayın.

Burada, hazne içerisine yerleştirilmek üzere ikiye bir oranında etil asetat metanol hazırlanır. Ardından, eldiven giyilerek ve çeker ocak altında çalışılır. Geliştirme haznesine sığacak şekilde, alüminyum veya plastik destekli esnek silika plakaları kesmek için makas kullanılır.

Plakaları, üst kısımları hazne duvarlarına yaslanacak şekilde hazneye yerleştirin. Plakalar birbirine değmemelidir. Haznenin kapağını kapatın ve çözücünün kılcal hareketle plakalar üzerinde yukarı doğru ilerlemesini sağlayın.

Çözücü plakaların üst kısmına ulaştığında, plakaları bölmeden çıkarın ve çözücü buharlaşana kadar çeker ocak içerisinde dik konumda bekletin. Plakalar kuruduktan sonra, safsızlıkların TLC plakalarının üst kısmına yakın bir yere göç edip etmediğini kontrol edin. Bunlar görünür ışık altında sarı bir bant veya ultraviyole ışık altında floresan bir bant şeklinde görünecektir.

Plakanın büyük bir kısmı hâlâ sarımsı bir tona sahipse, temizleme işlemini aynı TLC haznesinde aynı çözücüyle tekrarlayın. TLC plakaları hazneden çıkarıldıktan sonra çözücüyü atın. Hazneyi protokolün bir sonraki bölümü için kullanmadan önce, kalıntı çözücünün tamamen buharlaşmasını bekleyin.

Ardından, silika üzerindeki bileşiklerin göçünü etkileyebilecek kalıntı nemi gidermek için plakaları bir kurutma fırınında 100 °C'de; 20 by 20 cm'lik plakalar için 10 ila 15 dakika, 7 by 10 cm'lik plakalar için ise beş dakika boyunca dik konumda bekletin. Plakalar kuruduktan sonra, ekstratları yüklemeden önce ortam sıcaklığına gelene kadar soğumaya bırakın. Ekstrat ayrıştırması için tankları hazırlamak amacıyla, makas kullanarak tank yüksekliğinin biraz altında ve genişliği tank çevresinin yaklaşık yarısı kadar olan bir filtre kağıdı parçası kesin.

Bu kağıt, çözücüleri hazne duvarı boyunca yukarı çekmek ve hazneyi çözücüyle doyurmak için bir fitil görevi görerek ayırımların tekrarlanabilirliğini artıracaktır. Çözücüleri bir çeker ocak içerisinde karıştırın. Kullanılan çözücüler, dört bir hacim oranında etil asetat ve metanoldür. Çözücü karışımını hazneye dökün ve kapatın.

TLC plakasında, gelişme haznesindeki çözücü yüzeyinin üzerinde kalacak bir noktaya kurşun kalemle başlangıç noktasını hafifçe işaretleyin. Eğer TLC plakası absorbenti yumuşaksa ve kolayca zarar görebiliyorsa, işaretlemeleri burada gösterildiği gibi kenarlara yapın. Ardından, ekstraktları, bulanık bir süspansiyon yerine konsantre bir çözelti elde edecek miktarda organik çözücüde çözün.

Burada kullanılan çözücü metanoldür. Kılcal mikro pipetler veya mikrolitre şırınga kullanmak, plakanın yanlarında bir santimetrelik bir kenar boşluğu bırakırken standartların ve örneklerin dar bantlar halinde yüklenmesini sağlar; plaka yelpazelenerek veya bir çeker ocak içine yerleştirilerek bantların kurumasına izin vermek, bantların daha hızlı kurumasına yardımcı olur. Bantlar kuruduktan sonra, örnekleri tekrar aynı noktanın üzerine veya üzerine ekleme şeklinde yükleyin.

Plakada daha yüksek bir numune konsantrasyonuna ihtiyaç duyulursa, TLC haznesinde gerektiği kadar tekrarlayın. Fitilin tamamının çözücü ile doyurulduğundan emin olun. Ardından, plakaları pens veya maşa yardımıyla TLC haznesinin içine yerleştirin.

Plakalar fitile temas etmemelidir. Kabı kapatın ve çözücü cephesi plağın üst kısmına ulaşmadan önce plakaların gelişmesine izin verin. Plakaları TLC tankından çıkarın ve çözücü cephesinin yüksekliğini bir kurşun kalemle işaretleyin.

Plakanın kurumasını bekleyin. Çeker ocak altında, kalan tüm TLC plakalarını, kapalı tutulduğu sürece genellikle tüm gün boyunca kullanılabilen aynı TLC haznesinde geliştirin. Haznedeki çözücü miktarı gözle görülür şekilde azalırsa, plakalar kuruduktan sonra daha fazla çözücü karışımı hazırlayın.

Bandları görünür veya UV ışık altında görselleştirin. Taşınabilir bir UV lambasına sahip bir görüntüleme haznesi, özellikle lamba hem 254 nanometre kısa dalga UV hem de 365 nanometre uzun dalga UV'deki bileşikleri tespit edebiliyorsa uygundur. Bandları belirlemek için bir kurşun kalem kullanın; üstten aydınlatmalı, UV ve/veya görünür ışıklarla donatılmış bir jel fotoğraf dokümantasyon sistemi kullanarak plakaların görüntülerini elde edin.

Son olarak, bantların karakterize edilmesine yardımcı olmak için; önce bileşiğin katettiği mesafeyi, ardından çözücünün katettiği mesafeyi ölçüp ilkini ikincisine bölerek tutunma faktörünü veya RF değerlerini hesaplayın. Bant konumları işaretlendikten sonra, plakalar daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Biyoanalizde kullanın.

Plakaları plastikle sarın ve folyo ile kapatın. Plakaları -20 °C'de saklayın. Silika nötr olmadığı için maksimum saklama süresi bileşiğin stabilitesine bağlıdır.

Bazı bileşikler TLC plakası üzerindeyken bozunabilir. Kontak biyografi testi hazırlığı için, anaerobik koşullar altında hiper amonyak üreten bakteriler veya HAB besiyeri hazırlayın ve inoküle edin. Bu durumda kullanılan kültür Clostridium stickland eye strain sr.'dir.

Kültürü 39 °C'de eksponansiyel veya stasyoner faza kadar büyütün. Anaerobik mikroorganizmalarla çalışırken steril anaerobik teknikler kullanın. %0,75 a/h hazırlayın.

Agar sıcaklığı 60 °C'nin altına düştükten sonra, bakterileri büyütmek için kullanılan aynı ortamdaki agar kullanılır. Eriyiğe, kültürden hacimce %1 oranında inokülasyon yapın ve nazikçe karıştırın; ardından hemen bir anaerobik kamaraya yerleştirin ve makas yardımıyla 15 x 100 mm'lik plastik Petri kaplarına dökün. TLC plakasını, ilgilenilen bant veya bantları içeren bölgeler şeklinde kesin.

Plakaların arka yüzlerini keçeli kalemle işaretleyin. Kontrol olarak kullanılmayan bir TLC şeridini agar plakasına yerleştirin. Ardından bantları, yüzleri aşağı bakacak şekilde agar plakalarının üzerine yerleştirin.

Plakaları, anaerobik oda inkübatöründe 24 saat boyunca 39 °C'de agar tarafı aşağı gelecek şekilde inkübe edin. TLC bantlarını, anaerobik oda içerisindeyken pens yardımıyla agar plaklarından çıkarın.

Agar plaklarının yüzeylerine damla damla tetra oleum red ekleyin. Rengin gelişmesi için en az 20 dakika bekleyin. Kontrol plağı tamamen kırmızıya döndüğünde, plakları anaerobik kamaradan çıkarın.

Clostridium stick Landi anaerobik bir bakteridir, bu nedenle anaerobik kamaradan çıkarıldıktan hemen sonra canlılığını yitirmeye başlayacaktır; ancak rengi 24 saatten fazla süreyle stabil kalır. Dijital bir kamera kullanarak, plakları görünür ışık altında, yeterli kontrast sağlayan bir arka plan üzerinde fotoğraflayın. Canlı hücreler boyandığında parlak kırmızı bir renk gözlemlenecektir.

Ölü hücreler boyanmaz. Fenolik bileşikler içeren kırmızı yonca ekstraktlarının temsilci silika TLC ayırımları burada gösterilmiştir. Etil asetat heksan dokuza bir oranında 8,5 santimetre boyunca gerçekleştirilen ayırım, biri başlangıç noktasından tamamen ayrılmış olmak üzere beş bantla sonuçlanmıştır.

Yüklenen standartlar Formin Bio Canon A ve Genine idi. Bu plakadaki dört bant, 24 saat boyunca ruminal hiper amonyak üreten bir bakteri olan Clostridium stick Landi kültürlerine uygulandı ve burada gösterildiği şekilde tetra oleum red ile boyandı. Bant bir Bio Canon A ve bant iki dört Monon nein ile bakteri ekili agarda yapılan inkübasyon, belirgin bir inhibisyon zonu ile sonuçlandı.

Buna karşın, ikinci bandın geri kalanının üçüncü ve dördüncü bantlarla birlikte inkübasyonu bakteriyel büyümeyi inhibe etmedi. Bu sonuçlar, bio Canon A'nın see stickland eye büyümesini inhibe ettiğini, ancak form aone Nein'ın etmediğini göstermiştir. Bu prosedürü uygulamaya çalışırken, tekniğin esnek olduğunu unutmamak önemlidir.

Uygun besiyerleri seçildiği ve ayırma kimyası ile tespit yönteminin bu prosedürü takiben uyumlu olduğundan emin olmak için kontroller eklendiği sürece, diğer test mikroorganizmaları da kullanılabilir. Bir biyolojik analizde tanımlanan antimikrobiyal bileşiklerin karakterize edilmesine yardımcı olmak için yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi gibi diğer teknikler kullanılabilir.