İnce tabaka kromatografi (TLC) Ayırımı ve bitki özleri Biyodenemeler Antimikrobiyal Bileşikler tanımak

Bu prosedürün genel amacı, anaerobik bakterilere karşı antimikrobiyal olan bitki metabolitlerini tanımlamaktır. Bu, önce bir bitki ekstraktının ince tabaka kromatografisi veya TLC ile ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, kromatogram bir veya daha fazla bileşik içeren bölgelere kesilir.

Bölgeler daha sonra agar üzerine yerleştirilir, anaerobik bakterilerle aşılanır ve inkübe edilir. İnkübasyonun ardından, bölgeler çıkarılır ve bakteri üremesini engelleyen bileşikleri tanımlamak için plakalar boyanır. Elde edilen veriler, antimikrobiyal bitki metabolitlerinin varlığını veya yokluğunu ortaya koymaktadır.

Bu yöntem, bitki ikincil metabolitlerinin belirli mikroorganizmalar tarafından besin kullanımı üzerindeki etkileri gibi ruminant beslenmesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, rumin bakterilerine inhibe olan bitki bileşiklerini ortaya çıkarsa da. Diğer bakteri veya mantarlara karşı inhibe edici bileşiklerin açığa çıkarılmasına da uygulanabilir.

Bu protokolde, kırmızı yoncadan elde edilen fenolik bileşikler, temas biyografisi ile antimikrobiyal bileşiklerin tanımlanmasını göstermek için kullanılacaktır. Çeker ocakta çalışan ince tabaka kromatografisini veya TLC plakalarını temizleyerek başlayın. TLC geliştirme odasının altını ve ayrıca A TLC plakasının alt kenarını kaplayacak kadar temizleme solventi hazırlayın.

Buradaki haznenin içine yerleştirildiğinde, ikiye bir etil asetat metanol hazırlanır. Ardından, eldiven giymek ve davlumbazda çalışmak. Gelişmekte olan odaya uyacak şekilde alüminyum veya plastik destekli esnek silika plakaları kesmek için makas kullanın.

Plakaları, üst kısımları oda duvarlarına yaslanacak şekilde hazneye yerleştirin. Plakalar birbirine değmemelidir. Hazneyi örtün ve çözücünün kılcal hareketle plakaları yukarı doğru hareket ettirmesine izin verin.

Çözücü plakaların üst kısmına ulaştığında, bunları hazneden çıkarın ve çözücü buharlaşana kadar çeker ocakta dik konumda yerleştirin. Plakalar kuruduktan sonra, TLC plakalarının üst kısmına yakın kirliliklerin göç edip etmediğini kontrol edin. Bunlar, görünür ışık altında sarı bir bant veya ultraviyole ışık altında bir floresan bant olarak görünecektir.

Plakanın çoğunda hala sarımsı bir renk varsa, aynı çözücüyü kullanarak temizleme işlemini aynı TLC haznesinde tekrarlayın. TLC plakalarını hazneden çıkardıktan sonra çözücüyü atın. Protokolün bir sonraki kısmı için hazneyi kullanmadan önce artık çözücünün tamamen buharlaşmasına izin verin.

Silika üzerindeki bileşiklerin göçünü etkileyebilecek artık nemi gidermek için, plakaları 100 santigrat derecede bir kurutma fırınında, 20 x 20 santimetrelik bir plaka için 10 ila 15 dakika ve yedi x 10 santimetrelik plakalar için beş dakika dik olarak tutun. Plakalar kuruduktan sonra, üzerlerine ekstraktlar yüklemeden önce ortam sıcaklığına soğumalarını bekleyin. Hazneleri ekstrakt ayırmaya hazırlamak için, hazne yüksekliğinin biraz altında ve hazne çevresinin yaklaşık yarısı genişliğinde bir filtre kağıdı parçasını kesmek için makas kullanın.

Bu kağıt, çözücüleri hazne duvarından yukarı çekmek ve hazneyi solvent kağıtları ile doyurmak için bir fitil görevi görecek, böylece ayırmaların tekrarlanabilirliğini artıracaktır. Kullanılan çözücüler, hacim başına dört ila bir hacim olan etil asetat metanoldür. Çözücü karışımını hazneye dökün ve üzerini kapatın.

TLC plakası üzerinde, haznede gelişen çözücünün yüzeyinin üzerinde olacak bir noktada orijini hafifçe işaretlemek için bir kalem kullanın. TLC plaka emicisi yumuşaksa ve kolayca zarar görebilirse, burada gösterildiği gibi kenarlarda işaretler yapın. Daha sonra, bulanık bir süspansiyon yerine konsantre bir çözelti elde etmek için ekstraktları yeterli organik çözücü içinde çözün.

Burada kullanılan çözücü metanoldür. Kılcal mikro pipetler veya mikrolitrelik bir şırınga kullanmak, standartları ve numuneleri dar bantlar halinde yüklerken, plakanın yanlarında bir santimetrelik bir kenarlık bırakırken, bantların kurumasını bekleyin, plakayı havalandırmak veya bir çeker ocak içine yüklemek, bantların daha hızlı kurumasına yardımcı olur. Bantlar kuruduktan sonra, numuneleri aynı noktaya veya aşırı noktaya tekrar yükleyin.

Plaka üzerinde daha yüksek bir numune konsantrasyonuna ihtiyaç duyulursa, TLC haznesinde gerektiği kadar tekrarlayın. Fitilin tamamının solvent ile doyduğundan emin olun. Daha sonra forseps veya maşa ile plakaları TLC haznesinin içine yerleştirin.

Plakalar fitile temas etmemelidir. Hazneyi kapatın ve çözücü ön kısmı plakanın üst kısmına ulaşmadan önce plakaların gelişmesine izin verin. Plakaları TLC tankından çıkarın ve solvent cephesinin yüksekliğini bir kalemle işaretleyin.

Plakayı kurumaya bırakın. Bir davlumbazda, kalan TLC plakalarını, kapalı tutulursa genellikle tüm gün boyunca kullanılabilen aynı TLC odasında geliştirin. Haznedeki çözücü miktarı gözle görülür şekilde azalırsa, plakalar kuruduktan sonra daha fazla çözücü karışımı yapın.

Bantları görünür veya UV ışığı altında görselleştirin. Taşınabilir bir UV lambasına sahip bir görüntüleme odası, özellikle lamba hem 254 nanometre kısa dalga UV hem de 365 nanometre uzun dalga uv'deki bileşikleri algılayabiliyorsa uygundur. Plakaların görüntülerini elde etmek için tepegöz, UV ve/veya görünür ışıklarla donatılmış bir jel fotoğraf dokümantasyon sistemi kullanarak bantları tanımlamak için bir kalem kullanın.

Son olarak, bantların karakterize edilmesine yardımcı olmak için, önce bileşiğin kat ettiği mesafeyi ölçerek, ardından çözücünün kat ettiği mesafeyi ölçerek ve birincisini merdivene bölerek tutma faktörünü veya RF değerlerini hesaplayın. Bant konumları işaretlendikten sonra, plakalar daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Biyo-tahlilde kullanın.

Plakaları plastiğe sarın ve folyo ile örtün. Plakaları eksi 20 santigrat derecede saklayın. Maksimum depolama süresi, silika nötr olmadığı için bileşik stabilitesine bağlıdır.

Bazı bileşikler TLC plakası üzerindeyken bozunabilir. Temas biyografisi testine hazırlanırken, anaerobik koşullar altında hiper amonyak üreten bakteri veya HAB ortamını hazırlayın ve aşılayın. Bu durumda kullanılan kültür Clostridium stickland göz suşu sr.

Kültürü 39 santigrat derecede üstel veya durağan faza büyütün. Anaerobik mikroorganizmalarla çalışırken steril anaerobik teknikler kullanın. Hacim başına sıfır noktasını% 75 ağırlık hazırlayın.

Agarın sıcaklığı 60 santigrat derecenin altına düştükten sonra bakterileri büyütmek için kullanılan aynı ortamda. Erimiş agarı kültürün hacmi başına% 1 hacimle aşılayın ve hemen nazikçe karıştırın, anaerobik bir odaya yerleştirin ve makasla 15 x 100 milimetre plastik Petri kaplarına dökün. TLC plakasını ilgilenilen bandı veya bantları içeren bölgelere kesin.

Bir sharpie kullanarak plakaların arka taraflarını işaretledi. Kullanılmayan bir TLC şeridini kontrol olarak agar plakasına yerleştirin. Ardından bantları yüzü aşağı bakacak şekilde agar plakalarına yerleştirin.

Plakaları agar tarafı aşağı bakacak şekilde anaerobik odaların içinde inkübe edin. Forseps ile 39 santigrat derecede 24 saat inkübatör. TLC bantlarını anaerobik odadayken agar plakalarından çıkarın.

Agar plakalarının yüzeylerine damla damla tetra oleum kırmızısı ekleyin. Rengin en az 20 dakika gelişmesine izin verin. Kontrol plakası tamamen kırmızıya döndüğünde, plakaları anaerobik odadan çıkarın.

Clostridium stick Landi anaerobik bir bakteridir, bu nedenle anaerobik odadan çıkarıldıktan hemen sonra canlılığını kaybetmeye başlar, ancak renk 24 saatten fazla stabildir. Bir dijital kamera kullanarak, plakaları yeterli kontrast sağlayan bir arka plan üzerinde görünür ışık altında fotoğraflayın. Canlı hücreler boyandığında parlak kırmızı bir renk gözlenecektir.

Ölü hücreler leke bırakmaz. Fenolik bileşikler içeren kırmızı yonca ekstraktlarının temsili silika, TLC ayrımları burada gösterilmiştir. Etil asetat hekzan içinde 8.5 santimetre üzerinde dokuza bir ayrılma, biri orijinden tamamen çözülmüş beş bantla sonuçlandı.

Yüklenen standartlar Formin, Bio, Canon A ve Genine idi. Bu plakadan dört bant, 24 saat boyunca ruminal hiper amonyak üreten bir bakteri olan Clostridium stick Landi ile kültürlere uygulandı ve burada gösterildiği gibi tetra oleum kırmızısı ile boyandı. Bakteri tohumlu agar üzerinde birinci bant Bio Canon A ve ikinci bant dört Monon nein ile inkübasyon, iyi tanımlanmış bir inhibisyon bölgesi ile sonuçlandı.

Bununla birlikte, ikinci bandın geri kalanının, üçüncü ve dördüncü bantlarla birlikte inkübasyonu bakteri üremesini engellemedi. Bu sonuçlar, bio Canon A'nın yapışkan göz büyümesini görmek için engelleyici olduğunu, ancak Nein'in formunun olmadığını gösterdi. Bu prosedürü denerken, tekniğin esnek olduğunu hatırlamak önemlidir.

Uygun ortam seçildiği sürece diğer test mikroorganizmaları kullanılabilir ve bu prosedürü takiben ayırma kimyası ile algılama yönteminin uyumlu olduğundan emin olmak için kontroller dahil edilir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi gibi diğer teknikler, bir biyo-tahlilde tanımlanan antimikrobiyal bileşiklerin karakterize edilmesine yardımcı olmak için kullanılabilir.