Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Bu prosedürün genel amacı, kantitatif görüntüleme analizi kullanarak tedavi koşulları altında üretilen yeni sentezlenmiş RNA'yı floresanla işaretlemek ve miktarını belirlemektir. Lamel üzerine ekilmiş kültür hücreleri, bundan sonra five EU olarak adlandırılan alken modifiyeli baz 5-etilüridin ile işleme tabi tutulur ve hipoksik koşullar altında inkübe edilir.

İnkübasyon sırasında, hücresel transkripsiyon mekanizması kesintiye uğratılmadan RNA sentezi esnasında beş EU dahil edilir. Ardından, dahil edilen beş EU, bakır katalizli azit-alkin siklo eklemesi veya klik reaksiyonu gerçekleştirilerek floresanla işaretlenir. Floresanla işaretlenmiş yeni sentezlenen RNA daha sonra floresan mikroskobu ile görüntülenir ve elde edilen görüntüler, tedavi ve kontrol koşulları altında üretilen RNA miktarını karşılaştırmak için analiz edilir.

Elde edilen verilerin istatistiksel analizi, beş EU inkorporasyonunun kantifikasyonu ve floresan mikroskobu ile tespiti aracılığıyla, hipoksiye yanıt olarak yeni sentezlenen RNA üretimindeki değişimleri göstermektedir. Bu tekniğin kantitatif PCR gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hücrelerdeki RNA üretiminin tek hücre düzeyinde doğrudan görselleştirilmesine olanak tanımasıdır. Burada bu yöntemi hücrelerin düşük oksijene nasıl yanıt verdiğini incelemek için kullansak da, yöntem kemoterapötik ilaçlara verilen yanıtların incelenmesinde de kullanılabilir.

Ek stres tepkilerine verdiğimiz yanıtları gösteren prosedür; laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi John Leston, yine bir lisansüstü öğrencisi olan ish Kova ve doktora sonrası araştırmacı Humana Druker'ın yardımıyla gerçekleştirilecektir. Son olarak, Gus Ferguson görüntüleme yazılımının kullanımını gösterecektir. Bu deneye, sterilize etmek amacıyla birkaç lamelini %70 ethanol içine daldırarak başlayın.

Lamine akış altında hava ile kurumaları için lamelleri doku kültürü kabininindeki bir plağın kenarına yerleştirin. Lameller kuruduktan sonra, altı adet 3,5 santimetrelik kabın her birine birer tane yerleştirin. Her kaba iki mililitre ılık komple DMEM ekleyin.

Her bir lamelin kuyucuk tabanına yapışık kaldığından emin olmak için pensle aşağı doğru bastırın. Ardından, U2 OS hücrelerini doku kültürü kabından ayırmak için üç mililitre PBS ile bir kez yıkayın. Sonrasında, dört mililitre ılık 0.05%trypsin, 1%EDTA uygulayın ve 37 degrees Celsius sıcaklıkta yedi dakika inkübe edin.

Resus üzerinden yedi dakika geçtikten sonra, tripsin EDTA'yı inaktive etmek için hücreleri altı mililitre ılık komple DMEM içinde süspanse edin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın ve lamel içeren 3,5 santimetre çapındaki her bir kaba 2 × 10⁵ hücre ekleyin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için kabı hafifçe sallayın ve hücrelerin yapışmasına izin vermek için 37 °C, %21 oksijen ve %5 karbondioksit koşullarında gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, beş plakı inkübatörden çıkarın. Kalan plağı rahatsız etmeden bırakın. Bu plak, normoksik pozitif kontrol olarak kullanılacaktır.

Kapların dördünü hipoksi iş istasyonuna yerleştirin. Hücreleri sırasıyla 75 dakika, 90 dakika, iki saat ve 24 saat boyunca hipoksik koşullara maruz bırakın. Diğer kaba.

Besiyerine, son konsantrasyonu 10 µg/mL olacak şekilde aktinomisin D ekleyin ve normal oksijen koşulları altında, 37 °C'deki inkübatöre dört saat boyunca geri yerleştirin. Bu kap, normoksik negatif kontrol olarak işlev görür. Hücreler inkübe olurken, click-it analizi hazırlığı için aşağıdaki reaktifleri hazırlayın ve toplayın.

Click-it assay kiti, pH değeri 7,2 ile 7,6 arasında olan PBS, PBS içinde %3,7 paraformaldehit, PBS içinde %1 Triton X 100, deiyonize su, dimetil sülfoksit, 10 molar sodyum hidroksit, %37 hidroklorik asit ve pH indikatör şeritleri. İşaretleme analizini uygun koşullar altında başlatmaya hazır olmalısınız. Hipoksi tedavisi sona ermeden bir saat önce, hücreleri işaretlemek için 100 milimolar stoktan önceden ısıtılmış tam besiyeri içerisinde 2x'lik bir EU çalışma çözeltisi hazırlayın.

Ardından, actinomycin D ile işlem görmüş hücrelerin bulunduğu kaptaki ortama, EU'yu çalışma konsantrasyonuna seyreltmek için eşit hacimde iki XEU ekleyin. Daha sonra, hipoksi odasında, hipoksi işlemi uygulanmış hücrelere EU stok çözeltisini ekleyin. Hipoksi işleminin ardından işlem görmüş hücre kültür koşulları altında bir saat, kontroller için ise dört saat inkübe edin.

Her bir kabı bir kez PBS ile yıkayın ve işlem koşulları altında bir mililitre %3.7'lik paraformaldehit stok çözeltisi ekleyin, işlem koşulları altında 15 dakika inkübe edin. Fiksasyonun ardından hücreleri hipoksi odasından çıkarın ve çeker ocak içine yerleştirin. Paraformaldehit atıklarını sorumlu bir şekilde bertaraf etmeye dikkat ederek fiksatif çözeltiyi dökün.

Ardından hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Tüm çözeltileri iki ila altı santigrat derecede buz üzerinde tutarak sonraki adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin. Daha sonra hücreleri permeabilize etmek için yıkama çözeltisini uzaklaştırın ve her kuyucuğa PBS içinde %1 tritton X 100'den bir mililitre ekleyip oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Permeasyon tamponunu uzaklaştırın ve her bir kuyucuğu bir kez PBS ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu hücrelerden uzaklaştırın ve her örneğe taze hazırlanmış 500 µL RNA görüntüleme kiti reaksiyon kokteyli ekleyin. Hücreleri ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, RNA görüntüleme kiti reaksiyon karışımını, kokteyli ve yıkama solüsyonunu uzaklaştırın. Bir mililitre RNA görüntüleme kiti reaksiyon durulama tamponu ile durulamanın ardından, varsa ek antikor işaretlemeleri bu aşamada gerçekleştirilmelidir. DNA'yı boyamak için örnekleri PBS ile yıkayın, ardından herst 3, 3, 3, 4, 2'yi 1:1000 oranında seyreltin.

PBS içerisinde, her birine bir mililitre seyreltilmiş HERC çözeltisi ekleyin. Işıktan iyice koruyun ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından HERC çözeltisini uzaklaştırın ve lamel montajı için hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.

Standart bir mikroskop lamının merkezine 10 µL montaj medyumu yerleştirin. Lamelini, hücre tarafı montaj medyumuna gelecek şekilde damlanın üzerine yerleştirin. Sonraki görüntü alımını engelleyeceği için hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.

Kapak lamı mikroskop lamına sabitlemek için kenarlarına şeffaf tırnak cilası uygulayın. Cilanın oda sıcaklığında beş dakika boyunca kurumasını bekleyin. Işıktan korunan örnekler -20 °C'de saklanabilir.

Montaj işleminin ardından, floresans tespiti yapabilen geniş alanlı bir mikroskop kullanarak görüntüler elde edin. Görüntülemeyi 40X 1,30 NA yağ daldırma objektif ile gerçekleştirin ve görüntüleri soğutmalı bir CCD kamera ile yakalayın. Görüntüleme işlemi sonrasında en az 30 hücreyi kaydedin.

Görüntüleri çözülür hale getirmek (deconvolution) için görüntü işleme yazılımı kullanın. Bu işlem, yakalanan görüntülere yazılım tabanlı bir matematiksel formül uygulayarak optik distorsiyonu düzeltecektir. Sonuç, sonraki analizlerin yalnızca görüntülenen hücrelerle sınırlı olmasını sağlayacak daha net bir görüntüdür.

Ardından, görüntüleri Omer O istemcisine aktarın. Aynı deneydeki tüm görüntülerin oluşturma ayarlarını normalize etmek için elde edilen tüm görüntülerin küçük resimleri görüntülenecektir. Analiz yazılımındaki ilgi alanı ROI aracını kullanarak, kontrol normoksik hücrelerden gelen oluşturma ayarlarını diğer tüm koşullara uygulayın.

Yazılımda her görüntüden çekirdekleri seçin. Yoğunluk analizi seçeneğini belirleyin ve 30 ila 50 hücre için her bir ROI'nin ortalama yoğunluk değerlerini elde edin. Verileri kaydedin ve ardından her koşul için ortalamayı ve standart sapmayı hesaplayın.

Son olarak, her koşul altındaki hücreler arasındaki değişkenliği yansıtmak için veri grafikleme yazılımı kullanarak tüm bireysel ortalama yoğunluk değerlerinin saçılım grafiklerini oluşturun. Yoğunluk verilerinin bu şekilde çizilmesi faydalıdır; çünkü tedavi sonuçlarının hızlı bir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanır ve standart veri gösterimi kullanıldığında gizli kalan, bir tedavi hücresi popülasyonu içindeki belirgin heterojenliği açıkça ortaya koyar. Alternatif olarak, hipoksi ile tedavi edilen ve beş-al uridin veya EU varlığında kültüre edilen U2 OS hücrelerinde toplam RNA sentezini nicel olarak belirlemek için yeni sentezlenen RNA'nın ortalama yoğunluk artı standart sapmasını temsil eden sütun grafikleri oluşturun; ardından bu hücreleri işleyin ve analiz edin.

Bu videoda gösterildiği üzere, her bir işlem popülasyonundaki tüm hücrelerin floresans yoğunluklarının ortalaması alınmış ve grafiğe dökülmüştür. Bu sütun grafiğinde, her bir işlem grubunun kontrolden anlamlı şekilde farklılaşma olasılığını hesaplamak için öğrenci t-testi kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, bu veriler genel RNA sentezinde zamanla istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğunu göstermektedir.

U2 OS hücreleri beklendiği üzere bir buçuk saatten daha uzun süre hipoksiye maruz bırakıldığında, Actinomycin D uygulaması floresan yoğunluğunu tamamen ortadan kaldırır. Bu veriler, daha uzun süreli hipoksi tedavilerinin ardından hücrenin, bu zorlu hipoksik ortamda bile çabalarını RNA üretimine odakladığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, hipoksi ve normoksi koşullarında tek hücre düzeyinde yeni sentezlenen RNA'nın nasıl işaretleneceği ve nasıl nicelleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız; bu teknikte uzmanlaşıldığında, prosedür takip edilerek işlem iki saat içinde tamamlanabilir.

RNA polimeraz seviyelerinin değişip değişmediğini ve HIF'in aktive olup olmadığını belirlemek için RNA polimeraz ve HIF antikorları ile ko-boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken formaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Her zaman eldiven giydiğinizden ve çeker ocak altında çalıştığınızdan emin olun.