Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, serbestçe yüzen bir nematodun dikey yol hızını ve uyguladığı kuvvetleri, tutarlı monokromatik radyasyon kullanarak ölçmek ve değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle serbestçe yüzen sea elegance için tutarlı bir monokromatik gölge deneyi düzeneği kurularak gerçekleştirilir. Ardından, yetişkin bir sea elegance bireyi, bir vet olan gölge deneyi izleme odasına yerleştirilir.

Solucanın lazer ışını boyunca aşağı inerken oluşturduğu gölge bir video olarak kaydedilir ve bu video hayvanın hareketini analiz etmek için kullanılır. Böylece, serbestçe yüzen bir nematodun izlediği yol ve buna bağlı olarak ortaya çıkan kuvvetler belirlenir. Bu tekniğin, yatay düzlemdeki geleneksel mikroskopi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, serbestçe yüzen mikroorganizmaların hareketinin düşük maliyetle ve geniş bir monokromatik ışık yelpazesi kullanılarak incelenebilmesidir.

Bu yöntem, sıvı ortamdaki nematodlar tarafından üretilen veya bunlara tepki olarak verilen kuvvetlerle ilgili temel soruları yanıtlayabilir. Bu yönteme dair ilk fikrimiz, mikroskobik türlerin dikey hareketleri üzerine çalışmaya başladığımızda ortaya çıktı. Lazer hizalamasını doğru şekilde yapmak belirli bir pratik gerektirdiğinden, prosedür adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.

Ayrıca, solucanların nasıl hazırlanacağını öğrenmek için biyoloji laboratuvarında vakit geçirmek gerekir. Gölge görüntüleri oluşturmak için deneysel düzeneği kurun. Helyum neon lazerini, ışının 12 milimetreye çıkarılması gereken Galilean ışın genişleticisine yönlendirmek için iki veya daha fazla ayna kullanın. Genişleticiden gelen ışının hizalamasını sağlamak için ışın yolu üzerinde bir veya iki iğne deliği bulundurun.

Işını, monte edilmiş bir kuvars Q vet'e yönlendirin. Işın geçtikten sonra, Q vet bunu 75 milimetre pozitif odak uzaklığa sahip bir plano konveks lens kullanarak büyütür. Ardından, optimal çözünürlük mesafesi olan, lensten yaklaşık 120 santimetre uzaklığa bir ekran yerleştirin.

Yüksek hızlı kamerayı, Q vet'in yanındaki gibi ekranı görüntüleyebileceği bir konuma yerleştirin. Solucanları seçmek için kullanılacak bir diseksiyon mikroskobu da qve yakınında olmalıdır. Milimetre bölmeli şeffaf bir cetveli, ekran üzerindeki QVAD tutucusunun merkezine, kameranın görüş alanının kenarına yakın olacak şekilde geçici olarak sabitleyin.

Bir milimetrelik ölçek mesafesini işaretlemek için cetvelin çizgilerini kullanın. QV'deki kromatik sapmalar ve daha önce açıklandığı üzere büyütmedeki değişiklikler nedeniyle kırılma farklılık göstereceğinden, bunu kullanılan her dalga boyu için tekrarlayın. JoVE'de, qve için genç yetişkin nematodları hazır bulundurun.

Ayrıca kloroform maruziyetiyle öldürülmüş nematodlar hazırlayın. Q Vet'i kenardan bir milimetre kalacak şekilde distile su ile doldurarak başlayın. Ekrandaki çizginin başlangıçta görünür olması için oda ışıkları açıkken kayda başlayın ve ardından oda ışıklarını kapatın.

Ardından, platin bir tel iğne yardımıyla bir nematod toplayın. Solucanları, ortamı sarsmadan iğneyi hafifçe suyun yüzeyine değdirerek vet'in içine yerleştirmek önemlidir. Solucanın ve su sütununun yansıtılan görüntüsü terstir.

Yer çekimiyle aşağı inen solucanlar ekranda yukarı doğru hareket ediyormuş gibi görünecektir. Her solucan için yaklaşık 20 saniyelik kayıt yapın ve koşul başına yaklaşık 50 solucan kaydedin. İlk olarak, videoyu video analiz programına aktarın.

Büyütme faktörünü belirlemek için videodaki uzunluk işaretlerini kullanarak ölçeği ayarlayın. Ardından gölgeli nematodun baş kısmının lineer yer değiştirmesini izlemeye başlayın. Kat edilen yol boyunca yaklaşık her 0,3 saniyede bir olacak şekilde en az 10 veri noktası seçin.

Dikey hız, ardından türevin büyütme faktörüne bölünmesiyle hesaplanır. Yatay ve dikey yer değiştirme için ayrı eğriler oluşturmak kritiktir; çünkü yerçekimi yalnızca dikey yönde etki eder.

Veri noktaları genel olarak düz bir hat oluşturuyorsa, yol lineerdir. Bazı baş hareketi sapmaları göz ardı edilebilir. Ardından, analiz menüsünden, verilere düz bir hat uydurarak bir lineer regresyon doğrusu oluşturun.

Doğrunun eğimi, solucanın dikey hızıdır. Eğer bir solucan doğrusal olmayan bir şekilde hareket ediyorsa, analiz menüsünden eğriye uydurma (curve fit) seçeneğini seçin. Buradan, eğriyi ikinci veya üçüncü dereceye uydurun.

Yoldaki her bir eğri için polinom, verilere bir eğri uydurur. Grafiğin her iki yanındaki köşeli parantezler kaydırılarak, eğrinin matematiksel ifadesi sunulur. Burada %15'e kadar olan bağıl hata kabul edilebilirdir.

Veri noktalarını kapsamak için gerektiği kadar ek eğriler ekleyin ve fonksiyonları spline yöntemiyle birleştirmeye çalışın. Eğri uyumları, örtüştükleri noktalarda aynı eğime sahip olmalıdır. Eğrinin birinci ve ikinci türevleri hız ve ivmeyi sağlar.

İtki, solucanın sürüklenme sırasındaki kütlesi üç mikrogram olarak kullanılarak hesaplanmıştır; yaşayan ve ölü C. elegans'ların alçalma hızları arasında belirgin bir fark gözlemlenmemiştir. Her ikisi için de aşağı doğru sürüklenme hızı 1.5 mm/s idi. Ancak, yön değiştirebilen ve yerçekimine karşı yüzebilen canlı nematodlar için, nematodun dikey yer değiştirmesine eğriler uydurulmuş ve ivme, bu eğrilerin ikinci türevlerinden hesaplanmıştır.

Solucan dönüş noktasına ulaşana kadar üzerine etki eden kuvvetler yerçekimi, sürüklenme, kaldırma kuvveti ve itki kuvvetidir. Net kuvvet, bu kuvvetlerin vektörel toplamına eşittir. Dikey kuvvet bileşenlerini inceleyiniz.

Solucanın yoğunluğunun suya yaklaşık olarak eşit olduğu varsayıldığında, kütleçekim kuvveti kaldırma kuvvetine büyüklükçe eşittir, bu nedenle denklem dönüş noktasıncaya kadar sadeleştirilebilir. Sürüklenme ve itki sabittir. Sürüklenme başlangıçta daha büyüktür ancak dönüş noktasında kademeli olarak sıfıra inerken itki artar; solucanın hareketinde dikey sürüklenme yoktur ve itki yukarı yönlüdür.

Dikey yükselme sürüklemesi aşağı yönlü olarak artar, bu nedenle itme kuvveti, sürükleme ve ağırlık toplamından daha büyük olmalıdır. Bu solucanın doğrusal olmayan yolu analiz edilmiştir. Solucan yön değiştirmiştir.

Yer değiştirmesine bakıldığında, 68. saniyede yavaşladığı ve geri dönmeye başladığı görülmektedir. Ancak, net ivme 68,5. saniyede sıfıra ulaşana kadar yukarı yönlü ivme sürekli olarak azalmıştır. Ardından, tekrar alçalmak için negatif yönde hızlanmaya başlamıştır.

Böylece, hız sıfır olduğunda, solucanın 1,32 Pico newton olarak hesaplanan önemli bir yukarı yönlü itme kuvveti vardı. Yöntem kavrandıktan sonra, solucanlar burgudan alınmaya hazırsa veriler 10 dakika içinde toplanabilir. Bu prosedürü uygularken, tüm veriler için kamera kayıt hızının sabit tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir; çünkü bu prosedürü takip eden video analiz programında kare hızını ayarlamamız gerekmektedir. Dikey ve yatay gibi çeşitli yönlerde hangi kuvvetlerin uygulandığına dair soruları yanıtlamak amacıyla, tek dalga boylu çalışmalar gibi diğer araştırmalar da gerçekleştirilebilir.

Örneğin, bu optik teknik, Protista veya diğer sucul fauna gibi küçük organizmaların lokomosyon özellikleriyle ilgilenen diğer biyologlar tarafından da kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, gölge görüntülerinin büyütülmesini ve ardından bir video analiz programını kullanarak serbestçe yüzen mikroorganizmaların hareketinin nasıl analiz edileceği konusunda oldukça iyi bir fikre sahip olmalısınız.