Β-katenin Bozulması Of Sulandırma Xenopus Yumurta Özü

Bir yöntem olup Xenopus yumurta özü ve protein degradasyon küçük molekül modülatörleri için yüksek miktarda madde taraması için uyarlanması radyoaktif olarak etiketlenmiş ve lusiferaz füzyon proteinleri kullanılarak protein degradasyonunu analiz edilmesi için anlatılmıştır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, beta katinin cirosunu analiz etmek için hücresiz biyokimyasal ksenopus yumurta özü sistemini kullanmaktır. Bu, beta-katenin döngüsünün modülatörlerini in vitro eksojen olarak tanımlamak için aktive edilmiş xip yumurta ekstraktına önce şüpheli efektörlerin eklenmesi ve/veya tüketilmesiyle elde edilir, ya S 35 ile etiketlenmiş ya da lusiferaz ile kaynaştırılmış, doğal koşullar altında aktif olarak bozunan XUS yumurta ekstraktına eklenir. Daha sonra, zaman içinde beta katin ve protein seviyelerindeki değişiklikleri değerlendirmek için zaman puanları toplayın.

Ksenopus yumurta ekstraktının belirli bir modülasyonunun, oto radyografi ve/veya lüminesans tespitine dayalı olarak beta katin ve bozunma oranlarını artırıp artırmadığını gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin, kültürlenmiş hücrelerde nabız takibi veya siklaj heide kovalama deneyleri gibi diğer mevcut yöntemlere göre avantajı, ksenopus yumurta özütütünün, protein seviyesinde protein regülasyonunu analiz edebilen hücresiz bir biyokimyasal sistem sağlaması ve aktif transkripsiyonun ek karmaşıklığından yoksun olmasıdır. Bu yöntem, beta catina gibi anahtar sinyal proteinlerinin düzenleyicilerini tanımlayarak sinyal iletimi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Xenopus özütü ile çalışmak, kullanıcının bir yolun bileşenlerini kolayca tüketmesini ve belirli bir miktarda proteini geri eklemesini sağlar. Doza bağlı etkilerini belirlemek için, taze hazırlanmış XUS yumurta özü kullanın veya hızlı bir şekilde çözdürün, donmuş özü çözün ve buzun üzerine koyun. Tüm manipülasyonları soğukta gerçekleştirin, ekstraktın seyreltilmesini en aza indirmek için ekstraktın hacminin 10'da birinde peletlenmiş antikor veya afinite boncukları hazırlayın, ekstrakt eklenmeden önce boncuklardan mümkün olduğunca fazla sıvı çekin.

Burada uzun konik uçlu jel yükleme uçları kullanılarak, ekstrakt GST bağlayıcı reçineye eklenir. Ekstrakt boncuk karışımını bir saat boyunca dört santigrat derecede döndürün. Daha sonra ekstrakt boncuk karışımını 12, 600 Gs'de 30 saniye boyunca dört santigrat derecede bir mikro füje döndürün.

Ekstrakt ile herhangi bir boncuk aktarmamaya dikkat edin. Tükenmiş özü buz üzerinde taze bir mikro fuge tüpüne aktarın. Hem tükenmiş ekstrakt hem de boncuklar olmak üzere immüno-blotlama ile tükenme etkinliğini onaylayın.

T ve bozunma enerjiye bağlı olduğundan, endojen A TP depolarını hızla tüketir. Sonuç olarak, sağlam T bozunmasını sürdürmek için bir enerji geri kazanım karışımı kullanmanız gerekir. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi 20 x enerji rejenerasyonu veya ER karışımı hazırlayın.

Donmuş tüpü eller arasında ovalayarak opus yumurta özünü hızla çözün. Ekstraktın tamamı erimeden hemen önce tüpü buzun üzerine yerleştirin. 10 mikrolitre enerji geri kazanımı ekleyin.

Bir xenopus yumurta özü alikotu ile karıştırın. Tüpü hızlı bir şekilde hafifçe vurarak ve nabız girdabı nabız dönüşü yaparak iyice karıştırın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Bozunma tahlili için uygun hacimleri buz üzerinde önceden soğutulmuş mikro füj tüplerine ayırın.

Radyo etiketli beta katin ve bozunma deneylerine hazırlanmak için, XUS yumurta ekstraktında radyo etiketli beta-Katenin bozunma testini gerçekleştirmek için her zaman noktası için iki ila beş mikrolitre ekstrakt çekin. İlk olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi beta-katenin etiketli radyoyu hazırlayın. Daha sonra, 20 mikrolitre xip reaksiyon karışımına bir ila üç mikrolitre in vitro çevrilmiş beta-katenin ekleyin, buz üzerinde karıştırın, tüpün hızlı bir şekilde hareket ettirilmesi ve kısa bir girdap darbesi ile iyice karıştırın.

Bu önemli bir adımdır. Bir XUS yumurta özütü çok viskozdur ve eksik karıştırma, darbe, döndürme ve buz üzerine yerleştirme sonuçlarının tutarlılığını etkiler. Tüpleri belirlenen zaman noktasında oda sıcaklığına kaydırarak beta-katenin bozunma reaksiyonunu başlatın.

Numuneden bir ila beş mikrolitre çıkarın ve bozunma reaksiyonunun tamamen sonlandırıldığından emin olmak için reaksiyonu durdurmak için hemen beş x hacimde bir SDS numune tamponu ile karıştırın. Tüpü birkaç kez hafifçe vurun ve SDS sayfasını gerçekleştirmek için kuvvetlice girdap yapın. Oto radyografi, şerit başına her zaman noktası için ekstraktın bir mikrolitre eşdeğerini çalıştırır.

Sonuçlar, görüntü, J görüntü niceliği veya tercih edilen başka bir görüntüleme yazılımı kullanılarak nicelleştirilebilir. Xap yumurta ekstraktındaki beta-kateninin bozunması, banttaki beta kain etiketli radyonun yoğunluğundaki zamana bağlı azalma ile kanıtlanmalıdır. Beta-katenin lusiferaz hazırlamak için, radyoaktif işaretli olmayan lusiferaz etiketli beta-katenini sentezleyin.

Tam amino asit karışımı ile birleştirilmiş transkripsiyon translasyon birleştirilmiş sistemi kullanma. Reaksiyonun 0.5 ila bir mikrolitresi arasında lusiferaz aktivitesini ölçerek lusiferaz etiketli beta-kateninin üretimini onaylayın. Beta katin lusiferaz bozunma testini gerçekleştirmek için çevrilmemiş bir reaksiyon karışımından lüminesansı ölçerek arka plan lüminesansını değerlendirin: Önce çözdürün ve daha önce olduğu gibi ksenopus yumurta ekstraktını hazırlayın.

Daha sonra in vitro çevrilmiş beta catine ve lusiferaz füzyonunu hazırlanan xip reaksiyonuna ekleyin. Buz üzerinde karıştırın ve iyice karıştırın. Daha önce olduğu gibi, bozunma reaksiyonunu başlatmak için ekstraktı oda sıcaklığına kaydırın.

Belirtilen zaman noktasında reaksiyonun bir kısmını çıkarın ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Her zaman noktasında analiz için üç kopya numuneyi çıkarın. Dondurulmuş ekstrakt, analiz edilmeye hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.

Numuneleri buz üzerinde çözdürün ve işlemeden önce numuneleri buz üzerinde standart beyaz 96 oyuklu plakalara aktarın. Lusiferaz aktivitesi için, GS GSK beta-kateninin üç bağımlı bozunması, XUS yumurta özütü kullanılarak çeşitli şekillerde kolayca gösterilebilir. XUS ekstraktında beta-katenin etiketli S 35 radyosunun bozunması, proteazom inhibitörü MG 1 32'nin eklenmesiyle inhibe edilir.

Beta-katenin mutantı, GSK'nın vahşi tip betain ve protein inhibitörlerine göre XUS yumurta ekstraktında stabilize edilir, üçü benzer şekilde beta-kateninin bozulmasını inhibe eder. Son olarak, xip yumurta ekstraktından GSK üçünün tükenmesi, beta-katenin bozunmasının bozulmasını engeller, eksojen GSK üçünün eklenmesiyle kurtarılabilir. Xip yumurta ekstraktındaki beta-katenin lusiferaz bozunma testi, beta katin ve lusiferazın bozunmasını değerlendirmek için kullanıldı.

Beta katin ve lusiferazın bozunma hızı, etiketlenmemiş beta-katenin proteinine benzer. Beta katin ve lusiferaz füzyonu için bozunmanın düzenlenmesi, esas olarak füzyon olmayan protein ile aynıdır. Lityum klorür ilavesi, beta katinin inhibisyonu ve beta catina'nın radyoaktif sinyalindeki lusiferaz ciro değişiklikleri ile sonuçlandığından.

Lusiferaz proteini, bu prosedürü denerken zaman içinde lusiferaz enzimatik aktivitesindeki değişikliklerle paralellik gösterir. Bu testi denemeden önce tüm reaktifleri buz üzerinde tutmak ve reaksiyonları iyice karıştırmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, hücresiz ksenopus yumurta özü sistemini kullanarak düzenleyicileri nasıl tanımlayacağınızı ve beta catin ve ciroyu nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.