Için RNAscope

Aşağıdaki deneyin genel amacı, RNA scope adı verilen yeni bir RNA in situ hibridizasyon tekniği kullanarak, baş ve boyun kanserlerindeki tümör hücrelerinde yüksek riskli HPVE altı, E yedi mRNA'nın hassas ve spesifik tespitini gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle lamlar üzerindeki doku örneklerinin, prob erişimini sağlamak amacıyla hücreleri permeabilize etmek için ısı ve proteaz ile ön işlemden geçirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda lamlar, E altı E yedi mRNA'ya hibridize olan ve yedi yüksek riskli HPV tipini hedefleyen bir HPV prob kokteyli ile inkübe edilir.

Ardından, önce ön amplifikatör (pre amplifier) ve ardından HRP konjuge etiket probu ile sırasıyla hibridizasyon yaparak hibridizasyon sinyallerini amplifiye edin. Sinyal daha sonra bir kromojen ile tespit edilir ve standart parlak alan mikroskobunda görüntülenir; elde edilen sonuçlar, HPV pozitif tümörlerde HPVE altı E yedi mRNA sinyallerinin noktasal kahverengi çökelmeler şeklinde göründüğünü, ancak HPV negatif tümörlerde görülmediğini gösterir. RNAscope analizi, insitü hibridizasyon için yeni ve tescilli bir prob tasarım stratejisi kullanır.

Tek molekül görselleştirmesine ve hedef kantifikasyonuna olanak tanır. Bu teknoloji, biyobelirteç araştırmaları ve tanısal asit geliştirme alanındaki araştırmacıların, makro dizi (macro race) veya yeni nesil dizileme çalışmaları aracılığıyla keşfedilen herhangi bir RNA biyobelirtecini tanımlamalarına ve doğrulamalarına zemin hazırlar. IHC veya FISH konusunda deneyimi olan çoğu bilim insanı bu yöntemi hızlıca öğrenebilir.

Şimdi, tekniğe hakim olmanıza yardımcı olmak için temel adımların vurgulandığı tüm iş akışının bir gösterimini sunacağım. Bu RNA in situ hibridizasyon tekniği ile analiz edilecek doku örnekleri formalinle tespit edilmiş ve parafine gömülmüştür; beş artı veya eksi bir mikron kalınlığındaki kesitler, analizden bir saat önce lamlara monte edilmiştir.

Slaytları 60 °C'deki kuru bir fırında pişirin. Slaytlar pişerken hibridizasyon fırınını hazırlayın. Sıcaklığı 40 °C'ye getirin ve nem kontrol tepsisine nemlendirici bir kağıt yerleştirin.

Nemlendirme kağıdını tamamen ıslatmak için üzerine 50 milliliters saf su ekleyin. Kapalı tepsiyi, kullanmadan önce en az 30 dakika ön ısıtma yapmak için fırına yerleştirin. 10 x ön işlem çözeltisini saf su ile seyrelterek 700 milliliters bir x ön işlem 2 çözeltisi hazırlayın.

1x ön işlem 2 çözeltisini kaynama noktasına kadar ısıtın ve sıcaklığı 100 ile 104 degrees Celsius arasında tutun. Bu sırada aşırı kaynamayı önleyin. Çeker ocak altında, önceden ısıtılmış 50x yıkama tamponunu distile su ile seyrelterek üç litre 1x yıkama tamponu hazırlayın.

Deparafinalizasyon ve su giderme işlemleri için ksilenleri, %70 etanolü ve %100 etanolü hazırlayın. Boyama sonrası işlem için %50 hematin boyama çözeltisini ve %0,01 amonyaklı suyu veya mavileştirme reaktifini hazırlayın. Hedef probları 40 °C'de 10 dakika boyunca ön ısıtmaya tabi tutun.

DAB kromojen brown A ve brown B hariç tüm RTU tespit kiti reaktiflerini oda sıcaklığına getirin. Bu deneye başlamak için, fırınlanmış doku kesitlerini sık çalkalama ile her seferinde beş dakika olmak üzere iki kez ksilen ile deparafine edin. Sık çalkalama ile her seferinde üç dakika olmak üzere iki kez %100 Ethanol ileydehidre edin.

Beş dakika boyunca havada kurutun ve ardından hidrofobik bariyer kalemi ile doku kesitinin etrafına hidrofobik bir bariyer çizin. Doku kesitlerini, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca pretreat one çözeltisi ile inkübe ederek ön işleme başlatın. Bu işlem, endojen peroksidaz aktivitesini söndürecektir.

Distile su ile durulayın. Ardından, doku kesitlerini ön işlem iki çözeltisiyle 15 dakika inkübe ederek ve 15 dakika boyunca kaynama sıcaklığında tutarak RNA'yı geri kazanın; protein sindirimi için distile su ile iki kez durulayın. Doku kesitlerini ön işlem üç çözeltisiyle işleyin ve hibridizasyon fırınında 40 °C'de 30 dakika inkübe edin.

30 dakikalık inkübasyon tamamlandığında, doku kesitlerini distile su ile iki kez durulayın. Bir sonraki adım, yedi yüksek riskli HPV genotipi olan HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 ve 58'in E6 ve E7 mRNA'larını saptayan bir prob havuzu kullanılarak gerçekleştirilen hedef prob hibridizasyonudur. HPV problarını, ubiquitin C probunu ve bakteriyel gen DAP B probunu üç komşu doku kesitinin üzerine ayrı ayrı ekleyin.

İki saatlik inkübasyonun sonunda, fırında 40 °C'de iki saat boyunca hibridizasyon yapın. Sinyal amplifikasyonu için doku kesitlerini, oda sıcaklığında ikişer dakika süreyle iki kez yıkama tamponu ile durulayın. Doku kesitlerini, hibridizasyon fırınında 40 °C'de 30 dakika boyunca AMP one ön amplifikatör ile inkübe ederek başlayın.

Oda sıcaklığında, her seferinde iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez durulayın. Sinyal amplifikasyonu için sonraki adımlar, doku kesitlerinin belirtilen süre boyunca 40 °C'de aşağıdaki reaktiflerle inkübe edilmesini ve ardından oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez durulanmasını içerir. Her inkübasyonun ardından, 15 dakika boyunca AMP two background reducer uygulayın.

AMP üç amplifikatörünü 30 dakika ve AMP dört etiketli probunu 15 dakika boyunca uygulayın. Ardından, yıkama tamponu ile iki kez duruladıktan sonra doku kesitlerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca amp beş ile inkübe edin, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca amp altı ile inkübe edin ve bunu yıkama tamponu ile iki kez daha durulayarak tamamlayın. Sinyal tespiti için, eşit hacimlerde kahverengi A ve kahverengi B karıştırılarak bire bir DAB karışımı hazırlayın. Çözeltiyi lamlara ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.

Saf su ile iki kez durulayın. Doku kesitlerini, oda sıcaklığında iki dakika boyunca %50'lik hematoksilen çözeltisi ile karşı boyayın ve ardından dokular mor renkte kalana kadar lamlar berraklaşana dek saf su ile durulayın. Lamları beş kez %0,01'lik amonyaklı suya daldırın ve ardından beş kez saf suya daldırın. Doku kesitlerini sırasıyla %70 etanol, %100 etanol ve %100 etanol içerisinde ikişer dakika inkübe ederek ve ardından beş dakika boyunca ksilen içerisinde tutarakle dehidre edin.

Son olarak, lamları ksilen bazlı montaj medyası ile kapatın. İşte baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomun boyanmış formaline fikse edilmiş parafin gömülü kesitlerinden örnek görüntüler. HPV pozitif vakada, HR HPV probları özellikle tümör hücrelerinde güçlü noktasal sinyaller tespit etti. Bu, 40x büyütmedeki iç resimde açıkça görülmektedir.

Pozitif kontrol UBC probu, hem tümör hücrelerinde hem de stromal hücrelerde çok sayıda noktasal sitoplazmik sinyal saptadı. Negatif kontrol DAP B probu HPV negatif vakasında temiz bir arka plan sergilerken, hem HR HPV probu hem de DAP B probu hiçbir sinyal saptamadığında UBC probu tarafından güçlü sinyaller saptandı. HPV durumunun belirlenmesi için yapılan skorlama, her vaka için her üç lamın incelenmesini içerir.

Negatif kontrol DAP B lamındaki boyama düzeyi, eşik değer olarak kullanılır; HPV pozitifliği, DAP B lamındaki sinyalin üzerinde noktasal, sitoplazmik ve/veya nükleer boyanmanın varlığı ile tanımlanır. RNA scope analizi, doğru şekilde yürütüldüğü takdirde sekiz saat içinde tamamlanabilir. Her adımda, tüm doku alanını kaplayacak yeterli miktarda solüsyon eklemek kritik önem taşır.

Adımlar arasında lamları hafifçe vurarak kalıntı tampon çözeltiyi uzaklaştırmak, ancak lamların beyaz kaldığından emin olmak da önemlidir. Rescope teknolojisi, herhangi bir türün herhangi bir hücresinde veya dokusunda temel olarak tüm RNA biyobelirteçlerinin saptanması için uygulanabilir.