Name: Için RNAscope In situ Head transkriptional Aktif Human Papilloma Virüs Tespiti ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Öğrenin, RNAscope tekniğiyle baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomlarında yüksek riskli HPV E6/E7 mRNA'sının hassas tespitini. Bu yöntem, formalin sabitlenmiş parafin gömülü doku kesitlerinde tek molekül görselleştirme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

YL NIH hibe (R43/44CA122444) ve DOD BRCP hibe (W81XWH-06-1-0682) tarafından kısmen destekleniyor.

1.. Örnek, Ekipman ve Reaktif Hazırlama <ol><li> Oda sıcaklığında (25 ° C) &#39;de 16-32 saat boyunca taze,% 10 nötr tamponlu formalin içinde çözmek ve parafin içine gömmek, 3-4 mm kalınlığında bloklar halinde doku numune kesin. FFPE bloklardan 5 ± 1 mikron kalınlığında bölüme FFPE kesilmiş, slaytlar ve kuru hava ile ilgili bölümleri monte. Not: Slaytlar kadar 3 ay boyunca kurutulması altında oda sıcaklığında saklanabilir. Monte edilmiş doku slaytlar önce RNAscope tahlile 1 saat boyunca 60 ° C &#39;de fazla bir kuru pişmiş olmalıdır. </li><li> 40 ° C hibridizasyon Fırın getirmek Nem Kontrol Tepsi bir nemlendirme Kağıt yerleştirin. Tamamen ıslak Nemlendirme Kağıt 50 ml dH 2 O ekleyin. Kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca prewarm için Fırın içine kapalı Kaset yerleştirin. </li><li> Kazanmak 700 ml 1x önceden işleyin dH 2 O. 10x Tedavi öncesi Çözüm sulandırarak 2 Çözüm (10 nl, pH 6 sitrat tamponu) 1x önceden işleyin 2 kaynamaya Çözüm ve mai ısıtınaşırı kaynama engellerken, 100-104 ° C arasındaki sıcaklık ntain. </li><li> DH 2 O&#39;da prewarmed 50x Wash Buffer seyreltilmesi ile 3 L 1x Yıkama Tamponu (0.1x SSC) Yap </li><li> Bir davlumbaz altında Parafinden arındırmadan boyunca 2 x 200 ml iksilen ve% 100 EtOH &#39;ın 2 x 200 ml hazırlayın. </li><li> Davlumbaz altında post-boyama için% 50 Hematoksilen boyama çözüm ve bluing reaktifi (0.01% amonyaklı su) hazırlayın. </li><li> Bir davlumbaz altında dehidrasyon için ksilen ve 200 ml, 200 ml% 70 ve 2 x 200 ml% 100 EtOH hazırlayın. </li><li> 10 dakika boyunca 40 ° C&#39;de ve DAB Kromojen Brown ve-A-B Brown dışında, RTU Amp1, Amp2, AMP3, Amp4, Amp 5-Brown ve Amp6-Brown da dahil olmak üzere, oda sıcaklığına kadar RTU Algılama Kit reaktif getirmek ön ısıtılması Hedef probları . </li></ol> 2. RNAscope Deneyi Parafinden arındırma lamların ve Dehidrasyon Pişirmeden sonra, sık çalkalama ile 2 x 5 dakika boyunca ksilen içinde doku bölümleri deparaffinize ve kurutmaksık çalkalama ile 2 x 3 dakika boyunca% 100 EtOH içinde. Hava 5 dakika boyunca, kuru ve hidrofobik bir bariyer kalem ile doku bölümü etrafında bir hidrofobik bariyer çizin. Önmuameleler <ol><li> Ön muamele 1 ile doku bölümleri inkübe endojen peroksidaz aktivitesi söndürülmesi, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile, dH 2 O. durulama </li><li> DH 2 O. iki kere yıkayın, RNA alma için 15 dakika süre ile, kaynama sıcaklığında muhafaza edilen bir ön işlem 2 ile doku bölümleri inkübe </li><li> DH 2 O. iki kere yıkayın, HybEZ fırında protein sindirimi için 40 ° C&#39;de 30 dakika boyunca ön-işleme tabi 3 ile doku bölümleri inkübe </li></ol> Hedef Probe Hibridizasyon Hedef prob HPV-HR 7 pool şunlardır: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, ve 58,. Ayrı olarak, üç bitişik doku bölümleri üzerine HPV sondalar, Ubiquitin C (UBC) ve bakteriyel gen probları dapB ekleyin. 2 için fırın içinde 40 ° C&#39;de hibridizasyonhr, daha sonra oda sıcaklığında 2 x 2 dk için 1x Yıkama tampon maddesi içinde yıkayın. Sinyal Amplifikasyon <ol><li> 40 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 40 ° C, AMP3 (amplifikatör) ile 15 dakika boyunca 40 ° C, Amp2 (arka plan azaltıcı), 30 dakika boyunca Amp1 (amplifikatör) ile doku bölümleri inkübe ve Amp4 (etiket prob), 15 dakika boyunca HybEZ bir fırında 40 ° C&#39;de. Her bir hibridizasyon aşamasından sonra, oda sıcaklığında 2 x 2 dk için 1x Yıkama tampon maddesi içinde yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, 30 dakika ve Amp6 için Amp5 doku bölümleri ile inkübe edin. Her inkubasyon aşamasından sonra, oda sıcaklığında 2 x 2 dk için 1x Yıkama tampon maddesi içinde yıkayın. </li></ol> Sinyal Algılama Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Brown ve-A-B Brown eşit hacim karıştırılarak 01:01 DAB karışımı ile inkübe doku bölümleri, dH 2 O. içinde iki kez yıkayın Counterstaining <pdoku mor kalırken slaytlar berrak kadar class = &quot;jove_content&quot;&gt; oda sıcaklığında 2 dakika için% 50 Hematoksilen çözeltisi ile Leke doku bölümleri, dH 2 O ile durulayın. Dip 5x için dH 2 O% 0,01 amonyak slaytlar ve dH 2 O. 5 dips ile takip Slayt Montaj 2 dakika her biri için,% 70,% 100 ve% 100 EtOH içinde doku bölümleri dihidrat, ksilen, 5 dakika için, ksilen bazlı montaj ortamı ile monte edilir.

<ol><li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li>
<li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li>
<li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).</li>
<li>Smeets, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+algorithm+for+reliable+detection+of+human+papillomavirus+in+paraffin+embedded+head+and+neck+cancer+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen.</a> Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+regulation+of+NRG1+isoform+expression+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity.</a> J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).</li>
<li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).</li>
<li>Payne, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+circulating+tumour+cell+detection+using+multiplex+RNA+in+situ+hybridisation+predicts+progression-free+survival+in+metastatic+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients.</a> Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).</li>
<li>Bordeaux, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+situ+measurement+of+estrogen+receptor+mRNA+predicts+response+to+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen.</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantitative+RNA+in+situ+hybridization+for+resolution+of+equivocal+and+heterogeneous+ERBB2+%28HER2%29+status+in+invasive+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma.</a> J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).</li>
<li>Tubbs, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li>
<li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-risk+human+papillomavirus+E6%2FE7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal%2Fhypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%3A+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status%5BTitle%5D)+AND+%22Mod.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li>
<li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li>
<li>Schache AG,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+novel+diagnostic+standard+in+HPV-positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).</li>
<li>Mehrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillary+Squamous+Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck%3A+Clinicopathologic+and+Molecular+Features+With+Special+Reference+to+Human+Papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol.+Jun%22%5BJournal%5D)">Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus.</a> Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).</li>
<li>Jordan, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li>
<li>Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHammond%2C+ME+%22Arch.+Pathol.+Lab.+Med%22">Arch. Pathol. Lab. Med</a>. 134 (7), 48-72 (2010).</li>
</ol>

Tüm yazarlar İleri Hücre Tanı, Inc stoklar tarafından ve kendi istihdam edilmektedir

RNAscope HPV tahlil HPV-ilişkili baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom in situ E6/E7 mRNA doğrudan görselleştirme izin verdi. RNAscope tahlil rutin sabit tümör dokusu ile tamamen uyumludur ve histopatolojik korelasyon için doku morfolojisi (Şekil 2) korur. Geleneksel yöntemlere göre CISH RNAscope deneyinin önemli bir avantajı, özel olarak arka plan gürültüsünü (Şekiller 2C ve 2F) amplifiye olmayan hibridizasyon sinyalleri (Şekil 2B ve 2E) kuvvetlendirir olmasıdır. Uygulamada, RNAscope HPV deney prosedürü 8 saat içinde tamamlanabilir ya da uygun bir iki gün boyunca bölünmüş. RNAscope HPV tahlil referans yöntem olarak 16 Mah-PCR kullanarak% 97 duyarlılık ve% 93 özgüllük göstererek, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom 12-16 HPV durumunu belirlemek için kullanılır olmuştur. Konvansiyonel chrHR-HPV DNA omogenic ISH yüksek düzeyde spesifik olduğunu fakat% 80 ~ 12 bir hassasiyete sahiptir. Hücresel vekil işaretleyici p16 immünhistokimyasal (İHK) boyama mükemmel hassasiyet gösterir ama özellikle nonoropharyngeal baş ve boyun kanserlerinde 15 yanlış pozitif sonuçlar 15,18 oluşturabilir. HPV E6/E7 mRNA tespiti için Mah-PCR mevcut &quot;altın standart&quot; yöntem, yalnızca araştırma laboratuvarında kendi kullanımını sınırlar, en iyi sonuçlar için taze dondurulmuş doku gerektirir ve teknik olarak karmaşık. Buna ek olarak, bu imkansız histopatoloji ile HR-HPV E6/E7 mRNA ifadesini ilişkili kolaylaştırır RNA ekstraksiyonu gerektirir. RNAscope tahlil başarısı için çok önemli bir faktör vardır. İlk olarak, en iyi sonuçlar için, dokular ASCO / CAP kılavuzlar 19 göre 16-32 saat boyunca oda sıcaklığında, taze,% 10 nötr tamponlu formalin içine sabitlenmiş olmalıdır. O etkinleştirmek beri İkincisi, HybEZ fırın tavsiye edilirprob hibridizasyon ve sinyal amplifikasyon adımlar için sıcaklık ve nem kontrol optimal s. Üçüncü olarak, her adımda daha önce fazla kalıntı tamponlar çıkaracaklardır, fakat yine de bu adımların sırasında herhangi bir kurutma bölümü doku tutmak önemlidir. Burada anlatılan manuel RNAscope prosedür tamamen ticari bir slayt oto boyama sisteminde 10 otomatik olmuştur. Bu büyük ölçüde deney koşulları ve klinik patoloji laboratuvarlarında tasarrufu değerli el emeği standardizasyon kolaylaştırmak gerekir. Buna ek olarak, özel bir görüntü analiz yazılımı otomatik olarak öznelliği ortadan kaldırmak ve puanlama üretilebilirliğe geliştirmek için yardımcı olmalıdır dijitalize slayt üzerinde hücreleri ve boyama sinyalleri belirlemek için 10 geliştirilmiştir. Özet olarak, RNAscope HPV deney FFPE dokularda in situ HR-HPV E6/E7 mRNA varlığını algılar. Klinik patoloji laborant tanıdık bir iş akışı vardoku bölümlerinde bu doğrudan görselleştirme izin vererek Tories. Bu (FFPE) doku örneklerini inceleyerek için ideal bir platform sunuyor ve kolayca teşhis patoloji laboratuarları tarafından kabul edilebilir.

Dünya çapında 1 tüm kanserlerin yaklaşık% 5 için yüksek riskli insan papilloma virüsü (HR-HPV) enfeksiyonu hesaplar. HPV-ilişkili orofarengeal kanser insidansı, özellikle erkekler arasında, son yıllarda artmıştır. HPV-pozitif orofaringeal skuamöz hücreli karsinom (OPSCC) muhtemelen önümüzdeki 20 yılda 2 Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde tüm baş ve boyun kanserlerinin çoğunluğu teşkil edecektir. HPV neden Orofarengeal skuamöz hücreli karsinom olumlu sağkalım ile ilişkili, ve tümör HPV durum hayatta kalma 3 için güçlü ve bağımsız bir prognostik faktör olduğunu vardır. Viral onkojenler E6 ve E7 transkripsiyonel aktivasyonu için kanıt klinik olarak ilgili HPV 4 varlığı için altın standardı olarak düşünülmektedir. Bununla birlikte, RT-PCR tekniği ile taze tümör dokusundan E6/E7 mRNA&#39;nın tespiti rutin klinik uygulamada pratik değildir ve araştırma laboratuarlarında ile sınırlı olmuştur. Son zamanlarda, biz havE formalin fikse parafine gömülü doku örneklerinden (FFPE) 5-10 tek RNA molekülü duyarlılık ile bireysel hücrelerin multipleks algılamayı sağlayan RNAscope adında yeni bir RNA ISH teknolojisini geliştirdi. Biz tek bir molekül tespiti 5 delil üç satır sağladı. İlk olarak, RNAscope prob tasarımı ve sinyal yükseltme sistemi HeLa ve SK-BR-3 hücre hatlarında tek kopya HER2 genomik DNA hedeflerinin tespiti izin verdi. HER2 genomik DNA sinyalleri ile karşılaştırıldığında İkincisi, HeLa hücrelerinde mRNA HER2 sinyal noktaların floresan yoğunluklarının dağıtım nokta başına bir molekülü ile tutarlıdır. Üçüncü olarak, hücre başına HER2 mRNA sinyali noktaların sayısı daha tek bir molekülün tespitini destekleyen, yakından bir çözüm-tabanlı ölçüm testiyle tahmin HER2 mRNA kopya sayısını eşleşti. Ayrıca, floresan mikroskopi veya aydınlık alan mikroskobu hematoksilen ile DAPI ile çekirdeklerin counterstaining WH, bireysel çekirdeklerin görselleştirme sağlarich da bir tek hücre bazında 10 tespiti ve RNA hedeflerin ölçümü sağlar. Rutin klinik örneklerinde in situ gen ifadesini analiz yeteneği, özellikle de FFPE doku bölümünde dayalı tahliller 10,11, RNAscope tanısal patoloji için umut verici bir platform yapar. Bu genotip özgü sondaların bir havuzu kullanılarak yedi yüksek riskli HPV genotipi (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, ve 58) bir E6/E7 mRNA&#39;yı tespit etmek için bir RNAscope tabanlı bir HPV analiz geliştirdik. OPSCC Bizim son çalışmalar RNAscope HPV tahlil FFPE dokularda 12-17 HPV statüsünün belirlenmesinde son derece duyarlı ve özgül olduğunu ve aynı zamanda OPSCC 12,16 prognozu bilgilendirir göstermiştir. RNAscope teknolojinin ilkesi, daha önce 5 tarif edilmiştir. Burada, tam RNAscope deney protokolü tarif ve FFPE tümör doku kesitlerinde in HR-HPV saptanmasında kullanımını göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Fırın, Tepsi ve Raf</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhis</td><td>310011, 310012, 310014</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 FFPE Reaktif Kiti - Kahverengi</td><td>310035</td><td></td><td>HPV</td></tr><tr><td>16, 18, 31, 33, 35, 52 ve E6/E7 mRNA için RNAscope HPV-HR7 Probu, E6/E7 mRNA</td><td>Gelişmiş Hücre Teşhis</td><td>312351</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hidrofobik Bariyer Kalem</td><td>Vektör Laboratuvarı</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>%100 EtOH</td><td>Amerikan Master Tech Bilimsel</td><td>ALREAGAL</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Gill'in Hematoksilen I</td><td>Amerikan Master Tech Bilimsel</td><td>HXGHE1LT</td><td></td></tr><tr><td>Amonyak hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320145-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-F</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak Plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-300-49SHP</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma Fırını</td><td></td><td></td><td>60 ° C'de sıcaklık tutabilir; 1 & derece; C</td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td></td><td></td><td>40 & plusmn'de sıcaklık tutabilir; 1 & derece; Ç</td></tr></tbody></table>

için rnascope<em&gt; in situ</em&gt; head transkriptional aktif human papilloma virüs tespiti ve boyun skuamöz hücre karsinomu

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Onkojenik HPV tespiti için &#39;altın standart&#39; tümör dokusunda transkripsiyonel aktif yüksek riskli HPV gösteri. Bununla birlikte, sayısal ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile E6/E7 mRNA&#39;nın tespiti morfolojik korelasyon için tümör dokusu bağlam kritik yok eder ve rutin klinik pratikte kabul edilmesi zor olmuştur RNA ekstraksiyonu gerektirir. In situ melezleme teknolojisi RNAscope bizim yeni geliştirilmiş bir RNA, tek bir molekül duyarlılık ve herhangi bir biyomarker RNA in situ analizi, son derece hassas ve spesifik sağlayan tek bir hücre çözünürlük, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) dokuda RNA doğrudan görselleştirme izin verir rutin klinik örneklerde. RNAscope HPV deney genotip özgü problar bir havuz kullanılarak E6/E7 yedi yüksek riskli HPV genotiplerinin mRNA&#39;nın (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, ve 58) tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu mükemmel hassasiyet göstermiştirve Mah-PCR ile E6/E7 mRNA tespit geçerli &#39;altın standart&#39; yöntemiyle karşı seçicilik. RNAscope tarafından belirlenen HPV durumu orofaringeal kanser hastalarında klinik sonucun güçlü prognostik olduğunu.

RNAscope HPV tahlil akışı RNAscope deneyi (Şekil 1) IHC benzer bir yüksek iş akışı vardır. Önmuameleler, melezleme, sinyal büyütmesi, ve algılama: Bu dört ana adımdan oluşur. Bu yüksek sadakat sinyal büyütmeye 5 sağlayan benzersiz bir prob tasarım stratejisini kullanır. RNAscope HPV tahlilde, yedi HR-HPV prob setleri her yaban turbu peroksidazı (HRP) bağlanmış olan aynı sinyal amplifikasyon sistemi tarafından tanınan, bir araya getirilmiştir. HRP ile oluşturulan kahverengi çökeltiler, hali hazırda standart parlak alan mikroskopi ile görüntülenmiştir olabilir alt-tabaka olarak DAB kullanılarak kromojenik reaksiyon katalize gibi özel hibridizasyon sinyalleri tespit edilir. HPV saptanması için Örnek lekeleme Şekil 2 baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom lekeli FFPE kesimlerinden örnek görüntüleri gösterir. HPV-pozitif halinde (Şekil l&#39;deure 2A), HR-HPV problar, spesifik olarak tümör hücrelerinin güçlü noktalı sinyalleri tespit edildi. UBC prob tümör hücreleri ve stromal hücreleri (Şekil 2B) hem de çok noktalı sitoplazmik sinyal tespit edildi. Bakteriyel gen probu dapB temiz bir arka plan (Şekil 2C) gösterdi. Güçlü sinyaller UBC probu (Şekil 2E) kullanılarak tespit edilmiştir, oysa HPV-negatif durumda, HR-HPV prob ve dapB prob, hem herhangi bir sinyal (Şekil 2 ve 2F) tespit edildi. Bu deneyde, UBC arka plan sinyalleri için negatif kontrol olarak RNA, doku ve kalite dapB değerlendirmek için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. HPV statüsünün belirlenmesi için puanlama, her durum için her üç slayt incelenmesini gerektirir. Negatif kontrol slayt (dapB) slayt üzerinde boyama düzeyi kesim olarak kullanılır: HPV pozitif noktalı sitoplazmik ve / veya dabpB slaytta sinyal üzerinde olan nükleer boyama varlığı ile tanımlanır. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Şekil 1. RNAscope tahlil iş akışı RNAscope testinin Akış Şeması. İllüstrasyon. RNAscope tahlil 4 büyük adım, ön terbiye, hedef prob hibridizasyon, sinyal amplifikasyon ve sinyal algılama içerir. Tüm tahlil işlemi 8 saat içinde tamamlanabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> Şekil 2. RNAscope lekeli slaytlar Örnek görüntüler. HR-HPV, UBC (pozitif kontrol) ve dapB için sondalar ile boyandı FFPE bölümler (negatif kontrol)İki HNSCC olgulardan. ac. HPV-pozitif vaka. Tümör hücrelerinde A, HR-HPV E6/E7 mRNA ifadesi. Ankastre, noktasal sinyalleri göstermek için 40X büyütme. B ve C). DF) HPV-negatif durumda. D) sırasıyla, HPV E6/E7 mRNA için hiçbir boyama pozitif UBC boyanma (B) ve dapB (C için negatif) gösteren komşu doku kesitleri , dapB negatif kontrol (F) benzer. E) UBC pozitif boyanma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a>

Baş ve boyun tümör dokusunda yüksek riskli HPV varlığı olumlu sonuçlar ile ilişkilidir. RNAscope denilen in situ hibridizasyon tekniği son zamanlarda geliştirilen RNA FFPE doku kesitlerinde HPV E6/E7 mRNA doğrudan görselleştirme sağlar.

Için RNAscope<em&gt; In situ</em&gt; Head transkriptional Aktif Human Papilloma Virüs Tespiti ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, RNA scope adı verilen yeni bir RNA in situ hibridizasyon tekniği kullanarak, baş ve boyun kanserlerindeki tümör hücrelerinde yüksek riskli HPVE altı, E yedi mRNA'nın hassas ve spesifik tespitini gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle lamlar üzerindeki doku örneklerinin, prob erişimini sağlamak amacıyla hücreleri permeabilize etmek için ısı ve proteaz ile ön işlemden geçirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda lamlar, E altı E yedi mRNA'ya hibridize olan ve yedi yüksek riskli HPV tipini hedefleyen bir HPV prob kokteyli ile inkübe edilir.Ardından, önce ön amplifikatör (pre amplifier) ve ardından HRP konjuge etiket probu ile sırasıyla hibridizasyon yaparak hibridizasyon sinyallerini amplifiye edin. Sinyal daha sonra bir kromojen ile tespit edilir ve standart parlak alan mikroskobunda görüntülenir; elde edilen sonuçlar, HPV pozitif tümörlerde HPVE altı E yedi mRNA sinyallerinin noktasal kahverengi çökelmeler şeklinde göründüğünü, ancak HPV negatif tümörlerde görülmediğini gösterir. RNAscope analizi, insitü hibridizasyon için yeni ve tescilli bir prob tasarım stratejisi kullanır.Tek molekül görselleştirmesine ve hedef kantifikasyonuna olanak tanır. Bu teknoloji, biyobelirteç araştırmaları ve tanısal asit geliştirme alanındaki araştırmacıların, makro dizi (macro race) veya yeni nesil dizileme çalışmaları aracılığıyla keşfedilen herhangi bir RNA biyobelirtecini tanımlamalarına ve doğrulamalarına zemin hazırlar. IHC veya FISH konusunda deneyimi olan çoğu bilim insanı bu yöntemi hızlıca öğrenebilir.Şimdi, tekniğe hakim olmanıza yardımcı olmak için temel adımların vurgulandığı tüm iş akışının bir gösterimini sunacağım. Bu RNA in situ hibridizasyon tekniği ile analiz edilecek doku örnekleri formalinle tespit edilmiş ve parafine gömülmüştür; beş artı veya eksi bir mikron kalınlığındaki kesitler, analizden bir saat önce lamlara monte edilmiştir.Slaytları 60 °C'deki kuru bir fırında pişirin. Slaytlar pişerken hibridizasyon fırınını hazırlayın. Sıcaklığı 40 °C'ye getirin ve nem kontrol tepsisine nemlendirici bir kağıt yerleştirin.Nemlendirme kağıdını tamamen ıslatmak için üzerine 50 milliliters saf su ekleyin. Kapalı tepsiyi, kullanmadan önce en az 30 dakika ön ısıtma yapmak için fırına yerleştirin. 10 x ön işlem çözeltisini saf su ile seyrelterek 700 milliliters bir x ön işlem 2 çözeltisi hazırlayın.1x ön işlem 2 çözeltisini kaynama noktasına kadar ısıtın ve sıcaklığı 100 ile 104 degrees Celsius arasında tutun. Bu sırada aşırı kaynamayı önleyin. Çeker ocak altında, önceden ısıtılmış 50x yıkama tamponunu distile su ile seyrelterek üç litre 1x yıkama tamponu hazırlayın.Deparafinalizasyon ve su giderme işlemleri için ksilenleri, %70 etanolü ve %100 etanolü hazırlayın. Boyama sonrası işlem için %50 hematin boyama çözeltisini ve %0,01 amonyaklı suyu veya mavileştirme reaktifini hazırlayın. Hedef probları 40 °C'de 10 dakika boyunca ön ısıtmaya tabi tutun.DAB kromojen brown A ve brown B hariç tüm RTU tespit kiti reaktiflerini oda sıcaklığına getirin. Bu deneye başlamak için, fırınlanmış doku kesitlerini sık çalkalama ile her seferinde beş dakika olmak üzere iki kez ksilen ile deparafine edin. Sık çalkalama ile her seferinde üç dakika olmak üzere iki kez %100 Ethanol ileydehidre edin.Beş dakika boyunca havada kurutun ve ardından hidrofobik bariyer kalemi ile doku kesitinin etrafına hidrofobik bir bariyer çizin. Doku kesitlerini, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca pretreat one çözeltisi ile inkübe ederek ön işleme başlatın. Bu işlem, endojen peroksidaz aktivitesini söndürecektir.Distile su ile durulayın. Ardından, doku kesitlerini ön işlem iki çözeltisiyle 15 dakika inkübe ederek ve 15 dakika boyunca kaynama sıcaklığında tutarak RNA'yı geri kazanın; protein sindirimi için distile su ile iki kez durulayın. Doku kesitlerini ön işlem üç çözeltisiyle işleyin ve hibridizasyon fırınında 40 °C'de 30 dakika inkübe edin.30 dakikalık inkübasyon tamamlandığında, doku kesitlerini distile su ile iki kez durulayın. Bir sonraki adım, yedi yüksek riskli HPV genotipi olan HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 ve 58'in E6 ve E7 mRNA'larını saptayan bir prob havuzu kullanılarak gerçekleştirilen hedef prob hibridizasyonudur. HPV problarını, ubiquitin C probunu ve bakteriyel gen DAP B probunu üç komşu doku kesitinin üzerine ayrı ayrı ekleyin.İki saatlik inkübasyonun sonunda, fırında 40 °C'de iki saat boyunca hibridizasyon yapın. Sinyal amplifikasyonu için doku kesitlerini, oda sıcaklığında ikişer dakika süreyle iki kez yıkama tamponu ile durulayın. Doku kesitlerini, hibridizasyon fırınında 40 °C'de 30 dakika boyunca AMP one ön amplifikatör ile inkübe ederek başlayın.Oda sıcaklığında, her seferinde iki dakika boyunca yıkama tamponu ile iki kez durulayın. Sinyal amplifikasyonu için sonraki adımlar, doku kesitlerinin belirtilen süre boyunca 40 °C'de aşağıdaki reaktiflerle inkübe edilmesini ve ardından oda sıcaklığında yıkama tamponu ile iki kez durulanmasını içerir. Her inkübasyonun ardından, 15 dakika boyunca AMP two background reducer uygulayın.AMP üç amplifikatörünü 30 dakika ve AMP dört etiketli probunu 15 dakika boyunca uygulayın. Ardından, yıkama tamponu ile iki kez duruladıktan sonra doku kesitlerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca amp beş ile inkübe edin, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca amp altı ile inkübe edin ve bunu yıkama tamponu ile iki kez daha durulayarak tamamlayın. Sinyal tespiti için, eşit hacimlerde kahverengi A ve kahverengi B karıştırılarak bire bir DAB karışımı hazırlayın. Çözeltiyi lamlara ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.Saf su ile iki kez durulayın. Doku kesitlerini, oda sıcaklığında iki dakika boyunca %50'lik hematoksilen çözeltisi ile karşı boyayın ve ardından dokular mor renkte kalana kadar lamlar berraklaşana dek saf su ile durulayın. Lamları beş kez %0,01'lik amonyaklı suya daldırın ve ardından beş kez saf suya daldırın. Doku kesitlerini sırasıyla %70 etanol, %100 etanol ve %100 etanol içerisinde ikişer dakika inkübe ederek ve ardından beş dakika boyunca ksilen içerisinde tutarakle dehidre edin.Son olarak, lamları ksilen bazlı montaj medyası ile kapatın. İşte baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomun boyanmış formaline fikse edilmiş parafin gömülü kesitlerinden örnek görüntüler. HPV pozitif vakada, HR HPV probları özellikle tümör hücrelerinde güçlü noktasal sinyaller tespit etti. Bu, 40x büyütmedeki iç resimde açıkça görülmektedir.Pozitif kontrol UBC probu, hem tümör hücrelerinde hem de stromal hücrelerde çok sayıda noktasal sitoplazmik sinyal saptadı. Negatif kontrol DAP B probu HPV negatif vakasında temiz bir arka plan sergilerken, hem HR HPV probu hem de DAP B probu hiçbir sinyal saptamadığında UBC probu tarafından güçlü sinyaller saptandı. HPV durumunun belirlenmesi için yapılan skorlama, her vaka için her üç lamın incelenmesini içerir.Negatif kontrol DAP B lamındaki boyama düzeyi, eşik değer olarak kullanılır; HPV pozitifliği, DAP B lamındaki sinyalin üzerinde noktasal, sitoplazmik ve/veya nükleer boyanmanın varlığı ile tanımlanır. RNA scope analizi, doğru şekilde yürütüldüğü takdirde sekiz saat içinde tamamlanabilir. Her adımda, tüm doku alanını kaplayacak yeterli miktarda solüsyon eklemek kritik önem taşır.Adımlar arasında lamları hafifçe vurarak kalıntı tampon çözeltiyi uzaklaştırmak, ancak lamların beyaz kaldığından emin olmak da önemlidir. Rescope teknolojisi, herhangi bir türün herhangi bir hücresinde veya dokusunda temel olarak tüm RNA biyobelirteçlerinin saptanması için uygulanabilir.

rnascope-for-situ-detection-transcriptionally-active-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

İnsan papillomaviri gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlerin T-hücresi epitoplarının karakterizasyonu, dolaşımdaki T hücresi sayısının sınırlı olması nedeniyle zorludur. Nadir T hücrelerinin, çok az sayıdaki hücreden başlanarak izole edildiği ve karakterize edildiği bir yöntem açıklanmıştır.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

Bu videoda, mRNA problarının belirli hedef mRNA'ya hibritleştirilmesini içeren sıralı bir hibridizasyon stratejisi açıklanmaktadır. Prob hibridizasyonunu takiben, histolojik numunelerin RNA-CISH sırasında sinyal-gürültü oranının azaltılması yoluyla çözünürlüğü artırmak için sinyal amplifikasyonu gerçekleştirilir.

RNA In Situ Hibridizasyonda Prob Hibridizasyonu ve Sinyal Amplifikasyonu: Doku Kesitlerinde Spesifik RNA Dizilerini Tespit Etmek İçin Bir Teknik

Bu video, RNA kromojenik in situ hibridizasyonulama sırasında sinyal algılama protokolünü sunar. Bu teknik, sağlam bir doku örneğinde aktif bir onkojenik enfeksiyonu görsel olarak teşhis etmek için kullanılabilir.

RNA CISH Sinyal Tespiti: Sağlam Doku Örneklerinde RNA In Situ Hibridizasyon Sırasında Kromojenik Sinyalleri Tespit Etme Tekniği

İnsan genomunun% 8'ini işgal insan endojen retrovirüsleri (herv), kıt kodlama kapasitelerini ama yüz bin uzun terminal tekrarları (LSY) korur. Özel bir Affymetrix mikroarray bireysel herv odağı ifade belirlemek için tasarlanmıştır ve gelecekteki klinik çalışmalar için kavramının bir kanıtı olarak prostat kanseri dokularda kullanıldı.

Prostat Kanserinde Biyomarker Discovery Uygulama: Bireysel herv Lokusları İfade Mikroarray tabanlı Kimlik

Multiparametre floresan immünohistokimyası, tümör mikro ortamındaki bağışık hücre popülasyonlarının sayısını, göreceli dağılımını ve lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu el yazması oropharyngeal kanserdeki T hücresi alt popülasyonlarını analiz etmek için bu tekniği tanımlamaktadır.

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

Düzenleme çoğu yetişkin organizmalarda tümörleri ile ilgili genler Homeobox genleri bulunmaktadır. Biz onların karşılaştırmalı ifade immunohistokimyasal ve gerçek zamanlı PCR analizleri, normal ve inflamatuar burun mucosae ve onlara olası tanı ve tedavi hedefleri kullanmak için sinonasal neoplazmlar tarafından araştırdık.

Sinonasal karsinom ve koku nöroblastomlar için iki olası moleküler işaretleyici olarak OTX1 ve OTX2 tanımlama

Burada, elektromanyetik olarak yönlendirilen transtorasik iğne erişimi yoluyla boya işaretlemesi kullanılarak akciğer nodülü lokalizasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Burada tarif edilen teknik, perioperatif dönemde nodül lokalizasyonunu optimize etmek ve minimal invaziv göğüs cerrahisi yapılırken başarılı rezeksiyon için gerçekleştirilebilir.

Minimal İnvaziv Göğüs Cerrahisinde Elektromanyetik Navigasyon Transtorasik Nodül Lokalizasyonu

Burada bir orthotopic fare modeli baş ve boyun Skuamöz Hücre Karsinomu geliştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem mevcut. Tümör nekroz, zavallı farklılaşma, nodal metastaz ve bağışıklık infiltrasyon gibi hastalığın klinik histopatolojik özellikler göstermektedir. Tümörü taşıyan fareler disfaji, çene deplasman ve kilo kaybı gibi klinik belirtiler geliştirmek.

Skuamöz Hücre Karsinomu Hücre Tümörü bağışıklık profil oluşturma için fareler ve tedaviye yanıt değerlendirme intramucosal aşı

Human papilloma virüsü (HPV) RNA kromojenik in situ hibridizasyon tümörlerde aktif insan papilloma virüsü Enfeksiyon algılama için altın standartlarından biri olarak kabul edilir. HPV E6-E7 mRNA ifadesinin lokalizasyonu ve sinyalinin seminiceliksel değerlendirilmesi ile görselleştirilmesini sağlar.

Kromojenik In situ hybridization HPV Ile Ilgili baş ve boyun kanseri tanısı için bir araç ss

RNA saç tokaları ve döngüler, sekansa özgü astarların yokluğunda ters transkripsiyon (RT) için astar işlevi görebilir ve üst üste gelen antisense transkriptlerin incelenmesine müdahale eder. İplik spesifik RNA'yı tanımlayabilen bir teknik geliştirdik ve bunu HIV-1 antisense protein ASP'yi incelemek için kullandık.

İplik Spesifik RT-PCR ile Hastalarda İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transkriptlerinin Saptanması

Öğrenin, RNAscope tekniğiyle baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomlarında yüksek riskli HPV E6/E7 mRNA'sının hassas tespitini. Bu yöntem, formalin sabitlenmiş parafin gömülü doku kesitlerinde tek molekül görselleştirme sağlar.

Için RNAscope

Daha fazla video keşfet