Name: Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Öğrenin yetişkin insan beyni perisitlerini Sox2 ve Ascl1 ile retroviral vektörler kullanarak kaynaklı nöronlara dönüştürme yöntemini. Bu doğrudan soy hattı dönüşümü beyin onarımı için yeni stratejiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu protokolün geliştirilmesi sırasında onu girişi için Dr Magdalena Götz minnettarız. Biz cömertçe Sox2 kodlama dizisi ile bize sağlamak için Dr Marius WERNIG (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederim. Biz de virüs üretimi için Dr Alexandra Lepier için çok müteşekkiriz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 BE) ve BMBF (01GN1009A) BB, ve Bavyera Bilimler Devlet Bakanlığı, Araştırma ve MK ve BBCs için Sanatları uluslu SYSTHER-fon alınan hibe ile desteklenmiştir INREMOS Sanal Enstitüsü (Eğitim ve Araştırma Alman ve Sloven Federal Bakanlıklar) ve DFG (SFB 824).

1.. İzolasyon ve Yetişkin İnsan Beyin Hücrelerinin ekimi Insan dokusu ile ilgili deneyler araştırma amacıyla insan malzeme kullanımı ilgili tüm devlet ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak yapılmalıdır. Mevcut protokol LMU Münih Tıp Fakültesi etik kurulu ve tüm hastalardan yazılı onam tarafından onayı doğrultusunda geliştirilmiştir. Insan yetişkin beyin korteks hazırlanması kültürlerinin Bu protokol, temporal lob epilepsi ya da diğer derin non-travmatik, habis olmayan lezyonlardan muzdarip her iki cinsten hasta örneği kullanılarak kurulmuştur. Bu nedenle beyin lezyona erişim kanalı özel olarak oluşan cerrahi odadan elde edilen ve doku sağlıklı kabul edilir. Hastaların yaş aralığı 19-70 yıl idi. <ol><li> Isı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu büyütme ortamı ekleyerek hazırlamakGlutamax DMEM yüksek glikoz (FCS)% 20 FCS bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir. 500 ml büyüme ortamı, toplam 5 ml penisilin / streptomisin ekleyin. Bu ve uygun bir laminer akış kaputu steril kültür koşulları gerektiren sonraki tüm adımları uygulayın. </li><li> CaCI2 ve işleme kadar buz üzerinde HEPES (10 mM nihai konsantrasyon) de dahil olmak üzere MgCl2 (HBSS) ortamı ile Hanks dengeli tuz çözeltisi içinde cerrahi odadan elde edilen yetişkin insan beyin biyopsisi tutun. Kısa sürede işleme başlayın. </li><li> 65 mm petri içine doku transferi ve iki steril tek kullanımlık neşter kullanarak küçük parçalar halinde kıyma, tek hücre içine ayrışma başlatmak için. Enzimatik sindirme için, 15 ml konik bir tüp içinde 3-6 ml TrypLE kullanımı ve bir su banyosu içerisinde 37 ° C&#39;de 15-30 dakika inkübe edilir. </li><li> Ayrışmasını kolaylaştırmak için önceden ısıtılmış büyüme ortamı 1 hacim ekleyin ve hafifçe ilk kullanarak yukarı ve aşağı doku parçaları içeren çözüm çiğnemekHücre süspansiyonunun homojen olana dek, bir cam Pasteur pipet kullanılarak ve ardından, 5 ml kullanılıp atılabilir pipet. Tipik olarak, çoğunlukla beyaz madde aşağıdakilerden oluşan bir miktar doku parçaları, süspansiyon içinde kalır. </li><li> 5 dakika boyunca 157 x g Spin ve büyüme ortamı içinde uygun miktarda (kaplanmamış T75 kültür şişesi başına 10 mL) &#39;de pelletini. Büyüklüğü 5-10 mm çaplı bir biyopsi için, bir T75 kültür şişesi kullanın ve daha büyük örneklerin durumunda, bu çıkarım. </li><li> % 5 CO2 ve% 5 O2 ile 37 ° C inkübatör içine hücreleri yerleştirin. </li><li> Hücreler birleşik hale gelmiş kadar her 3-4 günde bir ortamın yarısı değiştirin. Bu genellikle (pasaj 0 [P0] olarak da adlandırılır), iki haftaya kadar sürer. </li></ol> Yetişkin İnsan Beyin Hücreleri 2.. In vitro Genişleme ve Karakterizasyonu <ol><li> In vitro genişlemesi: <ol><li> Kültür ortamı aspire ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkamak, oda t tutulduemperature, 3 mi TrypLE eklemeden önce. </li><li> Hücrelerin en müstakil kadar 5-10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Yavaşça hücrelerin kaldırma kolaylaştırmak için şişeler dokunun; büyüme ortamının 3 hacimleri ilave edildikten sonra, 15 ml konik bir tüp içine aktarmak ve hücreler, 5 dakika boyunca 157 x g hızında aşağı spin ve büyüme ortamının uygun miktarda hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Geçiş yeni T75 hücre kültürü şişelerine uygun verim için 1:03 oranında hücreler. Not: Biz azaltılmış yeniden programlama verimlilik herhangi bir belirti olmadan P5 kadar bu hücreler pasajlanır var. Kültür endotelyal hücrelerin önemli bir kısmını (CD34 ekspresyonu ile değerlendirilen) içeren P0 da, takip eden geçitler de bu sayı ihmal edilebilir hale gelir. </li></ol></li><li> Yetişkin insan beyin kültürleri karakterizasyonu: <ol><li> İmmünositokimya: <ol><li> Poli-D-lizin kaplı cam kapak üzerine hücreler, tohum ~ 60,000 hücre karakterizasyonu için, 500 ul taze büyüme mediu fişleri24 oyuklu doku kültür plakaları içinde m ve% 5 CO2 ve% 5 O2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kültürlenmiş insan beyin hücreleri immünositokimyasal analizi için orta kaldırmak ve 1 ml PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit 500 ul ekleyerek, hücreler. </li><li> Cam kapak, uygun bir nemli bir boyama odası içine sığar aktarın ve 80 ul PBS ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 3 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.5 Triton X-100 içeren bloke eder. </li><li> Aynı çözelti içinde seyreltilmiş primer antikorların (seyreltme faktörler spesifik reaktifler ve ekipman tablo bakınız) ilave edilir ve oda sıcaklığında, 4 ° C ya da 1 saat sonra bir gece boyunca inkübe edilir. Not: kültür bu aşamada, hücrelerin önemli bir ama farklı fraksiyon (PDGFRβ) platelet türevli büyüme faktörü reseptörü β için immünoreaktif olan, farklılaşma 146 (CD146), kondroitin sülfat NG2 proteo kümeglukanıdır ve düz kas aktini (SMA), mikrovasküler ilişkili perisitlerden karakteristik yani belirteçleri. Yalnızca küçük bir bölümü (&lt;% 1) astroglial belirteçleri glial fibriller asidik protein (GFAP) ve S100β ifade eder. Ayrıca, bu aşamada kültür nöronal işaretleyici βIII-tubulin ifade eden bir hücre yoksun olmalıdır. Farklı markerlerinin co-etiketlenmesi için çok sayıda birincil antikor kombinasyonları kullanılır. Glial, nöronal, endotel ve perisit markerlerinin sentezlenmesi başka bir onay da, ters transkripsiyon ve (bu protokol açıklanmayan) kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile elde edilebilir. </li><li> Ile inkübe edildikten sonra, birincil antikorlar, 1 ml PBS ile üç kez yıkama ve boyama çözeltisine (uygun seyreltiler olarak) karşılık gelen ikincil antikor ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. Hücreler 3x PBS ile yıkayın. Gerekirse, monte edilmeden önce oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DAPI ile boyama dahilsıcaklığı. </li><li> Montaj orta solmaya kullanın ve Epifloresans bir mikroskop ya da bir konfokal mikroskop kullanılarak kapak fişleri analiz. </li></ol></li><li> Flow sitometri: <ol><li> Akış sitometrisi kullanılarak yüzey işaretleyici ifade analizi için, kaplanmamış T25 veya T75 hücre kültürü şişelerinde hücreleri konfluansa kadar büyür. </li><li> PBS +% 0.5 BSA içeren boyama çözeltisi içinde tekrar süspansiyon ve daha önce tarif edildiği gibi TrypLE kullanarak hücreleri çıkarın. Renk reaksiyonu başına, boyama çözeltisinin 100 ul 100,000-200,000 hücreler tekrar süspansiyon haline getirin. (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, ilgili izotop kontrol antikorları) kullanılan antikor başına tek boyama reaksiyonları hazırlayın. </li><li> Doğrudan hücre süspansiyonu içine (seyreltmeleri spesifik reaktifler ve ekipman için tabloya bakınız) her bir boyama çözeltisine florokrom-konjuge antikor ekleyin ve karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 500 ul PBS ile hücreler üç defa yıkamak ve her arasında aşağı doğru döndürün5 dakika boyunca 157 x g yıkama aşaması. </li><li> FACS tüplere bir hücre süzgecinden (70 um) üzerinden 0.5-1 mi boyama solüsyonu ve transfer hücrelerde hücre pelletini. Işığa maruz örnek koruyun. </li><li> Önce FACS alet yerleştirerek için Vortex örnekleri. </li><li> Canlı hücrelerin analiz ve enkaz ve hücre agrega, FSC-A kapısı ve SSC-A dışlamak için. Hücre duplets özellikle FSC-A ve FSC-W tarafından Geçitli. Ilgili florokroma konjüge eş izotipli antikor kontrolü ile kapıları belirlenen hücre yüzeyi işaretçileri için doğru yolluk koşullarını belirlemek. Daha sonra antikor-bağlı hücrelerin oranını belirler. </li></ol></li></ol></li></ol> Flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile perisit türetilen Hücreler 3. Zenginleştirme <ol><li> FACS 70 mikron meme kullanılarak sıralama ile önce transdüksiyonu ile (büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş) perisit hücre popülasyonu arındırın. C ile bir arada CD34-APC kullanınD140b-PE ve CD146-FITC perisitlerden seçmek için. CD34-negatif, CD140b-ve CD146 pozitif hücreler için sıralar. </li><li> 24 oyuklu doku kültürü plakalarında kayma poli-D-lizin kaplı cam kapak üzerine büyüme ortamı ve plaka içindeki kriteri hücrelerini toplamak ve% 5 CO2 ve% 5 O2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Sıralama 48 saat sonra, taze büyüme ortamı ile orta yerine Protokol ve 4&#39;te tarif edildiği gibi transdüksiyonunu gerçekleştirmek. </li></ol> 4. Retrovirütik perisit türetilmiş Hücrelerinin İletimi ve İsteyerek Nöronlar içine yeniden programlanması Not: retroviral parçacıkları taşıma yerel biyogüvenlik kurallarına bakın. Almanya&#39;da burada istihdam retrovirüslerde kullanımı biyogüvenlik düzeyi 2 gerektirir. Retroviral parçacıkların üretim protokolüne 6&#39;ya bakın. Tekrar programlanması için kullanılan retroviral yapılar için Karow ve arkadaşlarına bakınız. (2012). Retrovirüsler, VSV-G (vesiküler stomatit virüsü-gliko psödotiplendirilmiş idiprotein) 5. Üretim için Gavrilescu ark 6 başvurun. <ol><li> Önce poli-D-lizin kaplı cam kapak üzerine retroviral transdüksiyon tohum ~ 60000 hücreleri 24 saat 24 oyuklu doku kültürü plakaları içinde 500 ul taze büyüme ortamı içinde kayar ve% 5 CO2 ve% 5 O2, 37 ° C&#39;de inkübe . </li><li> Ertesi gün, 500 ul taze, önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı ile büyüme ortamının yerini ve retroviral parçacıklar (kontrol için pCAG-IRES-DsRed, özellikle de laboratuarda protokol kurulması esnasında), pCAG-ascl1 içeren ilgili konsantre edildi yüzer 1 ul ekle pCAG-Sox2 IRES-GFP, IRES-DsRed. </li><li> Bir gün sonra, hücreler, viral partiküller dahil olmak üzere orta kaldırmak ve taze 1 ml eklemek Glutamax ile 49 ml DMEM yüksek glükoz ve 1 ml B27 serum içermeyen ek oluşan, B27-farklılaştırma ortamı önceden ısıtılmış. 5 37 ° C &#39;de kültür içinde hücreleri korumak% CO 2 ve ins olgun olarak tekrarlayan orta değişiklikler zararlı olmak gibi orta değiştirmeden 4-8 hafta boyunca% 5 O 2. </li></ol> İmmünositokimya tarafından Kaynaklı Nöronlar 5. Karakterizasyonu <ol><li> Kalıt aktarımlı hücrelerin hücre kimliğini belirlemek için, nöronal bir fenotip elde edilmesini göstermek için, özellikle, belirli reaktiflerin tabloya bakınız, antikorlar ve bunların ilgili dilüsyonları için (örneğin, BIII-tubulin, MAP2 ve Neun gibi nöronal antijenlere karşı immünsitokimya gerçekleştirmek ve ekipmanlar; 2.2.1 belirtildiği gibi) aynı prosedürü uygulayın. </li><li> E14 fare beyin kortekslerinden elde edilen nöronlarla PdiNs, ko-kültür, bu hücrelerin olgunlaşmasını geliştirmek için. Bu amaçla, serebral korteks incelemek ve bir ateş cilalı cam Pasteur pipeti ile mekanik olarak doku ayırmak. Sox2 ve ascl1 kodlayan yeniden iletimi ile aşağıdaki perisit türetilmiş hücreler, 2-3 hafta kültürlerine 10.000-50.000 sıçangil nöronlar eklemetroviruses ve kültürü devam etmektedir. Iletilmiş hücreler canlı epifluoresan veya GFP ve DsRed için İmmunositokimyayı şu ya da muhabir (GFP ve DsRed) ifadesi ile kemirgen nöronların ayırt edilebilir. </li><li> , Kemirgen nöronlar tarafından PdiNs üzerine sinapsların oluşumunu değerlendirmek veziküler glutamat taşıyıcısı 1 (vGluT1) olarak veziküler nörotransmiter reseptörlerine karşı İmmunositokimyayı gerçekleştirmek için. </li><li> Elektriksel özelliklerine (aksiyon potansiyelleri üreten yani yeteneği) ve patch-kelepçe elektrofizyoloji tarafından fonksiyonel sinapsların kurulması için transduced hücreleri inceleyin. Prosedürün ayrıntıları için bkz Heinrich ve ark. (2011). </li></ol>

<ol><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+water+deficit%2C+ABA%2C+and+provenances+in+Picea+asperata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li>
<li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).</li>
<li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
<li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li>
<li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neuronal+cells%3A+how+to+make+and+define+a+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li>
<li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li>
<li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li>
<li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable%2C+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol in vitro genişlemesi ve zenginleştirme perisit türetilen hücrelerin yetişkin insan serebral korteksinden izole takip eden ve nörojenik transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından INS içine sonraki dönüşüm ve Sox2 Ascl1 faktörleri açıklamaktadır. Anılan protokol, sonuçta yetişkin beyninin in vivo ortam haline doğrudan dönüşüm yaklaşımı çevirmek için akılda hedefi ile, potansiyel olarak da glia nöronların içine beyin-yerleşik hücrelerinin soy-dönüşüm ve çalışma vitro sistemde ...

Da farklılaşma potansiyel bir bolluk ile donatılmış bulunmaktadır uyarılmış pluripotent kök hücreleri içine somatik hücreler (iPSCs), yeniden programlamayı aksine, doğrudan yeniden programlama başka içine belirli bir hücre tipi düz dönüşüm için amaçlanmıştır. Hastalık modelleme ve potansiyel hücre bazlı terapiler bağlamında kendi uygulama ile ilgili olarak, her ikisi de yeniden programlama yaklaşımlar belirli avantajları ve dezavantajları vardır. IPSCs (i) yeniden programlama hücrelerin neredeyse sonsuz bir kaynak içerir; (Ii) genetik mühendisliği için izin verir; (Iii) a, neredeyse sınırsız farklılaşma potansiyele sahip endows. Bu hücreler, hücre bazlı terapiler için kullanılacak olan, ancak, iPSCs önemli dezavantajları farklılaşmamış hücreleri (in vivo teratoma formasyonu) tümöre neden olması ve ex vivo yetiştirme ve müteakip transplantasyon için ihtiyaç risk taşımaktadır. Buna karşılık, direkt soy yeniden programlama arzu edilen hücrelerin düşük verim tarafından kısıtlanırBaşlangıç ​​nüfusun hedef hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişkili, ancak soy programlanabilir hücre nakli 1,2 üzerinde herhangi bir tümör oluşturucu bir risk sergilemek için görünür avantajına sahiptir ki; ayrıca, doğrudan yeniden programlama da örneğin, bu hücrelerin bu şekilde nakli ihtiyacını ortadan kaldırmak, gerekli olacaktır organ içinde, in situ sağlanabilir. Bu düşünceyle, bizim laboratuvar nörodejeneratif hastalıkların hücre bazlı terapiler yönelik yeni bir yaklaşım olarak ins içine soy-yeniden programlanması beyin yerleşik hücrelerinin olasılığını izlemiştir. Potansiyel olarak soy tekrar programlanması için, hücresel hedefler olarak kabul edilebilir Brain yerleşik hücreler farklı macroglia türleri (astrositler, NG2 hücreleri ve oligodendrosit), mikroglia ve mikrovasküler ilişkili hücrelerin (endotelyal hücreler ve perisitler) içerir. Biz kapsamlı serebral kor astroglial in vitro yeniden programlama potansiyel inceledikErken doğum sonrası farelerin 3-5, tex. Yetişkin insan beyninde doğrudan soy-yeniden programlama için benzer uygun hücre kaynakları arayışı içinde, başarıyla INS ve perisitlerin sergi işaretlerinden içine programlanabilir bir hücre popülasyonu karşılaştı. Burada genişletmek ve in vitro olarak bu hücreleri zenginleştirmek ve son olarak da başarılı bir şekilde içine (% 25-30 aralığında), bu in vitro genişletilmiş hücreleri önemli bir kısmını yeniden programlamak için, yetişkin insan beyni biyopsilerinden bu hücrelerin hasat için nasıl bir protokol açıklar INS. Tekrar-iki transkripsiyon faktörleri, Sox2 ve ascl1 eşzamanlı retrovirüs aracılı ko-ifade ile elde edilebilir. Bu PdiNs tekrarlayan aksiyon potansiyeli ateşleme yeteneğini kazanmak ve sinir ağları içine entegre kabiliyetlerini gösteren diğer nöronlar gibi sinaptik hedeflere hizmet bulundu. Bizim protokol ins içine yetişkin insan beyni perisitler izolasyon ve soy dönüşüm için basit bir prosedürü sağlar. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>anti-CD140b-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558821</td><td>1:100</td></tr><tr><td>anti-CD146-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141FT</td><td>1:100</td></tr><tr><td>anti-CD13-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MVA1270A488T</td><td>kullanın 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD34-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>560940</td><td>kullanın</td></tr><tr><td>;</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>3169S,</td><td>1:200</td></tr><tr><td>anti-CD146</td>, Abcam, <td>Ab75769</td>, <td>1:400</td><td></td></tr><tr><td>anti-NG2</td>, <td>Millipore</td><td>AB5320</td>, <td>1:400</td></tr><tr><td>anti-SMA</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td>, <td>1:400</td></tr><tr><td>anti-&beta kullanır; III-tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-MAP2</td> kullanır; <td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>1:200</td></tr><tr><td>anti-GFAP</td> kullanır; <td>Sigma-Aldrich</td><td>G3893</td><td>kullanır; 1:600</td></tr><tr><td>anti-GFP</td> kullanır; <td>Aves Labs</td><td>GFP 10-20</td><td>kullanır; 1:1.000</td></tr><tr><td>anti-RFP</td>; <td>Chromotek</td><td>5F8</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anti-S100 ve beta kullanır;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td>, <td>1:300</td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>kullanır, MAB377</td>, <td>1:200</td></tr><tr><td>anti-GABA</td> kullanır, <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2052</td>, <td>1:500</td></tr><tr><td>anti-Calretinin</td><td>Millipore</td> kullanır, <td>AB5054</td>, <td>1:500</td></tr><tr><td>anti-vGluT1</td><td>SYstems</td> kullanır <td>135511</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Sıçan IgG1 izotip kontrolü kullanır, FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>11-4301-81</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Sıçan IgG1 izotip kontrolü PE</td><td>AbD Serotec</td><td>12-4301-81</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Sıçan IgG1 izotip kontrolü kullanın APC</td><td>AbD Serotec</td><td>17-4301-81</td><td>1:100</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965</td><td></td></tr><tr><td>B27 serumsuz takviye</td><td>Invitrogen</td> <td>kullanın</td><td></td>17504044</tr><tr><td>fetal buzağı serumu</td><td>Invitrogen</td><td>10106-169</td>, <td>56 ° C'de inkübasyon yoluyla ısı inaktivasyonu gerçekleştirir; 30 dakika boyunca C</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi)</td><td></td><td>CaCl</td><td></td></tr><tr><td><2 / sub> ve MgCl 2 / sub> (D-PBS, 1x) olmadan Dulbecco'nun PBS'si (D-PBS, 1x)</td><td>İnvitrojen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin hidrobromür (PDL)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehit)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 ve asal;, 6-Diamidin-2-fenilindol) dilaktat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>042M4005</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/ Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen yuvarlak tabanlı borular ve nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeç kapaklı polistiren yuvarlak tabanlı tüpler&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>Orange Scientific</td><td>5530305</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kültür şişeleri</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 kültür şişeleri</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık pipetler 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pastör pipetler (150 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50251</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller 12 mm çapında</td><td>Menzel</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi tek kullanımlık neşterler&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>5518083</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü yemekleri&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış başlığı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml ve 50 ml tüpler için adaptörlü santrifüj ve açılır rotor</td><td>Hettich Lab Technology</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>Flow sitometri hücre sıralayıcısı: FACSDiva yazılımı ile FACSAria l&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humified hücre kültürü inkübatörü</td><td>Eppendorf Galaxy 170R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wather banyosu 37 &°C; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSFlow kılıf sıvısı&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Epifloresan mikroskobu BX61</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kaynaklı nöronlar içine yetişkin İnsan beyninin perisit türetilmiş hücreler lineage yeniden programlama

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Uyarılan nöronların (INS) içine non-nöronal hücrelerin doğrudan soy-yeniden programlama nörogenezi altında yatan moleküler mekanizmaları içgörü sağlamak ve in vitro modelleme veya hastalıklı beyin tamiri için yeni stratejiler etkinleştirebilirsiniz. Ins içine doğrudan dönüşüm için müsait belirlenmesi beyin-yerleşik olmayan nöronal hücre tipleri hasarlı beyin dokusu içinde, yani yerinde böyle bir yaklaşımı başlatılması için izin verebilir. İşte bu öncül yerine yetişkin insan beyninden türetilen hücrelerin teşhis etmek için bir girişimde gelişmiş bir protokol açıklar. Bu protokol şunları içerir:, yetişkin insan beyin biyopsileri elde serebral korteks, insan hücreleri (1) kültürlenmesini; (2) in vitro (yaklaşık 2-4 hafta gerektiren) genleşme ve immunositokimya ile kültür karakterizasyonu ve akış sitometrisi; (3) anti-PDGF reseptörü β-ve anti-CD146 antikorları kullanılarak (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre ile zenginleştirme;(4), nörojenik transkripsiyonuna retrovirüs aracılı iletim ve Sox2 ascl1 faktörleri; (5) ve son olarak, bağışıklık kimyası edilen perisit türetilmiş kaynaklı nöron (PdiNs) &#39;nin karakterizasyonu (8 hafta için 14 gün retroviral iletimini sonra). Bu aşamada, ins yama kelepçe kayıt kendi elektriksel özellikleri için tanınacak. Bu protokol, fonksiyonel insan ins içine beyin yerleşik perisitler in vitro soy dönüşüm için son derece tekrarlanabilir prosedürü sağlar.

Bu protokol sonra başarılı bir şekilde insan yetişkin beyin korteksi bir örnekten bir kültür oluşturulması ilk sonuç kültürün hücre bileşimin tanımlanması oluşur. Hücre tipi özel proteinler için İmmünositokimya farklı hastalar (Şekil 1A) numune türetilen kültürleri arasında heterojenite önemli derecede ortaya koymaktadır. Akış sitometrisi ile belirlenir olarak (ortalama olarak ~% 75, 30 ile en fazla% 99 kadar) PDGFRβ eksprese eden hücrelerin önemli bir kısmı her zaman vardır; Böyle CD146, NG2 ve CD13 gi...

Doğrudan soy-yeniden programlama için beyin-yerleşik hücreleri hedef beyin onarımı için yeni perspektifler sunuyor. Burada yetişkin insan serebral korteks beyin-yerleşik perisitlerden için zenginleştirilmiş kültürleri hazırlamak ve Sox2 ve Ascl1 faktörleri transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından uyarılan nöronların bu dönüştürmek için nasıl bir protokol açıklar.

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan beyin parazitlerinden türetilen hücreleri indüklenmiş nöronlara dönüştürmektir. Bu işlem, cerrahi beyin örneklerinden parazit türevli hücrelerin izole edilmesi ve kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, genişletme aşamasını takiben, in vitro hücreler parazitik belirteçler için immün olarak işaretlenir; bu da hücrelerin karakterizasyonuna ve nihayetinde daha fazla zenginleştirilmesine olanak tanır.Ardından, hücreleri doğrudan indüklenmiş nöronlara dönüştürmek amacıyla, parazit kaynaklı hücreler nöronal kader belirleyicilerini kodlayan retroviral vektörlerle transduksiyon işlemine tabi tutulur. Nöronal belirteç beta three tubulin için yapılan immün boyama sonucunda, soyu yeniden programlanmış parazit kaynaklı hücrelerden elde edilen indüklenmiş nöronlar gözlemlenir. Bu yaklaşımın, fibroblastların yeniden programlanması veya embriyonik kök hücrelerin nöronlara farklılaştırılması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, beynin endojen hücrelerini hedeflemesidir; bu durum, nihayetinde hücre nakline gerek kalmadan beyin içerisinde doğrudan soy dönüşümünün önünü açabilir.Aşağıdaki protokol, LMU Münih tıp fakültesi etik kurulunun onayı ve taz

lineage-reprogramming-pericyte-derived-cells-adult-human-brain-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler...

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Bu video, genetik olarak değiştirilmiş hematopoietik progenitör hücrelerin nöronal kök hücrelere doğrudan yeniden programlanmasını göstermektedir. Hematopoietik progenitör hücreler tarafından eksprese edilen transkripsiyon faktörleri, dönüşümlerini kolaylaştıran bir dizi moleküler olayı tetikler. İndüklenmiş nöronal kök hücreleri seçmek ve büyütmek için daha spesifik ortamlar kullanılır.

Hematopoetik Progenitör Hücrelerin Nöral Kök Hücrelere Doğrudan Yeniden Programlanması

Bu video, indüklenmiş nöral progenitör hücreleri (iNPC'ler) özel ortamlar kullanarak nöronlara ve astrositlere ayırma sürecini göstermektedir.

İndüklenmiş Nöral Progenitör Hücrelerin Astrositlere Farklılaşması

Video, yetişkin insan dermal fibroblastlarından (aHDF'ler) nöron oluşumunu göstermektedir. AHHDF'ler, nöronal transkripsiyon faktörleri ve kısa firkete RNA'ları (shRNA'lar) için genler taşıyan bir lentiviral vektör kullanılarak yeniden programlanır. ShRNA'lar, bir nöronal transkripsiyonel baskılayıcının ekspresyonunu inhibe eder ve nöronal transkripsiyon faktörleri, aHDF'leri nöronlara farklılaştırmak için genleri aktive eder. Bu yeniden programlanmış aHDF'ler, olgun nöronlar oluşturmak için...

İnsan Dermal Fibroblast Hücrelerini Yeniden Programlayarak Nöronlar Üretmek

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Canlı görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücresel davranışlarını incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, hızlandırılmış video-ayrıntılı bir inceleme, birincil sinir kök hücreleri farklı nöronlar ve glia lineage ilerleme sırasında yürürlüğe giren aşamaları sağlayan mikroskobu Primer serebral korteks hücre için bir protokol açıklayın.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

Sinirsel nüfus tarafından hızlandırılmış video mikroskobu esaslı bilgisayar yazılımı Post-processing takip izlemek için sağlam bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem canlı görüntüleme deneyler sırasında seçili bir popülasyondaki biyolojik olayları tanımlamak için güçlü bir araç temsil eder.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Doğrudan nöronal yeniden programlama başlangıç somatik hücre çağı korumak neurons oluşturur. Burada, indüklenen nöronlar dermal fibroblastlar yetişkin insan bağış elde oluşturmak için tek bir vektör tabanlı yöntemi açıklanmaktadır.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Protokol, çevresel kan mononükleer hücrelerin yeniden programlanması ile sinirsel kök hücrelerini Sendai virüs enfeksiyonu, dopaminerjik nöronlar içine inscs farklılaşma, tek taraflı-lesioned içine da öncüleri transplantasyon teşvik sunar Parkinson hastalığı fare modelleri ve PD tedavisi için iNSC-türetilen DA öncüleri güvenlik ve etkinliğini değerlendirilmesi.

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

İnsan derisinden türetilmiş fibroblastları indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücrelere (iNPC' ler) yeniden programlamak için bir protokol ve daha sonra indüklenmiş Astrositlere (iAs) farklılaşmalarını açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük miktarlarda iNPC'lerin ve iA'ların hızlı ve tekrarlanabilir üretimine yol açar.

Fibroblastlardan Nöronal Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşüm ve Astrositlere Farklılaşma Kullanarak Nörolojik Hastalıklar için İn vitro Modelleme

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Öğrenin yetişkin insan beyni perisitlerini Sox2 ve Ascl1 ile retroviral vektörler kullanarak kaynaklı nöronlara dönüştürme yöntemini. Bu doğrudan soy hattı dönüşümü beyin onarımı için yeni stratejiler sunar.

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Daha fazla video keşfet